构建湖南主栽烟草品种烤后烟叶品种分子标记图谱的引物组及其应用的制作方法

1.本发明涉及烟草品种的鉴定技术领域，具体涉及构建湖南主栽烟草品种烤后烟叶品种分子标记图谱的引物组及其应用。


背景技术：

2.烟叶是烟草行业发展的基础，其等级质量是烟草行业的生命线。烟叶等级质量状况和工业可用性最终体现在卷烟工业对烟叶原料需求及利用价值上，直接影响卷烟质量及品牌发展，影响着整个烟草行业的健康、稳定、可持续发展。烟草分级受多种因素的影响，如生产因素和人为因素。生产因素，如自然因素、生态因素、环境条件等，对烟叶生产影响比较明显，但这些很多是不可控因素。人为因素，如品种选择、栽培管理、烟叶烘烤和鉴定分级等，既是提升烟叶质量的核心基础，也是影响烟叶质量的重要因素。
3.品种代表烟叶的遗传性和种性，是相对稳定的基因基础，也是影响烟叶鉴定分级的关键。品种不同，烟株的株高、叶片数、生育期、烘烤特性等均不同，生产的叶片大小、宽窄、厚度各异，从而导致烟叶的质量不同，因此烟叶品种的真实性是叶组配方稳定的基础，同时也是产品质量和风格稳定的保障。传统收购分级靠眼观、手摸的方法进行等级判断，靠人为定性认识，无法用量进行衡量。烟叶等级评定变得更加复杂，增加了分级、定级的难度和不确定性。现代分子标记技术可以准确有效区分烟草的品种真实性，为烟叶鉴定分级提供可靠的证据。
4.分子标记的基础是dna的获得。在自然条件下，植物叶片离体后dna在核酸酶的作用下缓慢降解，而烘烤过程在一定程度上加快了烟叶dna的降解速率，且对后续pcr反应造成较大影响，因此烤后烟叶dna提取是限制分子标记在烤后烟叶鉴定上应用的主要限制。根据植物的研究对象、研究目的和研究成本等不同，提取基因组dna所应用的方法也不同。目前，植物基因组dna提取方法很多，如十六烷基三甲基溴化铵(ctab)法、十二烷基硫酸钠(sds)法、聚乙烯吡咯烷酮(pvp)法。不同的方法各有优缺点，其中ctab法效果最好，应用也最为广泛。以上方法多用在新鲜植物，dna提取也较为简单。经过烘烤后，烟叶外部形态和内部化学成分都发生了很大变化，尤其是dna大幅度降解。另外，烤后烟叶中的糖类、酚类物质也对dna的提取具有明显的干扰作用，因此烤后烟叶要比新鲜烟叶的dna更难提取。郭兆奎等以wjc法、oard and dronova1、gibco植物dna提取试剂盒、edward、qiagen d neasy plant mini kit、改进ctab法、sds法、改进的酚/仿抽提法8种方法提取烤后烟dna，测定其浓度和纯度，结合叶绿体不编码蛋白序列和35s启动于序列的pcr扩增结果来分析评价提dna的质量，发现以改进的ctab方法和qiagen dneasyplantminikit提取的dna获得的扩增条带最为理想。孙九喆等利用磁珠法提取的初烤烟叶的基因组dna主条带清晰，无明显杂带，纯度较高。轩贝贝等利用柱式植物基因组dna提取试剂盒提取的烤后烟叶dna纯度较高，所采用的商售试剂盒能够较好地将烟叶中的蛋白质、酚类等物质除去，对提取过程中残留的乙醇、三氯甲烷等的去除效果也较好，提取的dna能满足分子标记筛选等后续试验要求。
虽然很多方法都能够提取符合pcr需求的dna，但所有的方法都需要液氮进行研磨，对于液氮购买不方便的单位则受到限制。几乎所有的方法提取材料要求50mg左右，极大限制提取dna的量，相对于多对引物筛选和模板需求较大的情况则不适用。除此之外，试剂盒的价格较贵，一般50次提取试剂盒在400
‑
500元之间，磁珠法提取还需要磁珠架，要求比较高，对于鉴定量较大的烟草企业会大大增加成本投入。
5.分子标记是能反映生物个体或种群间基因组中某种差异的特异性dna片段。通过检测不同品种间差异片段的大小、数量对品种进行区分，就像人类的指纹一样，所以不同品种dna片段多态性也成为指纹图谱。根据产生差异片段的手段及类型的不同，分子标记包括aflp、rflp、scar、ssr和snp等。ssr(simple sequence repeat)分子标记具有多态性高、共显性遗传、技术简便快速、重复性好和数量丰富等优点，已广泛应用于烟草指纹图谱构建和品种区分。刘国祥等利用25对ssr引物对33个晒烟品种进行了遗传多样性分析，并成功构建出33个晒烟品种指纹图谱；徐军等筛选出8对多态性较好的ssr引物，将80份烟草种质完全区分；尹国英等从278对ssr引物中筛选出14对核心引物用于烟草种质资源鉴定，等等。综上，ssr分子标记技术能够有效区分不同的烟草品种，且操作简单。值得注意的是，以上主要利用新鲜烟草叶片为材料进行研究，但是卷烟工业企业使用的是烤后烟叶。烘烤过程中的烟叶dna降解程度如何，烤后烟叶dna能否继续用于分子标记等方面的研究还相对较少。轩贝贝等利用ssr标记分析了9个烤烟品种的遗传多样性。筛选到能将9个烤烟品种进行有效区分ssr引物8对。孙九喆等以卷烟企业常用的11个主要烟草品种初烤烟叶为材料，从24对候选ssr引物对中筛选出5对多态性高、稳定性强的引物对。另一方面，已报到的研究主要集中在对少数栽培品种或种质资源的鉴定，而对多数主栽品种的鉴定研究缺乏，所以对烤烟企业烟叶鉴定分级指导意义不强。综上所述，针对湖南主要栽培烟草品种建立一套基于ssr分子标记技术的检测体系。对于帮助烟草企业对烤后烟叶进行快速、精准、高效的鉴定分级具有重要的意义。


技术实现要素：

6.本发明针对烤烟企业烟叶鉴定分级缺少高效的分级检测方法的缺陷，针对湖南主要栽培烟草品种建立一套基于ssr分子标记技术的检测体系。对于帮助烟草企业对烤后烟叶进行快速、精准、高效的鉴定分级具有重要的意义。
7.本发明的构建湖南主栽烟草品种烤后烟叶品种分子标记图谱的ssr引物如下：
[0008][0009]
这些引物对可以用在在湖南主栽烟草品种烤后烟叶品种鉴定中或分子图谱构件中。所述的湖南主栽烟草品种为湘烟3号、湘烟5号、湘烟6号、湘烟7号、云烟87、云烟97、云烟99、云烟100、云烟203、中烟100原、中烟100、粤烟9、贵烟1号、红花大金元、龙江911、南江3号、nc729、g80或k326。
[0010]
湖南主栽烟草品种烤后烟叶品种分子标记图谱的构建方法，包括如下步骤：
[0011]
(1)、提取烤后烟叶的dna；
[0012]
(2)、以提取的dna为模板，以权利要求的引物组为扩增引物，建立pcr反应体系并进行pcr扩增；
[0013]
(3)将扩增产物进行电泳，根据电泳结果对每个品种的样品dna的扩增结果形成引
物字母编号加扩增条带位置数字的带型编号，即得。
[0014]
优选的，采用ctab法提取烤后烟叶的dna；
[0015]
pcr扩增体系(10μl)为2x m5 taq pcr mix 10μl、p1 0.3μl、p2 0.3μl、dna 2μl(20ng/ul)、dd h2o，7.2μl；扩增程序为：95℃，3min；95℃，30s；53℃，30s；72℃，30s，35个循环；72℃，10min。
[0016]
一种用于鉴别湖南主栽烟草品种烤后烟叶品种的试剂盒，包括上述的引物对。
[0017]
有益效果：
[0018]
本发明针对湖南主要栽培烟草品种建立一套基于ssr分子标记技术的检测体系。对于帮助烟草企业对烤后烟叶进行快速、精准、高效的鉴定分级具有重要的意义。
附图说明
[0019]
附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：
[0020]
图1为sds和试剂盒提取dna及rnase处理后凝胶检测；1为sds提取的dna；2为试剂盒提取的dna；
[0021]
图2为ctab法提取dna过程中加入异丙醇后的絮状dna；
[0022]
图3为ctab法提取不同部位的dna；图3中1，异常烟，杂，上部；2，异常烟，挂灰，中部；3，正常烟，上部；4，正常烟，中部；5，异常烟，青烟，中部；6，b，上部，粉末；
[0023]
图4为利用ssr引物检测dna提取效果；
[0024]
图5为不同退火温度下引物的扩增效果；
[0025]
图6为同一个品种不同引物的扩增图谱；
[0026]
图7为5对主要引物对供试品种品种的多态性分析；图中，1：湘烟3号；2：湘烟5号；3：湘烟6号；4湘烟7号；5：云烟87；6；云烟97；7云烟99；8：云烟100；9：云烟203；10：中烟100(原种)；11：中烟100；12：粤烟97；13：贵烟1号；14：红花大金元；15：龙江911；16：南江3号；17：nc729；18:g80；19:k326；
[0027]
图8为5对辅助引物的多态性分析；
[0028]
图9为部分无多态性引物的图谱；
[0029]
图10为供试烟草鉴定流程图，图10中最左侧框为引物编号，其余框内为不能区分的品种编号；无框的为能够区分的编号。
具体实施方式
[0030]
以下对本发明的优选实施例进行说明，应当理解，此处所描述的优选实施例仅用于说明和解释本发明，并不用于限定本发明。
[0031]
实施例
[0032]
烟草的培养
[0033]
将烟草种子用20％naclo灭菌20min,无菌水冲洗3
‑
4次，0.2％琼脂重悬，铺在固体1/2ms培养基上(2.4g ms盐，3％蔗糖，0.8％琼脂粉，ph值5.8,121℃，灭菌15
‑
20min),封口膜封好，置于培养箱。培养条件是：25℃,12h黑暗，12h光照，培养15
‑
20天，种植于盛有营养土(营养土：蛭石＝1:1)的盆中。10天后，可用于dna的提取。
[0034]
dna的提取
[0035]
(1)称取0.1g～0.3g烟草用剪刀剪碎，放于研钵，并加入适当液氮将其研磨成粉末，迅速转移至2ml离心管中，加入600μl预热65℃且含1％β
‑
巯基乙醇的ctab提取液和6μl 10mg
·
ml
‑1的rnasea，使用漩涡振荡器猛烈震荡1分钟后，在65℃水浴中处理10分钟；(2)加入200μl氯仿:异戊醇(24:1)的混合液，漩涡震荡1分钟，然后在4℃，12000rpm，15分钟；(3)吸取300μl上清液于1.5ml离心管中，加入200μl预冷4℃的异丙醇后，适当上下摇晃；(4)在4℃，12000rpm，离心15分钟，然后去掉上清液，保留底部白色絮状沉淀，加入在4℃条件下预冷的70％乙醇，用力摇晃漂洗白色沉淀；(5)重复(4)步骤一次后，去掉上清液，晾干，加入100μl已灭菌的双蒸水溶解沉淀，
‑
20℃保存。
[0036]
利用1％的琼脂糖凝胶电泳检测基因组dna的质量；利用分光光度计检测每份材料的基因组dna浓度，并将其稀释至20ng
·
ul
‑1，作为ssr的扩增模板。
[0037]
pcr与电泳
[0038]
引物扩增的pcr反应体系(10μl)
[0039][0040]
pcr扩增在eppendorf t100上进行，扩增程序如下：
[0041][0042]
电泳：配制4％的琼脂糖凝胶在：量取160ml电泳缓冲液(1
×
tae)置于250ml锥形瓶内，称量6.4g琼脂糖，用微波炉加热至完全溶解(注：防治凝胶沸腾后益处，沸腾后有大量气泡冒出时及时打开微波炉，停止加热，气泡落下后继续加热)。加入10
‑
15μl eb，混匀，迅速倒入差有两排中孔梳子的制胶槽内。待凝胶完全凝固后(注：凝胶为乳白色)，拔掉梳子，用于电泳。100v的电压下电泳1.5
‑
2小时，等到溴酚蓝跑至凝胶底层，停止电泳。利用凝胶成像系统观察电泳条带，拍照，保存。
[0043]
研究中用到的ssr引物如下：
[0044][0045]
二、实验结果
[0046]
一、烤后烟叶dna的提取方法
[0047]
1、不同方法提取烤后烟叶dna的摸索
[0048]
采用了sds、ctab和试剂盒三总方法提取烤后烟叶的dna，提取效果差异较大。三种方法均能提取dna，且dna条带呈弥散型，用rnase处理和氯仿抽提也不能去除弥散带，说明dna大量降解。试剂盒dna提取方法最为简便，但提取材料不能超过20mg，提取的量很少，主带和弥散带均不明显，且试剂盒偏贵500左右50次。sds方法操作方法较简单，而且杂质偏多，尤其是多糖，提取物呈透明粘稠状，不易吸取。在操作过程中，加入氯仿抽提会产生大量气泡，影响后续操作。提取物电泳显示有明显的的弥散带，但主带不明显。改良的ctab发操作有些复杂，但可处理1g的材料。提取物电泳后显示有很强的条带，主带明显。
[0049]
2、ctab法提取不同类型材料dna的摸索
[0050]
取正常烟上、中、下和青烟的上部和中部叶片及烟叶粉末。6种类型材料在裂解沉淀过程中，加入异丙醇后都能出现絮状沉淀(图2)。电泳结果显示不同类型的材料都可能提出dna，但提取的效果差异比较大。1的主带清晰，明显，但低分子量的降解dna较多2提取的浓度最高，主带部位也很亮。3和5的主带清晰，但总体的dna量偏少。4条带很亮，但主带部位
不清晰。6的效果最差，主带不明显，总体dna量也少。1
‑
6的胶孔中都有荧光，说明提取的dna还存在杂质没有可能是处理的样品太多，杂质过多，没有完全清除(图3)。粉碎机研磨成分后，虽然减少了研磨工作量，但如果粉碎机研磨后清理不彻底会造成污染，影响结果，所以不建议用粉碎机。另一方面，粉末(6)的提取效果也是最差的，可能是粉碎后样品在储存过程中加速了dna的降解。
[0051]
3、pcr检测ctab法提取的dna
[0052]
合成三对ssr引物，以ctab法提取的dna为模板进行pcr，3％琼脂糖凝胶电泳检测。结果显示，条带清晰，个别泳道有弱弥散现象，但不影响观察。从图像可以看出pt20165可将6个材料分成两组，其中1、4、6有一条带，2、3、5，有两条带，证明所取材料不来源于1个品种。pt20172有一条带，pt20213有一条带，但两对引物在六个材料间带型一样，没有多态性(图4)。结果表明，ctab法提取的dna能够满足pcr需求，通过ssr引物可以区分烤后烟叶的品种。
[0053]
二、供试品种新鲜叶片dna的提取
[0054]
采用ctab法提取烟草新鲜叶片的dna，利用琼脂糖凝胶电泳和分光光度计检测dna的质量和浓度。结果表明，dna浓度差异较大，湘烟6号dna浓度最低，为139.97，中烟100原dna浓度最大，为1291.07，但dna质量较好，无拖尾降解现象。取部分dna原液，并稀释到20ng/μl，用于pcr检测，其余储存在
‑
80℃冰箱保存。
[0055]
从19个品种新鲜烟叶中提取dna的浓度如下：
[0056][0057]
三、引物对火温度的检测
[0058]
首次合成引物23对，并对引物退火温度进行检测。在退火温度在50
‑
56℃之间，不同的引物扩增效果差异较大。有些引物在50℃时不能扩增出条带，如2、6、23；多数引物在54和56℃时不能扩增出条带；在53℃时；多数引物能够扩增出条带，且主带比较清晰。所以将退火温度设为53℃，进行一轮验证。
[0059]
四、引物的初步筛选
[0060]
我们利用19个材料对23对引物进行筛选，发现多数引物在品种间没有多态性，或
多态性不明显，少数引物具有较好的多态性，说明这些烟草的亲缘关系比较近。通过筛选，选出1、2、3、7、8、21、22、23进行下一步验证。pcr扩增：扩增体系(10μl)：2x m5 taq pcr mix 10μl、p1 0.3μl、p2 0.3μl、dna 2μl(20ng/ul)、dd h2o，7.2μl。扩增程序为：95℃，3min；95℃，30s；53℃，30s；72℃，30s，35个循环；72℃，10min。电泳条件：配置4％琼脂糖凝胶：称取6.4g琼脂糖溶于160ml 1xtae缓冲液中。将溶液在微波炉中加热至无水纹(加热时轻摇观察)，迅速加入14μl eb溶液，将琼脂糖溶液倒入电泳槽，插入小孔梳子，冷却至凝胶完全凝固。取pcr产物10μl打入凝胶孔中(及10μl dna marker打入凝胶孔中)。100v，电泳2h，然后利用凝胶成像系统观察，拍照。
[0061]
引物的第二轮验证
[0062]
我们利用19个供试材料对备选的引物进行多态性分析，对供试材料进行区分。1、2、6、7、9、11、14、22、23具有多态性，3、8、17、19等引物在不同品种间没有多态性。利用1、9、10、21、23主要引物可以将17个品种分开。利用5对辅助引物对一些品种进行辅助鉴定，如2和19需要增加引物确定；14和17用p7和p22辅助；6和9需要p7辅助；7需要p2辅助。具体分类过程：
①
用引物23进行区分，可将所有品种分为三类：第一类是1、2、3、5、6、7、9、14、15、17、18、19，第二类是4、8、10、11、13、16，第三类只有12；
②
用引物1，可以鉴定出第一类中的2、15、18、19，剩下的1、3、5、6、7、9不能分开，14和17不能分开。可鉴定出第二类中的4、8、10、13，11和16不能分开。
③
用引物21，可将第一类中3鉴定出，剩下的1、5、7为一类，6和9为一类，14和17为一类，不能区分。第二类中的11、16可鉴定出。
④
用引物9，可将鉴定出1、5、7，同时区分6和9，14和17为一类，不能区分。
⑤
用引物10，可将14和17区分。
[0063]
19个烟草品种指纹图谱如下：
[0064][0065][0066]
注释：p23(a)、p1(b)、p21(c)、p9(d)、p10(e)；m(multiple)代表多条带，u(unique)代表单一条带；1
‑
4代表条带序号，从大到小。
[0067]
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。