分子标志物CHMP4C在HPV病毒感染所致宫颈癌中的应用的制作方法

分子标志物chmp4c在hpv病毒感染所致宫颈癌中的应用
技术领域
1.本发明属于医药生物技术领域，具体涉及一种分子标志物chmp4c在hpv病毒感染所致宫颈癌中的应用。


背景技术：

2.宫颈癌是最常见的妇科肿瘤之一，2018年全球新发病例569847例，死亡人数311365人，在女性肿瘤发病率和死亡率中排第四。其中，中国报告了106 430 例新发宫颈癌病例和47739 例死亡病例，分别占全球发病率和死亡率的18.7%和15.3%。另外由于宫颈癌筛查的人口覆盖率低（21.4%），hpv疫苗接种率也较低，消灭宫颈癌的任务更加艰巨。
3.宫颈癌的发生与人乳头状瘤病毒（hpv）的感染、吸烟、长期口服避孕药、第一次性交的年龄、多个性伴侣和合并感染等因素相关。其中感染hpv是宫颈癌最主要的病因，超过90％的鳞状宫颈癌能检测到hpv dna。但是在大部分情况下，人体感染hpv病毒后能在自身免疫系统的作用下将病毒清除干净，只有少部分病毒能持续感染导致宫颈上皮内瘤变（cin），如果不及时治疗最终将发展为宫颈癌。根据hpv与宫颈癌或癌前病变的关系，可将其分为低危型和高危型。在高风险类型（hpv16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59）中，hpv16和hpv18是宫颈癌中最常见的基因型，分别占62.5%和15.7%。病毒主要利用宿主进行dna的复制，其早期基因编码的产物，主要是癌蛋白e6和e7，能够抑制肿瘤抑制基因p53和prb（成视网膜细胞瘤蛋白）的表达，是诱导细胞永生、转化和癌变的重要因素。
4.目前宫颈癌的发病机制尚不完全清楚，临床上也并没有用于宫颈癌诊治的有效的分子标志物，寻找新的分子标志物对于宫颈癌的机制研究以及临床应用都具有重要的意义。


技术实现要素：

5.为了弥补现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种宫颈癌的生物标志物，灵敏和特异性地实现宫颈癌的诊断和治疗。
6.为了实现上述目的，本发明提供了如下技术方案。
7.本发明提供了chmp4c基因或其编码蛋白的表达水平的检测试剂在制备用于宫颈癌辅助诊断、预后评价产品中的应用。
8.进一步地，所述宫颈癌为hpv感染所致宫颈癌。
9.进一步地，所述chmp4c基因表达上调。
10.进一步地，所述产品通过逆转录pcr、实时定量pcr、免疫组织化学染色或酶联免疫吸附检测样本中chmp4c基因或其编码蛋白的表达水平。
11.优选地，扩增chmp4c基因的特异性引物序列如seq id no.1和seq id no.2所示；所述抗体为单克隆抗体或多克隆抗体。
12.优选地，所述产品为芯片、制剂或试剂盒；所述样本为组织或细胞。
13.本发明还提供了chmp4c基因表达水平的抑制剂在制备治疗宫颈癌的药物中的应
用。
14.本发明还提供了chmp4c基因表达水平的抑制剂在制备治疗宫颈癌细胞的增殖、凋亡、侵袭能力、迁移能力的药物中的应用。
15.根据上述所述应用，其特征在于，所述宫颈癌为hpv感染所致宫颈癌。
16.根据上述所述应用，其特征在于，所述chmp4c基因表达水平的抑制剂为sirna，所述sirna的序列包括seq id no .3~ seq id no .8任一所示序列。
17.与现有技术相比本发明的有益效果。
18.本发明首次发现了与hpv感染所致宫颈癌发生发展相关的生物标志物—chmp4c，通过检测受试者chmp4c的变化，来实现宫颈癌的早期诊断。
19.本发明提供了治疗hpv感染所致宫颈癌的分子靶标，通过靶向于分子标志物来治疗疾病具有敏感性和特异性。
20.本发明对hpv感染所致宫颈癌的机制研究提供了一定的理论基础。
附图说明
21.图1显示gepia数据库显示chmp4c与宫颈癌的预后相关，chmp4c表达高的宫颈癌患者预后较差。
22.图2显示利用免疫组化检测chmp4c基因在正常宫颈组织（a）、宫颈鳞状细胞癌组织（b）和宫颈腺癌组织（c）中的表达情况。
23.图3显示利用qrt-pcr检测sirna对chmp4c和e6基因表达的影响。
24.图4显示利用免疫印迹检测sirna对chmp4c和e6蛋白表达的影响，以及chmp4c影响bcl2和bcl-xl凋亡蛋白的表达，e6影响chmp4c蛋白的表达。
25.图5显示mtt法（a、b）和平板克隆实验（c、d）检测chmp4c对宫颈癌细胞增殖活性的影响。
26.图6显示利用流式细胞术检测chmp4c对宫颈癌细胞凋亡水平的影响。
27.图7显示利用transwell细胞侵袭试验检测chmp4c基因对宫颈癌细胞侵袭能力的影响。
28.图8显示利用细胞迁移试验检测chmp4c基因对宫颈癌细胞迁移能力的影响。
具体实施方式
29.下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如sambrook等人，分子克隆：实验室手册(new york:cold spring harborlaboratory press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
30.实施例1 免疫组化验证chmp4c在不同组织中的差异表达。
31.如图1示gepia数据库显示chmp4c高表达与宫颈癌的不良预后相关，因此我们验证chmp4c是否为宫颈癌的基因标志物。
32.1.样品收集：本次研究一共收集宫颈正常组织19例、宫颈鳞癌组织88例和宫颈腺癌组织8例，标本均来源于广州医科大学附属第三医院住院的患者，均经病理学诊断证实，所有患者术前
未行放、化疗，并签署标本处理知情同意书，且通过广州医科大学附属第三医院伦理委员会审核。
33.2.切片制备：所有样品经病理科制备成石蜡切片，于-20℃冰箱保存。
34.3. 免疫组化：1）从-20℃冰箱中取出组织石蜡切片，置于60℃温箱中烘烤4h，可见石蜡融化，然后把切片分别放入二甲苯ⅰ和二甲苯ⅱ中脱蜡15min。接着把切片分别放入100%酒精ⅰ和100%酒精ⅱ各5min，95%酒精2min，85%酒精2min，75%酒精1min，最后在蒸馏水中洗三次，每次3min，逐渐完成水化；2）将柠檬酸修复液倒进容器内，连同容器放入煮沸的水中，温度升高后，将切片架放入修复液，盖锅盖，但不锁定，缓慢加压，使玻片在缓冲片中浸泡5min，然后将盖子锁紧，小阀门升起后继续加热3min，除去热源，置于凉水中，当小阀门沉下去后，打开盖子。取出容器，室温下晾凉，大概需要30min。然后将切片架置于pbs中清洗3次，每次5min，用滤纸吸干组织周围的液体，放入湿盒中；3）准备sp免疫组化试剂盒：即用型免疫组化。用免疫组化笔在组织周围划圈，避免试剂流淌和扩散。在组织上加入试剂盒a液，置于湿盒中37℃温箱孵育40min以灭活内源性过氧化物酶活性。pbs冲洗3次，每次5min，轻轻擦干液体。加入试剂盒b液，置于湿盒中37℃温箱孵育40min。轻轻擦干液体，勿洗。加入抗chmp4c抗体，置于湿盒中4℃孵育过夜。第二天将湿盒取出，室温下复温30min后取出切片，pbs清洗3次，每次5min，轻轻擦干液体。加入试剂盒c液，置于湿盒中37℃温箱孵育45min，pbs冲洗3次。轻轻擦干液体。最后加入试剂盒d液，置于湿盒中37℃温箱孵育30min，pbs冲洗3次；4）配制dab显色液，每张片加入约80μl dab液，镜下观察，组织变为棕色后立即将切片放入蒸馏水中使显色中止；5）接着苏木素染色10min，流水冲洗4min，然后在盐酸酒精里刷4-5下，冲水返蓝20min，直到紫色变为蓝色；6）玻片分别浸入75%，85%，95%酒精各1min，100%酒精ⅰ和ⅱ各5min，二甲苯ⅰ和ⅱ各10min（也可过夜）进行脱水。室温风干，然后中性树脂封片，尽量不留气泡。放平板上静置1天，晾干后镜检。
35.4.数据处理：在光学显微镜下按染色程度（0分阴性着色，1分淡黄色，2分浅褐色，3分深褐色）和阳性范围（1分0-25%，2分26-50%，3分51-75%，4分76-100%）评分，最终分数相加。利用卡方检验进行统计学分析。
36.5.结果：结果如图2显示，结果采用卡方检验分析，宫颈鳞癌组织和腺癌组织中chmp4c的表达量比正常宫颈组织高，差异具有统计学意义（p＜0.05）。
37.实施例2 chmp4c和e6基因的沉默。
38.沉默siha和hela细胞中chmp4c和e6的表达量从而验证其功能。
39.1. 细胞培养：人宫颈癌细胞株siha和hela，分别以含10％胎牛血清的培养基1640和dmem在37
℃、5％co2的培养箱中培养。2-3天使用0.25％含edta的胰蛋白酶常规消化传代。
40.2、sirna设计：阴性对照sirna序列（sirna-nc）：seq id no.13：正义链为5
’‑ꢀ
uucuccgaacgugucacgutt-3’；seq id no.14：反义链为5
’‑ꢀ
acgugacacguucggagaatt-3’；针对chmp4c基因的sirna序列：sirna-chmp4c：seq id no.3：正义链为5
’‑ꢀ
cagauugauggcacacuuu-3’；seq id no.4：反义链为5
’‑ꢀ
aaagugugccaucaaucug-3’；针对hpv16 e6和hpv18 e6基因的sirna序列：sirna-hpv16 e6：seq id no.5：正义链为5
’‑ꢀ
gaguauagacauuauuguu-3’；seq id no.6：反义链为5
’‑ꢀ
aacaauaaugucuauacuc-3’；sirna-hpv18 e6：seq id no.7：正义链为5
’‑ꢀ
cagacucuguguauggaga-3’；seq id no.8：反义链为5
’‑ꢀ
ucuccauacacagagucug-3’。
41.将细胞按4
×
104个/孔接种到六孔细胞培养板中，在37℃、5％co2培养箱中细胞培养24h，在无双抗、含10％fbs的dmem培养基中，转染按照脂质体转染试剂2000（购自于invitrogen公司）的说明书转染。
42.将阴性对照sirna-nc和实验组（sirna-chmp4c、sirna-hpv16 e6和sirna-hpv18 e6）分别进行转染。
43.3、qrt-pcr检测chmp4c、hpv16 e6和hpv18 e6基因的转录水平。
44.3.1细胞总rna的提取：1)当细胞达80-90％融合时终止培养，0.25％胰蛋白酶消化收集细胞于1.5ml ep管中，每管中加入lml trizol缓慢摇动破碎细胞，冰上放置10min；2)去蛋白，去dna：每个1.5ml ep管加入0.2ml三氯甲烷，摇晃15s，室温放置10min；3)4℃，12000rpm离心20min，将上层水相移到另一新的离心管中（注意不要吸到两层水相之间的蛋白物质），加入等体积的-20℃预冷的异丙醇，充分颠倒混匀，置于冰上20min；4)12000rpm高速离20 min后小心弃掉上清液，加入1ml75％depc乙醇洗涤沉淀，洗涤沉淀物，振荡混匀，4℃，7500rpm离心10min；5)弃去乙醇液体，室温下放置10min，加入depc水溶解沉淀；6)用nanodrop2000微量分光光度计测量rna纯度及浓度，冻存于-70℃冰箱。
45.3.2逆转录 步骤：1)反应体系和条件：第一步：残留基因组dna去除，反应条件42℃ 2min；
；第二步：逆转录反应体系配制（20ul体系），反应条件25℃ 5min，55℃ 15min，85℃ 5min；；2)聚合酶链反应：1)引物设计引物由擎科生物公司合成。具体引物序列如下：chmp4c基因：seq id no.1：正向引物为5
’‑ꢀ
gagaagccctggagaac
ꢀ‑3’
；seq id no.2：反向引物为5
’‑ꢀ
caccaaagccaaccc-3’;hpv16 e6基因：seq id no.9：正向引物为5
’‑ꢀ
gcaagcaacagttactgagacgt
ꢀ‑3’
；seq id no.10：反向引物为5
’‑ꢀ
gcaacaagacatacatcgaccgg-3’;hpv18 e6基因：seq id no.11：正向引物为5
’‑ꢀ
tggtgtatagagacagtatacccc
ꢀ‑3’
；seq id no.12：反向引物为5
’‑ꢀ
gcctctatagtgcccagctatgt-3’;3)按照表1配制20μl pcr反应体系：表1 pcr反应体系；4)pcr反应条件：95℃5min，(95℃ 15min，63℃ 30s)
×
40个循环。以sybr green作为荧光标记物，在steponeplus
tm
实时荧光定量pcr仪上进行pcr反应，δδct法进行相对定量，每个样进行3次重复实验。
46.5、统计学方法：
以18s rrna（引物序列：18s-f：cttagttggtggagcgatttgtc；18s-r：cggacatctaagggcatcaca）为内参，计算荧光定量rt-pcr的实验结果，采用spss18.0统计软件来进行统计分析，两者之间的差异采用t检验，以p《0.05具有统计学差异。实验都是按照重复3次来完成的，结果数据都是以平均值
±
标准差的方式来表示，采用spss18.0统计软件来进行统计分析的，干扰chmp4c、sirna-hpv16 e6和sirna-hpv18 e6基因表达组与对照组之间的差异采用t检验，认为当p《0.05时具有统计学意义。
47.6、结果：结果如图3显示，相比转染空载sirna-nc组，实验组中sirna-chmp4c、sirna-hpv16 e6和sirna-hpv18 e6能够分别显著降低chmp4c、hpv16 e6和hpv18 e6基因的表达，差异具有统计学意义(p《0.05)。
48.实施例3蛋白印迹法（western blotting）。
49.在siha和hela细胞中沉默chmp4c后检测下游蛋白的改变。hpv病毒感染是宫颈癌发生最主要的病因，病毒dna通过整合到宿主基因组中以编码致癌蛋白，例如e6，从而干扰细胞周期和凋亡，这是细胞转化和癌变的关键因素。为了确定chmp4c是否与宫颈hpv感染有关，可通过沉默e6检测chmp4c表达量是否改变。
50.1.细胞培养 ：将细胞按3
×
106/孔/接种于10cm盘，37℃，5％co2孵箱内孵育培养。
51.2.细胞转染：步骤同实施例2。
52.3.细胞总蛋白制备：1）转染48h后将培养皿置于冰上，弃去培养基，加入3ml pbs清洗细胞两遍，弃去pbs。再加入1ml pbs，使用细胞刮刀将细胞刮下，将细胞液移入1.5ml无酶ep管，置于4℃离心机中3000rpm/min离心5min；2）吸弃上清液，加入适量的ripa裂解液，用超声仪进行超声破碎。12000rpm/min离心5min，将上清液转移至新的无酶ep管中。
53.4.bca法测定蛋白浓度：使用酶标仪测定540nm处bca蛋白标准品和待测样品的吸光度值，根据标准曲线计算出待测样品的浓度，再定量30ug。
54.5.western免疫印迹：1）配制sds-page凝胶；2）sds-page凝胶电泳：准备电泳槽，将玻璃板安装至电泳槽内，内槽倒满1
×
电泳缓冲液，外槽倒入适量的的1
×
电泳缓冲液，以没过电阻丝为宜。以蛋白预染marker作为参照，上完样后设置恒压80v，当蛋白离开浓缩胶时，设置为恒压120v继续电泳，直到溴酚蓝指示带跑到分离胶的底部后停止电泳；3）转膜：电泳完毕后切下所需分离胶，无水甲醇激活pvdf膜。按顺序组装三明治结构，从正极到负极依次为阳极碳板一张海绵，两张滤纸，pvdf膜，分离胶，两张滤纸，一张海绵和阴极碳板。加入1
×
转膜液，然后将转膜槽置于冰块中，接通电源，设置恒流200a，转膜时间为100min；4）封闭：配制5%脱脂牛奶，将膜置于脱脂牛奶中，放在摇床上室温封闭1h；
5）一抗孵育：pvdf膜，用1
×
tbst清洗三遍，每次10min。配制好一抗，本实验中所需的抗体和配制浓度为：抗chmp4c（1:1500）的抗体，抗bcl-xl（1:2000）的抗体，抗bcl2（1:1000）的抗体，抗hpv16/18 e6(1:1000)的抗体，抗β-acting（1:5000）的抗体作为内参。然后根据目标蛋白的分子量和marker的位置裁出需要的膜，加入相应的一抗。置于摇床上4℃过夜；6）二抗孵育：第二天取出pvdf膜，用1
×
tbst清洗三次，每次10min。孵育二抗，抗兔igg抗体（1:5000），置于摇床上室温孵育2h。完毕后再用tbst洗膜三次，每次10min；7）ecl显影曝光：配制好ecl发光液，膜上滴加发光液进行曝光。
55.6.结果：结果如图4所示，与对照相比，转染sirna-chmp4c组chmp4c蛋白表达量降低。同时引起凋亡相关蛋白bcl2和bcl-xl表达量降低。而e6蛋白表达量的下降，引起chmp4c蛋白表达量降低。
56.实施例4 mtt试验检测siha和hela细胞增殖活性。
57.应用mtt(methyl thiazolyl tetrazolium，甲基噻唑基四唑)法检测chmp4c基因沉默后对siha和hela细胞增殖活性的影响。
58.1.细胞培养：将细胞按2
×
103/孔接种于96孔板，每孔100μl，37℃，5％co2孵箱内孵育培养。
59.2.细胞转染：步骤同实施例2。
60.3.mtt检测：1）分别于转染0h，24h，48h，72h时在96孔板中每孔加入20μl mtt（5mg/ml）溶液，然后置于孵箱中孵育4h；2）用移液枪小心吸弃孔内的液体，每孔加入150μl dmso。在酶联免疫仪上测490nm处的光吸收值，记录结果。
61.4. 以时间为横轴，光吸收值(od)为纵轴绘制细胞生长曲线。
62.5.结果：结果如图5（a、b）所示，与对照相比，转染sirna-chmp4c组的细胞增殖显著降低。
63.实施例5平板克隆试验。
64.应用平板克隆实验检测chmp4c基因沉默后对siha和hela细胞增殖活性的影响。
65.1.细胞培养 ：将细胞按500 /孔接种于6孔板，37℃，5％co2孵箱内孵育培养。
66.2.细胞转染：步骤同实施例2。
67.3.平板克隆实验：1）待形成肉眼可见的克隆，弃去培养基，加入pbs清洗两遍，然后加入1ml 4%多聚甲醛固定细胞15min；2）弃去多聚甲醛，加入1ml吉姆萨染液染色15min。用自来水冲洗细胞，风干后拍照，计数克隆个数。
68.4.结果：结果如图5（c、d）所示，与对照相比，转染sirna-chmp4c组的细胞克隆数显著降低。
69.实施例6细胞凋亡试验。
70.利用细胞凋亡实验检测chmp4c基因沉默后对siha和hela细胞凋亡水平的影响。
71.1.细胞培养：将细胞按3
×
105/孔/接种于6孔板，37℃，5％co2孵箱内孵育培养。
72.2.细胞转染：步骤同实施例2。
73.3.细胞凋亡试验：1）细胞转染48小时后取出6孔板，将孔内的培养基转移到5ml ep管中。细胞用不含edta的胰酶消化移入相应的ep管中，1500rpm/min离心5min；2）弃去上清液，加入pbs洗涤一遍细胞，离心后弃去上清液；3）实验组和对照组的细胞加入100μl1
×
binding buffer，5μl fitc和5μl pi重悬；空白对照组的空白管加入100μl 1
×
binding buffer；fitc单染管加入100μl 1
×
binding buffer和5μl fitc ；pi单染管加入100μl 1
×
binding buffer和5μl pi；4）检测之前再加入400μl 1
×
binding buffer进行稀释，最后用流式细胞仪检测凋亡细胞百分比。
74.4.结果：结果如图6所示，与对照相比，转染sirna-chmp4c组的细胞凋亡数增加。
75.实施例7 transwell细胞侵袭试验。
76.应用transwell细胞侵袭试验检测chmp4c基因沉默后对siha和hela细胞侵袭能力的影响。
77.1.小室制备：提前一晚将基质胶从-20℃冰箱移至4℃，保证基质胶充分水化。基质胶与预冷过的无血清培养基以1：15的比例稀释，取30μl均匀地铺于transwell小室的上室底，将24孔板置于37℃孵箱中4h至基质胶凝固。
78.2. transwell细胞侵袭试验：1）4
×
104个细胞悬于200μl无血清培养基中，缓慢加入上室，下室则加入600μl含10%胎牛血清的培养基。同时进行细胞转染，转染试剂按照1:3的比例分别加入上室和下室。置于37℃，5％co2孵箱中培养；2）48h后取出小室，浸于4%多聚甲醛固定细胞15min，然后置于结晶紫染液中染色15min。用棉签轻轻擦去上室上面的基质胶和非侵袭性细胞，室温晾干；3）用手术刀将上室底的膜切下来，进行树脂胶封片，待树脂胶凝固后置于在显微镜下拍照，利用image j软件计算穿过基质胶到达小室底的细胞数。
79.3.结果：结果如图7所示，与对照相比，转染sirna-chmp4c组穿过基质胶到达小室底的细胞数减少。
80.实施例8细胞划痕试验。
81.应用细胞划痕试验检测chmp4c基因沉默后对siha和hela细胞迁移能力的影响。
82.1.细胞培养：用marker笔在6孔板背后比着直尺，均匀地划2条横线。将细胞于6孔板，以过夜后长满为宜，37℃，5％co2孵箱内孵育培养。第二天弃去培养基，用200μl枪头比着直尺，保持枪头垂直于板底，划出垂直于背后横线的划痕。加入pbs清洗细胞3遍，尽量把划痕上残留的细胞清洗干净。
83.2.细胞转染：步骤同实施例2。
84.3.细胞划痕试验：在孵箱中分别培养0h，24h，48h后，置于显微镜下拍照。使用image j软件测量出各个时间段划痕的面积，计算迁移率的公式为：迁移率=（起始面积-终面积）/起始面积
×
100%。
85.4.结果：结果如图8所示，与对照相比，转染sirna-chmp4c组的细胞迁移率降低。
86.上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。