胰岛素-Fc融合蛋白及其应用的制作方法

技术特征：
1.一种胰岛素-fc融合蛋白，其包含第一部分和第二部分，所述第一部分是提供胰岛素活性的胰岛素部分，所述第二部分是具有延长所述第一部分体内半衰期作用的fc部分，所述第一部分与所述第二部分通过共价键相连，所述胰岛素-fc融合蛋白切割后具有胰岛素活性。2.如权利要求1所述的胰岛素-fc融合蛋白，其具有式(i)的结构：x-e1-y-e2-z-l-fc
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(i)，其中，x和z分别是胰岛素的b链和a链，并且如果x是b链，则z是a链；如果x是a链，则z是b链；y为任选的连接肽；y的长度可以为1-100个或更多个氨基酸，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、50、60、70、80、90、100个或以上任意两个数值之间的值；例如y为胰岛素c肽或者其变体或片段；e1和e2中的一个存在或两个都存在，是包含位点特异性蛋白酶切割位点的一段氨基酸；e1和e2的长度可以是1-10个或更多个氨基酸，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸；如果同时存在，e1和e2可被相同或不同的位点特异性蛋白酶切割，例如可被相同的位点特异性蛋白酶切割；如果y存在，则优选地e1和e2两个都存在；如果y不存在，则优选地e1和e2中存在一个；所述位点特异性蛋白酶切割位点可以是kex2和/或弗林(furin)蛋白酶的切割位点，例如是kex2蛋白酶的切割位点；l为连接z与fc的接头，可以是氨基酸片段，也可以是非肽链的化学结构；以及fc是免疫球蛋白的fc区；所述fc可以来自人免疫球蛋白；所述fc区可以是来自igg、iga、igd、ige或igm的fc区；优选地，所述fc区是来自igg的fc区，例如来自igg1、igg2、igg3或igg4的fc区；再优选地，所述fc区是来自igg2的fc区；其中与其来源序列相比，所述fc区可以带有一个或更多个替换、添加和/或缺失，同时仍保留延长半衰期的能力，例如来自人igg的fc区并带有降低或消除与fcγr结合的突变和/或增强与fcrn结合的一个或更多个突变，所述突变可以选自：n297a、g236r/l328r、l234a/l235a、n434a、m252y/s254t/t256e、m428l/n434s、t250r/m428l；所述fc区可以是糖基化的或未糖基化的。3.根据权利要求1或2所述的融合蛋白，其中所述l为多肽片段，优选地，所述l包含选自ala、thr、gly和ser中一个、两个或更多个氨基酸的柔性肽段，更例如一段由g和s构成的柔性肽段；所述柔性肽段的长度可以是2-50个或更多个氨基酸，例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45或50个氨基酸；优选地，所述l包含一个或更多个刚性单元，所述刚性单元包含或主要由刚性氨基酸构成，所述刚性氨基酸包括但不限于v、p、i、k和l；更优选地，所述刚性单元包含一个或更多个pppx1lp(seq id no:125)，其中x1为任意氨基酸；更优选地，所述刚性单元包含一个或更多个x2apppx1lp(seq id no:126)，其中x1为任意氨基酸，x2为k或v。4.根据权利要求3所述的融合蛋白，其中所述刚性单元包含选自以下序列的多肽片段：pppslpspsrlpgpsdtpilpq(seq id no:127)；
pppalpapvrlpgp(seq id no:128)；pppalpavapppalp(seq id no:129)；优选地，所述刚性单元包含选自以下序列的多肽片段：kapppslpspsrlpgpsdtpilpq(seq id no:130)；vapppalpapvrlpgp(seq id no:131)；和vapppalpavapppalp(seq id no:132)。5.根据权利要求1至4所述的融合蛋白，其中所述l包含选自以下序列的多肽片段：其中所述l包含选自以下序列的多肽片段：6.根据权利要求1至5任一项所述的融合蛋白，其中所述胰岛素选自人胰岛素、牛胰岛素或猪胰岛素，优选地是人胰岛素；例如所述胰岛素的a链和b链源自人胰岛素。7.根据权利要求1至6任一项所述的融合蛋白，其中y、e1和e2都存在，或者其中y不存在，e1和e2中存在一个。8.根据权利要求1至7中任一项所述的融合蛋白，其具有选自seq id no:47-72的氨基酸序列。9.一种生产具有增强胰岛素活性和延长半衰期的胰岛素-fc融合蛋白的方法，其包括将权利要求1至8中任一项所述的融合蛋白与能切割所述位点特异性蛋白酶切割位点的位点特异性蛋白酶接触，优选地所述位点特异性蛋白酶是kex2和/或furin蛋白酶。10.一种胰岛素-fc融合蛋白，其是由权利要求9所述的方法得到。11.一种胰岛素-fc融合蛋白，其具有ins-l-fc结构，其中
ins是提供胰岛素活性的胰岛素部分，其包括通过共价键连接的胰岛素a链和b链，但a链和b链位于不同的肽链中；所述共价键优选地是二硫键；l为连接z与fc的接头，可以是氨基酸片段，也可以是非肽链的化学结构；以及fc是免疫球蛋白的fc区；所述fc可以来自人免疫球蛋白；所述fc区可以是来自igg、iga、igd、ige或igm的fc区；优选地，所述fc区是来自igg的fc区，例如来自igg1、igg2、igg3或igg4的fc区；再优选地，所述fc区是来自igg2的fc区；其中与其来源序列相比，所述fc区可以带有一个或更多个替换、添加和/或缺失，同时仍保留延长半衰期的能力，例如来自人igg的fc区并带有降低或消除与fcγr结合的突变和/或增强与fcrn结合的一个或更多个突变，所述突变可以选自：n297a、g236r/l328r、l234a/l235a、n434a、m252y/s254t/t256e、m428l/n434s、t250r/m428l；所述fc区可以是糖基化的或未糖基化的。12.根据权利要求11所述的融合蛋白，其中所述胰岛素选自人胰岛素、牛胰岛素或猪胰岛素，优选地是人胰岛素；例如所述胰岛素的a链和b链源自人胰岛素。13.根据权利要求11或12所述的融合蛋白，其中所述l为多肽片段，优选地，所述l包含选自ala、thr、gly和ser中一个、两个或更多个氨基酸的柔性肽段，更例如一段由g和s构成的柔性肽段；所述柔性肽段的长度可以是2-50个或更多个氨基酸，例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45或50个氨基酸；优选地，所述l包含一个或更多个刚性单元，所述刚性单元包含或主要由刚性氨基酸构成，所述刚性氨基酸包括但不限于v、p、i、k和l；更优选地，所述刚性单元包含一个或更多个pppx1lp(seq id no:125)，其中x1为任意氨基酸；更优选地，所述刚性单元包含一个或更多个x2apppx1lp(seq id no:126)，其中x1为任意氨基酸，x2为k或v。14.根据权利要求13所述的融合蛋白，其中所述刚性单元包含选自以下序列的多肽片段：pppslpspsrlpgpsdtpilpq(seq id no:127)；pppalpapvrlpgp(seq id no:128)；和pppalpavapppalp(seq id no:129)；优选地，所述刚性单元包含选自以下序列的多肽片段：kapppslpspsrlpgpsdtpilpq(seq id no:130)；vapppalpapvrlpgp(seq id no:131)；和vapppalpavapppalp(seq id no:132)。15.根据权利要求11至14任一项所述的融合蛋白，其中所述l包含选自以下序列的多肽片段：
16.编码权利要求1至8中任一项所述融合蛋白的多核苷酸。17.表达胰岛素-fc融合蛋白的细胞，其包含权利要求16所述的多核苷酸，优选地，所述细胞为cho细胞。18.一种生产胰岛素-fc融合蛋白的方法，其包括在表达胰岛素-fc融合蛋白的条件下培养权利要求17所述的细胞；优选地还包括使所述胰岛素-fc融合蛋白与能切割所述位点特异性蛋白酶切割位点的位点特异性蛋白酶相接触，其中所述培养步骤和接触步骤可以同时进行或分开进行。19.一种药物组合物，其包含权利要求1至8中任一项所述的融合蛋白或权利要求10至15中任一项所述的融合蛋白。20.一种降低血糖和/或治疗糖尿病的方法，其包括将权利要求1至8中任一项所述的融合蛋白或者权利要求10至15中任一项所述的融合蛋白施予有此需要的对象，优选地所述糖尿病为i型或ii型糖尿病。

技术总结
本发明提供一种胰岛素与免疫球蛋白Fc区的融合蛋白。具体地，本发明涉及具有延长的体内半衰期和稳定性的胰岛素融合蛋白、包含该融合蛋白的制剂及其制备方法和应用。合蛋白的制剂及其制备方法和应用。合蛋白的制剂及其制备方法和应用。


技术研发人员：王亚里 陈宪 朱鹿燕 周婷婷 莫炜川 刘成亮 郝维维 王淑亚 姜召菊 任子甲 苏鸿声
受保护的技术使用者：江苏晟斯生物制药有限公司
技术研发日：2021.07.19
技术公布日：2022/1/25