一种从文昌鱼中筛选的具有抗菌活性的多肽的制作方法

1.本发明属于功能性多肽筛选制备技术领域，具体涉及一种从文昌鱼中筛选的具有抗菌活性的多肽。


背景技术：

2.抗菌肽是从昆虫、被囊动物、两栖动物、鸟类、鱼类、哺乳动物、植物乃至人等多种生物体内组织和细胞中提取出的具有一定免疫作用的小分子类物质，抗菌肽又被称做肽抗生素(peptide antibiotics)或抗微生物肽(antimicrobial peptides)。抗菌肽独特的氨基酸组成使得抗菌肽可以和细胞核内大分子如核酸、蛋白质，以及病毒或细菌表面带电荷的结构相结合，进而破坏细胞膜结构或胞内大分子，进而扰乱细胞的正常功能并导致细胞死亡。
3.抗菌肽通常是由较短的氨基酸序列组成的，一般少于100个氨基酸残基。通常认为抗菌肽的抗菌机理是通过改变细胞膜的通透性，比如形成离散的孔道或者破坏细胞膜双分子层，导致细胞内物质流出，进而导致细胞死亡。也有相关研究揭示改变细胞膜的通透性不是抗菌肽唯一的作用机理，许多研究表明抗菌肽转运到细胞内部也可以抑制核酸、蛋白质以及细胞壁组分的合成。此外，一些抗菌肽也能够抑制一些必要的酶的活性。已有的研究表明抗菌肽对革兰氏阴性细菌和革兰氏阳性细菌以及真菌都具有广谱的活性。而且，抗菌肽对包膜病毒、体内外的寄生虫甚至是癌细胞都有可能产生毒性。
4.文昌鱼是文昌鱼属(branchiostoma)动物的总称，又称蛞蝓鱼；分类学上属于脊索动物，文昌鱼纲，文昌鱼目，文昌鱼科。文昌鱼长约50mm，形似小鱼，无头，两端尖细；体侧扁，半透明，脊索贯穿全身。文昌鱼前端有眼点，口藏于口笠内，口笠边缘有38～50条缘膜触手；具背、臀和尾鳍，腹部有1对腹褶。文昌鱼雌雄异体，其生殖腺左右成对排列。在生活习性上，文昌鱼栖息于疏松沙质海底，常钻在沙内，仅露出前端，滤食硅藻及小型浮游生物。文昌鱼在春末夏初繁殖，幼鱼经短暂浮游期后即钻入沙中成长。作为无脊椎动物进化至脊椎动物的过渡类型，文昌鱼也是研究脊索动物演化和系统发育的优良科学实验材料，具重要的科学价值。


技术实现要素：

5.本发明提供一种从文昌鱼中筛选的抗菌肽，该多肽具有良好的抗菌效果，从而弥补现有技术的不足。
6.本发明所提供的多肽ap24，其氨基酸序列如下所示：
7.larlrrlnrglrqqraslraalrag(seq id no:1)
8.为了提高该多肽的耐热性，对多肽ap24进行了改造，改造后的多肽
9.ap24-mod1的氨基酸序列如下：lkrlrrlnrglrqqrkslrkalraglqkklk(seq id no:2)
10.本发明还提供上述抗菌肽在制备抗菌制品中的用途。
11.本发明所提供的抗菌肽对常见的致病菌具有明显的抗菌效果，且改造后的抗菌肽具有更好的耐热稳定性。
附图说明
12.图1：纸片法筛选抗菌肽图；
13.图2：抗菌肽ap24的不同温度处理组的抗菌活性图。
具体实施方式
14.下面通过具体实施例和附图对本发明进行详细的描述。
15.实施例1：抗菌肽的筛选及检测
16.由于抗菌肽基因在通过翻译后加工生成成熟肽之前一般都会带有一段长的前体肽，而在进化关系相近的物种间，抗菌肽的成熟肽部分的序列差别很大，而前体肽的序列相对保守。因此，根据进化关系较近的物种间抗菌肽基因所编码的前体肽的信号肽序列高保守这一特点，选择柄海鞘(styela clava)、玻璃海鞘(ciona intestinalis)、盲鳗(myxineglutinosa)、鲎(horseshoe crab)的抗菌肽前体肽作为检索条件，从文昌鱼数据库中筛选多肽。
17.从文昌鱼数据库中筛选到的与已知抗菌肽的信号肽同源性高的多肽序列，通过商业公司进行多肽的合成，合成的多肽的纯度为95％以上，能够用于生物活性检测。再通过纸片法对大肠杆菌进行抗菌性筛选，最终获得了两条具有明显抗菌性的多肽(图1)。其中一条多肽命名为ap22，其氨基酸序列为rrfskpkhallikklkkrka。而另一条多肽，命名为ap24，其氨基酸序列为larlrrlnrglrqqraslraalrag(seq id no:1)。
18.实施例2：抗菌肽ap24的抗菌性能检测
19.采用常规的稀释法抗菌试验来检测抗菌肽llv的抗菌性能，具体步骤如下：
20.1)菌液制备，将待检测的大肠杆菌k12d31株、大肠杆菌o2株、迟缓爱德华氏菌和革兰氏阳性菌的金黄色葡萄球菌分别接种到lb液体培养基中，在35℃、100rpm条件下培养12h。
21.2)微量稀释法测定
22.取无菌96聚苯乙烯微孔板试管，将抗菌肽ap24溶液依次加入到灭菌的lb培养基中，lb培养基中加入了氯化三苯四氮唑(ttc)有细菌生长者呈红色，无细菌生长者不变色，更有助于试验结果的判定。检测的抗菌肽ap24在lb培养基中的浓度分别为40μg/ml,30μg/ml,20μg/ml,15μg/ml,10μg/ml,8.0μg/ml,4.0μg/ml,3.0μg/ml,2.0μg/ml,1.0μg/ml；同时在培养板上设立细菌生长对照组，以及只加培养基的空白对照孔，然后每孔加入1)中培养的lb菌液，使接种的细菌最终接种量2
×
104个/ml，于35℃培养过夜。
23.与对照孔相比，能显著抑制细菌生长的最高稀释度为终点，该孔的抗菌肽ap24的浓度为抗菌肽对该细菌的mic值。
24.结果表明抗菌肽ap24有明显的广谱抗菌活性，对革兰氏阴性杆菌和革兰氏阳性杆菌都具有抗菌活性(表1)。
25.表1：抗菌肽ap24在35℃条件下对不同菌株的mic表，mic值越小，表明对菌株的抑菌活性越好
[0026][0027]
从上述的结果可看出，本发明所筛选的ap24多肽对革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌都具有抗菌效果。
[0028]
实施例2：ap24的耐热性检测
[0029]
将抗菌肽ap24溶液配制成浓度为8.0μg/ml,分别在50℃、60℃、70℃、80℃、90℃、100℃处理30min后，在35℃条件下检测不同温度处理后的抗菌肽ap24对大肠杆菌的抑菌活性变化；以未处理的抗菌肽ap24在35℃对大肠杆菌k12d31株的mic值作为标准(100％活性)。
[0030]
结果显示，抗菌肽ap24的50℃处理组，其对大肠杆菌k12d31株的抗菌活性只保留了70％；而60℃、70℃、80℃的处理组还保留有一定的活性，但90℃、100℃处理组的活性已很低(图2)；说明抗菌肽ap24的耐热性并不好。
[0031]
实施例3：对抗菌肽ap24进行改造
[0032]
为了提高抗菌肽ap24的耐热性，选择其部分氨基替换为赖氨酸k,同时在5
′
端添加富赖氨酸多肽片段lqkklk；最终确定对2号位、16号位、20号位的丙氨酸改造为赖氨酸k。改造后的多肽的序列为lkrlrrlnrglrqqrkslrkalraglqkklk(seq id no:2)，命名为ap24-mod1。
[0033]
对改造后的抗菌肽ap24-mod1在沸水浴30min后，抑菌活性无明显的变化，1h后抑菌活性变弱(mic,15μg/ml)，4h后仍具有活性。由此可见，改造后的抗菌肽ap24-mod1具有很强的耐高温活性。
[0034]
抗菌肽对血红细胞的溶血活性是衡量其是否对细胞具有毒性的最主要方法，采用如下的步骤验证抗菌肽ap24和抗菌肽ap24-mod1的细胞毒性。
[0035]
将重悬于pbs中的猪红细胞100μl加入96孔板中，再分别加入抗菌肽ap24和抗菌肽ap24-mod1，使各孔中抗菌肽的浓度分别为100μg/ml、50μg/ml、25μg/ml、12.5μg/ml、6.25μg/ml、3.12μg/ml、1.56μg/ml和0.78μg/ml。阳性对照孔加入氨苄青霉素，阴性对照孔加入pbs缓冲液，在35℃孵育1h后，3000rpm离心5min后，从各孔吸取100μl上清到另一96孔板中，550nm波长测定od值，计算溶血百分比＝[(实验孔od值-阴性孔od值)/(阳性孔od值-阴性孔od值)]
×
100
[0036]
结果表明抗菌肽ap24和抗菌肽ap24-mod1对猪红细胞没有溶血活性，表明抗菌肽ap24和抗菌肽ap24-mod1对哺乳动物正常组织细胞不具有显著毒性。