贝类水产品甲型肝炎病毒纳米PCR快速检测试剂盒及其应用的制作方法

贝类水产品甲型肝炎病毒纳米pcr快速检测试剂盒及其应用
技术领域
1.本发明涉及贝类水产品甲型肝炎病毒检测技术领域，具体涉及一种贝类水产品甲型肝炎病毒纳米pcr快速检测试剂盒及其应用。


背景技术：

2.国家标准(gb/t 22287
‑
2008)中贝类水产品中甲型肝炎病毒的检测方法是反转录pcr(rt
‑
pcr)方法和反转录实时荧光pcr(rt
‑
qpcr)方法。rt
‑
pcr方法是一种用途比较广泛的检测方法，但是该方法敏感性不高、特异性较低，尤其是针对低含量甲型肝炎病毒的检测受到极大限制。rt
‑
qpcr方法具有特异性强、灵敏度高等优点，然而该方法需要昂贵的仪器，对引物设计和操作人员的技术要求较高。
3.微滴式数字pcr(rt
‑
ddpcr)方法具有定量、定性、灵敏度高等优点，已经被应用到检测水产品、蔬菜等食品中的甲型肝炎病毒中，然而该方法中所用到的仪器非常昂贵且对操作人员的要求比较高，一般不适用于大批量样品检测(persson s,almlm e,karlsson m,et al.a new assay for quantitative detection of hepatitisavirus[j].journal ofvirological methods,2021,288:114010.)。
[0004]
甲型肝炎病毒(hav)可以通过病毒分离得到，常用的细胞系有非洲绿猴肾细胞(vero细胞)、恒河猴胚肾细(frhk
‑
4细胞)、人胚肺二倍体细胞(kmb17细胞)等，但甲型肝炎病毒在细胞内生长大多数很难适应细胞，培养周期较长，并且不能产生细胞病变，所以一般情况下不采用细胞培养的方法检测甲型肝炎病毒(谢忠平,宋霞,全文琦,等.细胞内快速连续传代培养甲肝病毒的研究[j].现代预防医学,2006,33(7):1089
‑
90.)。
[0005]
研究人员利用酶联免疫磁性电化学测定(elime)方法测定甲型肝炎病毒，基于多巴胺修饰磁性纳米珠作为固定支持物可提高检测的敏感性，然而制备磁性纳米珠以及用多巴胺修饰磁性纳米珠操作相对较为繁琐(micheli l,fasolia,attar a,et al.an elime assay for hepatitis a virus detection[j].talanta,2021,234(6):122672.)。
[0006]
近年来，应用基于近红外免疫层析技术快速检测食源性甲型肝炎病毒的方法，具有良好的特异性和敏感性，与传统的胶体金免疫层析试纸条相比，其检测时间短、检测限更低，然而针对贝类水产品中含极低浓度的甲型肝炎病毒是无法检测(万晓楠,畅晓晖,齐玮,等.基于近红外免疫层析技术快速检测食源性甲型肝炎病毒[j].食品与发酵工业,2020,46(7):213
‑
7.)。
[0007]
目前，dna微阵列法可以替代传统pcr方法，从而可以鉴定样品序列的单核苷酸多态性，但其仪器昂贵，不适用于实验室常规检测(merviel c,mansuy jm,dubois m,et al.development of a multiplex technique for detecting simultaneously hav rna and hev rna[j].pathologie biologie(paris),2012,60(2):95
‑
105.)(bozkurt h,d'souza d h,davidson p m.a comparison of the thermal inactivation kinetics ofhuman norovirus surrogates and hepatitis a virus in buffered cell culture medium[j].foodmicrobiology,2014,42:212
‑
7.)。
[0008]
电化学免疫传感器可以同时检测不同的甲型肝炎病毒抗原，灵敏度较高，但同样其所采用的仪器价格昂贵，并需要大量的纳米金颗粒和蛋白，检测步骤复杂，检测成本高(tang d,tang j,su b,et al.simultaneous determination of five
‑
type hepatitis virus antigens in 5min using an integrated automatic electrochemical immunosensor array[j].biosensors bioelectronics,2010,25(7):1658
‑
62.)。


技术实现要素：

[0009]
本发明提供一种贝类水产品甲型肝炎病毒纳米pcr快速检测试剂盒及其应用，以解决现有针对贝类水产品甲型肝炎病毒的检测方法存在的上述问题。
[0010]
本发明为解决技术问题所采用的技术方案如下：
[0011]
本发明的贝类水产品甲型肝炎病毒纳米pcr快速检测试剂盒，反应体系包括：阳性重组质粒pmd
‑
18t
‑
vp3、2
×
hifi taq酶、胶体金颗粒溶液、上游引物和下游引物；
[0012]
所述上游引物的序列为：hav vp3 f：5
’‑
ctgatccgtcccagggtg
‑3’
；
[0013]
所述下游引物的序列为：hav vp3 r：5
’‑
cagggaacacgaaatctcaaa
‑3’
。
[0014]
作为优选的实施方式，所述反应体系为20.0μl，所述阳性重组质粒pmd
‑
18t
‑
vp3用量为0.1～1.0μl，所述2
×
hifi taq酶用量为10.0μl，所述胶体金颗粒用量为0.5～4.0μl，所述上游引物的用量为0.5～2.0μl，所述下游引物的用量为0.5～2.0μl。
[0015]
作为更优选的实施方式，所述阳性重组质粒pmd
‑
18t
‑
vp3的用量为0.5μl，所述2
×
hifi taq酶的用量为10.0μl，所述胶体金颗粒的用量为2.0μl，所述上游引物的用量为0.5μl，所述下游引物的用量为0.5μl。
[0016]
作为优选的实施方式，所述阳性重组质粒pmd
‑
18t
‑
vp3的浓度为1.73
×
107copies/μl。
[0017]
作为优选的实施方式，所述胶体金颗粒溶液中的胶体金颗粒的直径为20nm。
[0018]
本发明的贝类水产品甲型肝炎病毒纳米pcr快速检测试剂盒的应用。
[0019]
作为优选的实施方式，利用该试剂盒检测贝类水产品甲型肝炎病毒，包括以下步骤：
[0020]
以阳性重组质粒pmd
‑
18t
‑
vp3为模板，向检测样本中加入10.0μl 2
×
hifi taq酶、0.5μl胶体金颗粒溶液、0.5μl模板、0.5μl上游引物、0.5μl下游引物，进行pcr扩增，pcr反应条件为：95℃预变形5min；94℃变性30s，51℃退火30s，72℃延伸30s，35个循环；72℃后延伸10min，用去离子水作为阴性对照，所述检测为非诊断目的。
[0021]
本发明的有益效果是：
[0022]
本发明的贝类水产品甲型肝炎病毒纳米pcr快速检测试剂盒及其应用，适用于快速检测和排查在贝类水产品中滴度较低的甲型肝炎病毒。与现有技术相比，本发明具有以下优点：
[0023]
1、本发明中制备胶体金颗粒大小均一，分散性良好，透光性好，能够提高试剂盒的检测灵敏度。
[0024]
2、本发明的试剂盒在检测时，操作简便，不需要昂贵的仪器设备，只需要常规的pcr仪和核酸电泳等设备，大大节约了检测成本。
[0025]
3、本发明的试剂盒在检测时，敏感性高，与普通pcr检测方法相比敏感性提高了
104。
[0026]
4、本发明的试剂盒在检测时，特异性强，对贝类水产品常见的病原微生物无法检出。
[0027]
5、本发明的试剂盒不需要昂贵的仪器设备、特异性强、敏感性较高，可适用于大批量样品的检测。
附图说明
[0028]
图1为实施例3中扩增hav vp3基因的结果。图1中，m表示dl 2000dna marker，1表示阴性对照，2表示hav vp3基因扩增。
[0029]
图2为实施例4中胶体金颗粒溶液浓度的优化结果。图2中，m表示dl 2000dnamarker，1表示阴性对照，2表示加0.5μl胶体金溶液，3表示加1.0μl胶体金溶液，4表示加1.5μl胶体金溶液，5表示加2.0μl胶体金溶液，6表示加2.5μl胶体金溶液，7表示加3.0μl胶体金溶液，8表示加3.5μl胶体金溶液，9表示加4.0μl胶体金溶液。
[0030]
图3为实施例4中引物反应量的优化结果。图3中，m表示dl 2000dna marker，1表示阴性对照，2表示引物各0.1μl，3表示引物各0.5μl，4表示引物各1.0μl，5表示引物各1.5μl，6表示引物各2.0μl。
[0031]
图4为实施例5中本发明的贝类水产品甲型肝炎病毒纳米pcr快速检测试剂盒的敏感性试验结果。图4中，a为havnanopcr敏感性检测，b为hav pcr敏感性检测，m表示dl 2000dnamarker，1表示阴性对照，2表示hav标准阳性质粒浓度1.73
×
107copies/μl，3表示hav标准阳性质粒浓度1.73
×
106copies/μl，4表示hav标准阳性质粒浓度1.73
×
105copies/μl，5表示hav标准阳性质粒浓度1.73
×
104copies/μl，6表示hav标准阳性质粒浓度1.73
×
103copies/μl，7表示hav标准阳性质粒浓度1.73
×
102copies/μl，8表示hav标准阳性质粒浓度1.73
×
101copies/μl，9表示hav标准阳性质粒浓度1.73
×
100copies/μl。
[0032]
图5为实施例6中本发明的贝类水产品甲型肝炎病毒纳米pcr快速检测试剂盒的特异性试验结果。图5中，m表示dl 2000dnamarker，1表示阴性对照，2表示阳性甲肝病毒，3表示诺如病毒gii亚型毒株，4表示戊肝病毒，5表示轮状病毒，6表示星状病毒，7表示副溶血性弧菌。
[0033]
图6为实施例2中胶体金颗粒溶液在一定的波长范围内测定最大吸收波长和最大吸收值。
[0034]
图7为实施例2中胶体金颗粒溶液的透射电镜图。
[0035]
图8为实施例2中胶体金颗粒溶液照片。
具体实施方式
[0036]
下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
[0037]
实施例1玻璃器皿酸化和硅化处理
[0038]
首先将玻璃器皿上的灰尘污垢彻底刷洗干净，再用大量自来水冲洗干净，最后用
去离子水漂洗、烘干；然后将清洗干净的玻璃器皿放入清洁液中浸泡48h，取出后用自来水反复冲洗15次，再用蒸馏水洗涤15次，最后用去离子洗涤15次，90℃烘箱干燥备用。
[0039]
将通风橱内经酸化的玻璃器皿浸泡在含5％二氯二甲基硅烷的氯仿溶液中，浸泡10min后取出，待有机物完全挥发干净后分别用自来水、蒸馏水和取离子水洗净，90℃烘箱干燥备用。
[0040]
实施例2胶体金颗粒溶液的制备及鉴定
[0041]
采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金颗粒溶液：在99.0ml的去离子水中加入1.0ml、1％的haucl4溶液，在电炉上加热直到沸腾，待沸腾2
‑
3min后加入1.5ml、1％的柠檬酸三钠溶液，持续加热并不断搅拌，溶液颜色依次按照无色、浅灰色、黑色、紫色、酒红色进行变化，待颜色稳定后再持续加热6min，停止加热，室温冷却，4℃避光保存。
[0042]
鉴定所制备的胶体金颗粒溶液的质量：如图8所示，1)肉眼观察：优质的胶体金颗粒溶液呈现澄清透亮，没有悬浮物和沉淀杂质；2)用紫外
‑
可见光分光光度计测定：在一定的波长范围内测定最大吸收波长和最大吸收值。结果如图6所示，紫外可见分光光度计对制备胶体金溶液测定，在波长为520nm处出现最大吸收值约为1.377；3)透射电镜对胶体金颗粒溶液进行鉴定，分析其胶体金颗粒溶液有无凝聚、大小状态、分散性及其颗粒直径大小。结果如图7所示，用透射电子显微镜观察金纳米大小均一、均匀性良好，颗粒直径约20nm。
[0043]
实施例3构建阳性重组质粒pmd
‑
18t
‑
vp3
[0044]
从genbank数据库中获取甲型肝炎病毒全基因序列，分析甲型肝炎病毒保守性基因序列(如序列表seq id no:1所示)；根据甲型肝炎病毒保守性基因序列，应用primer premier 5.0软件设计一对特异性引物，引物由吉林省库美生物科技有限公司合成。这一对特异性引物序列如下：
[0045]
hav vp3 f：5
’‑
ctgatccgtcccagggtg
‑3’
；
[0046]
hav vp3 r：5
’‑
cagggaacacgaaatctcaaa
‑3’
。
[0047]
用病毒rna提取试剂盒提取阳性hav样品，进一步利用反转录试剂盒获得其cdna；以阳性hav样品的cdna为模板，利用hav vp3 f/r引物进行pcr扩增，pcr反应条件为：95℃预变性5min；94℃变性30s，51℃退火30s，72℃延伸30s，35个循环；72℃后延伸10min，扩增产物在1.2％琼脂糖凝胶电泳观察扩增结果。结果如图1所示，获得的目的片段大小为412bp(如序列表seq id no:1所示)，与预期片段大小一致。
[0048]
将扩增产物按照dna凝胶回收试剂盒说明书进行纯化，并将其连接到pmd
‑
18t克隆载体，通过pcr鉴定和测序验证，获得阳性重组质粒pmd
‑
18t
‑
vp3。
[0049]
实施例4反应条件的优化
[0050]
(1)胶体金颗粒溶液反应量的确定
[0051]
以阳性重组质粒pmd
‑
18t
‑
vp3为模板，建立havnanopcr反应体系。反应体系为20.0μl(加灭菌的去离子水补至20.0μl)，包括10.0μl 2
×
hifi taq酶、0.5μl模板、0.5μl上游引物、0.5μl下游引物，分别添加0.5μl、1.0μl、1.5μl、2.0μl、2.5μl、3.0μl、3.5μl、4.0μl的胶体金颗粒溶液(含直径为20nm的胶体金颗粒)，进行pcr扩增，pcr反应条件为：95℃预变形5min；94℃变性30s，51℃退火30s，72℃延伸30s，35个循环；72℃后延伸10min，使用去离子水作为阴性对照，pcr扩增产物经1.2％琼脂糖凝胶电泳观察结果，确定最佳胶体金颗粒溶液反应量。
[0052]
结果如图2所示，随着胶体金颗粒溶液反应量的逐渐增加，pcr扩增产物逐渐增加，当胶体金颗粒溶液反应量为0.5～2.0μl时，pcr扩增产物扩增量差异不明显，故确定胶体金颗粒溶液的最佳反应量为0.5μl。
[0053]
(2)上下游引物反应量的确定
[0054]
以阳性重组质粒pmd
‑
18t
‑
vp3为模板，建立havnanopcr反应体系。反应体系为20.0μl(加灭菌的去离子水补至20.0μl)，包括10.0μl 2
×
hifi taq酶、0.5μl模板、2.0μl胶体金颗粒溶液，分别添加0.1μl、0.5μl、1.0μl、1.5μl、2.0μl的上下游引物(浓度为10.0μm)进行pcr扩增，pcr反应条件为：95℃预变形5min；94℃变性30s，51℃退火30s，72℃延伸30s，35个循环；72℃后延伸10min，使用去离子水作为阴性对照，pcr扩增产物经1.2％琼脂糖凝胶电泳观察结果，确定最佳上下游引物反应量。
[0055]
结果如图3所示，随着上下游引物反应量的逐渐增加，pcr扩增产物逐渐增加，当上下游引物反应量为0.5～2.0μl时，pcr扩增产物扩增量差异不明显，故确定上下游引物的最佳反应量为0.5μl。
[0056]
实施例5敏感性试验
[0057]
以去离子水为模板作为阴性对照，将本发明的试剂盒与现有普通pcr方法进行比较分析本试剂盒的敏感性。
[0058]
本发明的纳米pcr快速检测方法如下：
[0059]
根据筛选出的最佳反应条件进行pcr扩增，即反应体系为20.0μl(加灭菌的去离子水补至20.0μl)，包括10.0μl 2
×
hifi taq酶、0.5μl模板、0.5μl上游引物、0.5μl下游引物、0.5μl胶体金颗粒溶液。pcr反应条件为：95℃预变形5min；94℃变性30s，51℃退火30s，72℃延伸30s，35个循环；72℃后延伸10min。其中，所说的模板为阳性重组质粒pmd
‑
18t
‑
vp3，浓度为1.73
×
107copies/μl，进行10倍梯度稀释。
[0060]
现有普通pcr方法如下：
[0061]
反应体系为20.0μl(加灭菌的去离子水补至20.0μl)，包括10.0μl 2
×
hifi taq酶、0.5μl模板、0.5μl上游引物、0.5μl下游引物。pcr反应条件为：95℃预变形5min；94℃变性30s，51℃退火30s，72℃延伸30s，35个循环；72℃后延伸10min。其中，所说的模板为阳性重组质粒pmd
‑
18t
‑
vp3，浓度为1.73
×
107copies/μl，进行10倍梯度稀释。
[0062]
pcr扩增产物经1.2％琼脂糖凝胶电泳观察结果。结果如图4所示，现有普通pcr方法的最低检测限为1.73
×
104copies/μl，而本发明的试剂盒的最低检测限为1.73
×
100copies/μl。本发明的试剂盒的敏感性是现有普通pcr方法的104倍。
[0063]
实施例6特异性试验
[0064]
以去离子水为模板作为阴性对照，将本发明的试剂盒与现有普通pcr方法进行比较分析本试剂盒的特异性。
[0065]
根据筛选出的最佳反应条件进行pcr扩增，即反应体系为20.0μl(加灭菌的去离子水补至20.0μl)，包括10.0μl 2
×
hifi taq酶、0.5μl模板、0.5μl上游引物、0.5μl下游引物、0.5μl胶体金颗粒溶液。pcr反应条件为：95℃预变形5min；94℃变性30s，51℃退火30s，72℃延伸30s，35个循环；72℃后延伸10min。
[0066]
贝类水产品常见的病原微生物有：诺如病毒、戊型肝炎病毒、轮状病毒、星状病毒、副溶血性弧菌核酸。分别以诺如病毒、戊型肝炎病毒、轮状病毒、星状病毒、副溶血性弧菌核
酸、甲型肝炎病毒的cdna或dna作为模板。
[0067]
pcr扩增产物经1.2％琼脂糖凝胶电泳观察结果。以诺如病毒、戊型肝炎病毒、轮状病毒、星状病毒、副溶血性弧菌、甲型肝炎病毒的cdna或dna为模板，对所建立的havnanopcr方法的特异性进行评价，结果如图5所示，只有甲型肝炎病毒样品扩增出412bp的目的片段，而其他几种病原样品的检查结果均为阴性，阐明本发明的试剂盒即havnanopcr方法与其他几种贝类水产品常见病原微生物不存在交叉反应，表明本发明的试剂盒即havnanopcr方法具有良好的特异性。
[0068]
本发明公开了一种贝类水产品甲型肝炎病毒纳米pcr快速检测试剂盒及其应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的产品已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的产品进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。