一株海征微杆菌及其降解T-2毒素的应用的制作方法

一株海征微杆菌及其降解t-2毒素的应用
技术领域
1.本发明属于微生物应用领域，具体涉及一株海征微杆菌菌株(microbacterium maritypicum)及其在降解t-2毒素中的应用。


背景技术：

2.t-2毒素是一种倍半萜烯化合物，学名为4β-1,5-二乙酰氧基-8α-(3-甲基丁酰氧基)-3α-羧基-12,13-环氧单端孢霉-9-烯，分子式为c
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o9。它是一种由镰孢菌属(如拟孢镰刀菌、枝孢镰刀菌、三线镰刀菌等)产生的a类单端孢霉烯族真菌毒素，本身具有分布广、繁殖快、耐热、毒性大、残留时间长、难处理等特点。t-2毒素能够通过食物链的传递和生物体的蓄积作用，进而对动物体，肉、禽、蛋、乳等动物源食品以及人体健康的安全性构成重大威胁。它作用的主要靶器官为细胞分裂旺盛的组织器官。其毒素急性毒理学特性主要表现为呕吐，胸痛，头晕，心跳迟缓，腹泻，出血等；慢性毒性主要表现为对食物或饲料的利用率下降，皮肤坏死，消化道黏膜损伤，造血系统破坏和免疫系统遭到抑制，凝血功能下降，神经系统紊乱，心血管系统功能混乱等。
3.t-2毒素主要分布在霉变的玉米、黑麦、小麦、大米等粮食作物及其制品，以及饲料中。从华南、华北和华中的饲料厂、仓库及客户手中采集样品进行毒素检测，玉米样品中t-2毒素检出率为87.5％；蛋白质饲料中t-2毒素的检出率为97.8％。t-2毒素比较容易在富含淀粉的禾谷类种子上产生，该类谷物在田间、收获过程、收获后储藏期间以及饲料和食品成品储存、使用等诸多环节中，都有可能受到t-2毒素的污染。这些被毒素污染的粮食不但对人畜的健康造成了威胁和危害，而且严重地制约了我国农产品的出口贸易。
4.因此，如何减少或者完全去除真菌毒素已成为国内外研究的热点。目前，t-2毒素脱毒方法主要包括物理法、化学法和生物法。t-2毒素性质稳定，有很强的耐热性和紫外线耐受性，因此传统的物理如加热、辐照、吸附处理等虽然能部分清除真菌毒素，但是这些方法去毒不彻底及成本高等缺陷。化学脱毒脱去霉菌毒素的效果较物理脱毒好，但是化学脱毒可能影响饲料安全及饲料适口性，实际应用具有一定的局限性。使用生物方法去毒条件温和且具有高效性、特异性，可以最大程度地保留粮谷中的营养成分，降解后的产物对环境无污染，因此，日益被科学界所关注。目前已经筛选出了部分能脱除t-2毒素的微生物，如酵母菌、芽生杆菌属、非典型节杆菌属等。但目前国内外对t-2毒素脱毒微生物的开发研究依旧匮乏，并且部分菌株对t-2毒素的脱毒效率较低，在对代谢产物分析后，有一部分微生物是将t-2毒素转化成ht-2毒素或者t-2三醇等，这些产物的毒性或低于t-2毒素或更强于t-2毒素。因此，发掘高效、安全、特异性降解t-2毒素的微生物菌株具有重要意义。


技术实现要素：

5.本发明的第一个目的是提供一株可以高效降解t-2毒素的海征微杆菌。
6.本发明的第二个目的是提供含有上述菌株的菌剂及其制备方法。
7.本发明的第三个目的是提供上述菌株在降解t-2毒素中的应用。
8.为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：
9.第一方面，本发明提供一株海征微杆菌(microbacterium maritypicum)，菌名为td-1，分类名为：海征微杆菌microbacterium maritypicum，已于2021年08月13日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(cgmcc)(地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，其保藏编号为cgmcc no.23143。
10.具体的，所述海征微杆菌的理化性质如下：
11.1、菌体的形态特征：
12.菌株颜色较浅，菌落呈圆形且菌落很小，相互间不容易分开，边缘光滑，有光泽，对光看呈半透明。该菌在光学显微镜下菌体呈不规则的杆状，大小为(0.3-0.6)
×
(1.2-2.9)μm(图6和图7)。
13.2、菌株的主要理化特征：
14.microbacterium maritypicum td-1的适宜生长温度为25-30℃、ph范围6-9，好氧生长，不生孢。
15.3、菌株的主要遗传特征
16.对上述菌株的16srdna测序，blast比对发现，菌株的16srdna基因序列与microbacterium maritypicum已有菌株具有较高的相似性，其中与海征微杆菌属的序列相似性为99.86％。
17.综合以上的生理生化特性、16srdna序列比对结果，本发明的microbacterium maritypicum菌株应归属海征微杆菌属，由于其可以降解t-2毒素，故命名为microbacterium maritypicumtd-1(t-2degradation strain 1)。
18.与其它生物的情况一样，本发明具有降解t-2毒素活性的菌，td-1菌株仍然可能发生突变或变异。因此，可以利用本领域已知的物理和化学方法得到该菌株的突变株，例如，可以通过用化学药剂如亚硝基胍(ntg)及其它化学诱变剂，或用物理方法如紫外、co
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辐照处理得到其突变株，这些诱变突变株，只要保留了降解t-2毒素这样一个能力特征，也属于本发明的一部分。
19.第二方面，本发明还提供了一种菌剂，其含有上述海征微杆菌(microbacterium maritypicum)td-1。该菌剂可以是液体剂型也可以是固体剂型，并可以通过现有技术中已公开的制备方法来制备。具体地，本发明提供了一种上述菌剂的制备方法，该方法包括：
20.将保藏编号为cgmcc no.23143的海征微杆菌(microbacterium maritypicum)活化，多级扩培，当菌体处于稳定期时，收集发酵液，制备成液体型菌剂。
21.进一步地，该方法还可以包括将液体型菌剂制成固体型菌剂的步骤。可选的，将液体型菌剂与吸附剂混合，干燥后制得固体型菌剂；或者，将液体型菌剂喷雾干燥后制得固体型菌剂。其中，所述液体型菌剂与吸附剂按1:2-10的重量比进行混合，所述吸附剂为玉米芯粉、麸皮、淀粉、硅藻土、凹凸棒土、蛭石、轻质碳酸钙或泥炭中的一种或几种。
22.进一步地，在上述制备方法中，用来培养海征微杆菌的发酵培养基(op)可以有多种形式的，但是综合考虑生产成本、细胞生物量、脱毒活性等方面，优选某些培养基，例如，海征微杆菌(microbacterium maritypicum)td-1优选的碳源为蔗糖，但也可以使用葡萄糖、麦芽糖、甘油、果糖、半乳糖、甘露糖、淀粉等。海征微杆菌(microbacterium maritypicum)td-1优选的氮源为大豆蛋白胨，但也可以使用胰蛋白胨、酵母膏、酵母提取
物、牛肉膏、尿素等。可掺入培养基中的营养无机盐有能够产生下列离子的常规可溶性盐：钠离子、钾离子、镁离子、钙离子、铁离子、氯离子、磷酸根离子、硫酸根离子等。
23.进一步地，所述的种子培养基和发酵培养基(op)需要121℃高温湿热灭菌后冷却至30～35℃使用。
24.进一步地，所述活化后的菌种按种子罐中种子培养基的0.5～10％接种量接种入种子罐；所述种子液按发酵罐中发酵培养基的0.5～10％接种量接种入发酵罐进行扩培。
25.进一步地，发酵培养条件为：无菌空气的通气量为1:0.5～1.2，搅拌速度为50～300转/分，培养温度约30～37℃，液体型菌剂中活细胞数量至少达到107cfu/ml。
26.第三方面，本发明还提供了上述保藏编号为cgmcc no.23143海征微杆菌(microbacterium maritypicum)td-1的应用，为如下1)或2)中的至少一种：
27.1)降解t-2毒素；
28.2)制备用于降解t-2毒素的产品。
29.根据本发明的具体实施方式，本发明的降解t-2毒素的方法是采用上述海征微杆菌(microbacterium maritypicum)td-1处理含有t-2毒素的物质。
30.进一步地，可以采用如下(a)或(b)方式中的任一种：
31.(a)将液体型菌剂按照质量比1:1的配比喷施于t-2毒素污染的谷物或者饲料及饲料原料或其它农副产品，降解t-2毒素，所述液体型菌剂的活细胞数量至少达到107cfu/ml。
32.(b)将固体型菌剂按照质量百分含量为1-5％的添加量加入到谷物或者饲料及饲料原料中，混合均匀，降解t-2毒素，所述固体型菌剂的活细胞数量至少达到108cfu/g。
33.需要说明的，所述谷物为玉米、大麦、稻谷、小麦或高梁。所述饲料原料及饲料为玉米、大麦、稻谷、小麦或高梁等饲料原料及它们加工而成的饲料。所述其它农副产品为农产品加工副产物如酒糟、果渣、淀粉渣等。
34.本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
35.本发明提供的保藏编号为cgmccno.23143的海征微杆菌(microbacterium maritypicum)td-1菌株对t-2毒素具有高效的降解作用，能在20h内将15μg/ml的t-2毒素完全降解，具有降解速度快、降解完全的优点。使用保藏编号为cgmccno.23143的菌株生产降解t-2毒素的菌剂具有生产使用成本低、简单、易操作，降解安全、高效等优点。本发明提供的菌株和菌剂可以用于谷物、饲料、饲料原料中t-2毒素的去除，对于解决谷物、饲料及其原料中毒素污染问题，提高粮食利用率，保证畜牧业的安全生产、提高畜牧业经济效益具有重要的意义。
36.保藏说明
37.参据的生物材料(株)：td-1
38.建议的分类命名：microbacterium maritypicum
39.保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心
40.保藏机构简称：cgmcc
41.地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号
42.保藏日期：2021年08月13日
43.保藏中心登记入册编号：cgmcc no.23143。
附图说明
44.图1td-1在t-2毒素浓度为15μg/ml的培养基中毒素降解效果。
45.图2td-1液体反应体系下，降解效果。
46.图3td-1液态菌剂对谷物中t-2毒素的降解效果。
47.图4td-1固态菌剂对谷物中t-2毒素的降解效果。
48.图5td-1在优化前后发酵培养基中对t-2毒素降解效果的比对。
49.图6td-1的菌落形态图。
50.图7td-1的显微形态图。
具体实施方式
51.下面结合具体实施例对本发明做进一步说明，但并不是限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为常规生化试剂供应商购买得到。
52.实施例1海征微杆菌microbacterium maritypicum.获得与鉴定
53.从江浙霉菌污染严重的地区采集231份土样，通过96微孔板为培养载体，首先采用连续5次t-2毒素浓度梯度的富集培养法，获得具有降解t-2毒素的菌悬液，然后将菌悬液按稀释涂布法以合适的稀释度涂布在lb琼脂平板(酵母提取物0.5％，胰蛋白胨1％，nacl 1％，琼脂粉1.6％，ph7.2，121℃灭菌20min)上，挑取生长分离程度良好且菌落形态特征、颜色不同的菌落，在t-2毒素浓度为15μg/ml的lb液体培养基(酵母提取物0.5％，胰蛋白胨1％，nacl1％，ph 7.2，121℃灭菌20min)中进行脱毒试验，乙腈抽提残留的t-2毒素并进行hplc检测，验证各个纯培养物的t-2毒素降解效果，最终成功获得能够降解t-2毒素的菌株td-1，挑取td-1单菌落于lb液体培养基中，培养至对数期中期时，用30％的甘油溶液(甘油：水＝1:1)与培养物等体积混合后置于-80℃保存。
54.克隆菌株td-1的16s rdna序列，并对该16s rdna序列进行测序(见序列表seq id no.1)，把测序结果在genbank和ezbioclaud网站进行blast比对分析序列同源性，得到td-1菌株的系统分类学地位鉴定结果。最终将该海征微杆菌(microbacterium maritypicum)td-1送交中国普通微生物菌种保藏管理中心保藏，保藏编号为cgmcc no.23143。为简化说明，以下叙述中，将本发明所提及的海征微杆菌(microbacterium maritypicum)td-1用td-1表示。
55.实施例2伴随td-1发酵的脱毒效果
56.将活化后的td-1以1％的接种量接种至含有15μg/ml t-2毒素的50ml的培养基中，在200转/分的振荡条件下进行脱毒培养，定时取样并用乙腈抽提t-2毒素，最终培养物中t-2毒素的剩余含量经hplc检测结果表明：随着发酵进行，t-2毒素被完全降解，在20小时后，t-2毒素降解率达100％(见图1)。并绘制液体反应体系下，上述菌株的降解效果图(降解曲线)(见图2)。
57.实施例3td-1液态菌剂的制备
58.固体培养基组分及配比：酵母提取物0.5％，胰蛋白胨1％，nacl 1％，琼脂粉1.6％，ph7.2～7.4，121℃下高温蒸汽灭菌20min。
59.种子培养基组分及配比：酵母提取物0.5％，胰蛋白胨1％，nacl 1％，ph7.2～7.4，
121℃下高温蒸汽灭菌20min；发酵培养基组分及配比：td-1：酵母提取物0.5％、胰蛋白胨1％、氯化钠1％，ph为7.2。
60.菌种活化：将保藏号为cgmcc no.23143的td-1接种于固体培养基上，于30℃条件下培养2天，并测定其t-2毒素降解性能，再接种于试管斜面上备用。
61.种子培养：从斜面培养基上挑取单菌落接入种子培养基中，于30℃条件下培养至对数期，制得备用菌种；然后，用100升的种子罐，种子培养基投料量70升，投料完毕后121℃高压湿热灭菌，冷却至30℃后，将上述培养好的菌种以体积比2％的接种量接种入种子罐，搅拌速度为220转/分，培养温度30℃，无菌空气通入量为1:1(体积比)，约24～40小时培养至对数生长期，获得种子液。
62.发酵培养：采用容积为1000升的生产罐，发酵培养基投料量600升，在1.1kg/cm2的压力、121℃的温度下，进行高压湿热灭菌，灭菌后冷却30℃，将种子液按2％的接种量接种入发酵罐，发酵条件：无菌空气的通气量为1:1～1.2，搅拌速度为200-260转/分，培养温度30℃，培养时间约24～40小时，放罐后形成具有降解t-2毒素能力的液态菌剂。该液态菌剂中活细胞数量至少达到107cfu/ml。
63.实施例4td-1固态菌剂的制备
64.将实施例3中产生出来的td-1液态菌剂与麦麸或玉米芯粉按照1:5的质量比例混合均匀，在40℃以下低温干燥至水分10％以下，形成固态状，研磨成粉，分装保存，从而制得td-1固态菌剂。
65.实施例5td-1液态菌剂对谷物中t-2毒素的降解效果
66.将实施例3制备的td-1液态菌剂进行稀释，稀释后的液体型菌株活细胞数量至少达到107个/ml，按质量比1:1的配比喷洒到污染t-2毒素的小麦粉中作为试验组，无菌发酵培养基以同样的配比喷洒到污染t-2毒素的小麦粉中作为对照组，每组三个重复，混合均匀后于30℃的温度下脱毒48小时后，从对照组和试验组准确称量5g样品。使用romer公司生产的t-2毒素酶联免疫检测试剂盒对t-2毒素残留进行分析。结果表明td-1液态菌剂对t-2毒素污染的玉米粉降解率达49.9％，而对照组无任何降解现象(结果见图3)。
67.实施例6td-1固态菌剂对谷物中t-2毒素的降解效果
68.将实施例4制备得到的td-1固态菌剂按照1％、3％、5％的重量比添加到污染t-2毒素的小麦粉中，发酵培养基和麦麸(以1:5比例混合)混合物同样以1％、3％、5％的重量比加入到污染t-2毒素的对照组小麦粉中，将对照组和试验组均按1:1的比例加入去离子水，每组三个重复，混合均匀后于30℃的温度下脱毒48小时，从对照组和试验组准确称量5g样品。使用romer公司生产的t-2毒素酶联免疫检测试剂盒对t-2毒素残留进行分析，结果表明td-1固态菌剂对污染小麦粉经过48小时的脱毒，其降解率可达31％(添加比5％时)，对照组无任何降解现象(结果见图4)。
69.实施例7液体培养基优化前后td-1降解t-2毒素比对
70.以实施例3中的发酵培养基为基础配方，尝试研究不同碳源、氮源、无机盐及不同ph对td-1发酵的影响。通过正交实验，确定优化后培养基组分及含量：酵母提取物0.5％、胰蛋白胨1％、氯化钠1％、蔗糖2％、大豆蛋白胨0.5％、磷酸氢二钾5mm，ph为7.0。利用实施例2中的方法，将td-1分别接种于原来的发酵培养基和优化后的发酵培养基，添加15μg/ml t-2毒素，培养条件与实施例2中相同，在培养过程不同时间取样，乙腈抽提后进行液相检测t-2
毒素含量，比对td-1在不同发酵培养基中对t-2毒素降解效率。如图5所示，td-1在优化后的发酵培养基较在优化前的培养基可更快的降解t-2毒素，将完全降解时间提前到8h。
71.显然，本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无法对所有的实施方式予以穷举。凡是属于本发明的技术方案所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之列。