y染色体azf区域微缺失检测的方法、引物组合物及试剂盒
技术领域
1.本发明属于生物技术领域，涉及一种y染色体azf区域微缺失检测的方法、引物组合物及试剂盒。
背景技术：
2.据统计，目前约有15％的夫妇患有不孕不育症，其中因男性因素引起不育症中35％是由遗传因素造成，而y染色体微缺失是除克式综合征外男性不育的最主要遗传因素。
3.y染色长臂上具有三个无精子因子(azoopermia factor，azf)区域，y染色体微缺失主要发生在azf区，azf区包括azfa、azfb、azfc三个亚区，三个亚区中有许多与精子形成有关的基因。当三个亚区发生的完全缺失或部分缺失时，可引起男性精子发生障碍、少精、弱精甚至无精症状。在无精子症或严重少精子症患者中，azf微缺失的占比远远大于azf区总体缺失，其中常见的azf微缺失类型包括azfc区缺失(缺失率约80％)、azfbc区缺失(缺失率为1％～3％)、azfb区缺失(缺失率为1％～5％)和azfa区缺失(缺失率为0.5％～4％)。
4.目前，检测y染色体azf区微缺失的方法很多，包括多重pcr、实时荧光pcr、芯片杂交、mlpa等技术，最常用的是通过设计引物，采用多重pcr扩增的方式进行检测，例如中国发明专利cn105176992a公开了y染色体azf区微缺失检测引物，其虽然能够定性定量检测azf区域微缺失的情况，但是由于探针引物设计的局限性，该方法仍有以下缺点：
5.1.无法区分空白对照与y染色体缺失样本；
6.2.只能检测参照区域拷贝数为1个的情况；
7.3.部分区域探针设计不足，无法获得准确的检测信号值；
8.4.y染色体异质区域未设计探针，无法检测y染色体异质区缺失的情况。
9.因此，需要对现有的y染色体azf区域微缺失的检测方法进行优化，已解决上述问题。
技术实现要素：
10.本发明的目的在于设计一种y染色体azf区域微缺失检测的方法、引物组合物及试剂盒。
11.实现发明目的的技术方案如下：
12.第一方面，本发明提供了一种y染色体azf区域微缺失检测的引物组合物，引物组合物包括第一引物组合物、第二引物组合物、第三引物组合物、end引物。
13.其中，第一引物组合物依据至少1个常染色体上若干个特异性内参位点设计形成，第一引物组合物用于检测常染色体以确定标准拷贝数为1；
14.其中，第二引物组合物依据y染色体上至少1个特异性内参位点设计形成，第二引物组合物用于计算y染色体的拷贝数，并当y染色体的拷贝数≠1时，判断azf区域是否有缺失；
15.其中，第三引物组合物依据y染色体azf区的至少1个引物位点设计形成，第三引物
组合物用于计算y染色体的azf区域的分区拷贝数，并判断是否有缺失情况。
16.本发明通过对检测y染色体azf区域的引物进行设计，通过引入多个常染色的特异性内参位点设计引物，能够有效避免由于y染色体尤其是y染色体参照区域拷贝数≠1引起的检测错误。
17.在本发明的一个实施例中，设计上述第一引物组合物的常染色体的特异性内参位点包括：
18.1号染色体的特异性内参位点45477903＿45477962、249108698＿249108757；
19.2号染色体的特异性内参位点61272880＿61272939、149216358＿149216417、200298120＿200298179、242598528＿242598587；
20.3号染色体的特异性内参位点369895＿369954；
21.6号染色体的特异性内参位点112021399＿112021458；
22.7号染色体的特异性内参位点为73483036＿73483095；
23.8号染色体的特异性内参位点8998836＿8998895、61750747＿61750806、118849263＿118849322；
24.9号染色体的特异性内参位点140685330＿140685389；
25.11号染色体的特异性内参位点6412648＿6412707；
26.13号染色体的特异性内参位点20346558＿20346617；
27.16号染色体的特异性内参位点3828704＿3828763；
28.18号染色体的特异性内参位点47405456＿47405515、77227489_77227548、77798539_77798598、
29.20号染色体的特异性内参位点62575933＿62575992；
30.22号染色体的特异性内参位点17579669＿17579728、51115045_51115104。
31.依据上述常染色体的特异性内参位点设计第一引物组合物，包括seq idno：1～22内引物。
32.在本发明的一个实施例中，上述y染色体上特异性内参位点有10个，包括2653306－2653365、2655122－2655181、2655454－2655513、2657802－2657861、2721343－2721402、2827748－2827807、2837821－2837880、6739121－6739180、6858357－6858416、6936437－6936496。
33.依据y染色体上特异性内参位点设计所述第二引物组合物，包括seq idno：32～41内引物。
34.在本发明的一个实施例中，上述y染色体azf区内引物位点覆盖azfa区，以及azfbc区的y3y4、b5b6、u1、b、t、u2、u3、g、r、p1.2、grey亚区。
35.依据azfa区以及azfbc区的y3y4、b5b6、u1、b、t、u2、u3、g、r、p1.2、grey亚区内引物位点设计第三引物组合物，包括seq id no：42～204内引物。
36.在本发明的一个实施例中，上述引物组合物还包括第四引物组合物，第四引物组合物依据x染色体上至少1个特异性内参位点设计形成，第四引物组合物用于计算x染色体的拷贝数，并判断待测样本的性别及是否为克氏综合征。
37.进一步的，x染色体上的特异性内参位点有9个，包括18797229_18797288、24209340_24209399、24233830_24233889、70443549_70443608、77166300_77166359、
110644463_110644522、135827435_135827494、154130351_154130410、155172516_155172575。
38.依据特异性内参位点设计所述第四引物组合物，包括seq id no：23～31内引物。
39.第二方面，本发明提供了一种y染色体azf区域微缺失检测的试剂盒，包括第一方面的引物组合物，还包括通用pcr引物、dna聚合酶、dna连接酶、末端转移酶、dntps、反应缓冲液。
40.第三方面，本发明还提供了一种y染色体azf区域微缺失检测的方法，采用第一方面的引物组合物或第二方面的试剂盒判断y染色体azf区域微缺失情况，方法包括以下步骤：
41.对待测样本进行扩增反应；
42.基于测序文库对扩增后产物测序，获取测序数据并标记检测信号值；
43.统计并计算第一引物组合物的测序数据平均值，标记为检测信号值1，得常染色体特异性内参位点检测信号值；
44.统计并计算第三引物组合物内azfa区以及azfbc内各分区的测序数据平均值，得azfa区及各亚区的分检测信号值；依据公式计算得azfa区以及azfbc内各分区的拷贝数z－score；
45.统计并计算第二引物组合物的测序数据平均值，标记为检测信号值2，得y染色体特异性内参位点检测信号值；依据公式计算y染色体的拷贝数，并当用于当y染色体的拷贝数≠1时，判断azfa区以及azfbc内各分区是否有缺失。
46.本发明的方法通过常染色的检测信号，能够有效避免由于y染色体尤其是y染色体参照区域拷贝数≠1引起的检测错误。
47.进一步的，上述方法还包括统计并计算第四引物组合物的测序数据平均值，标记为检测信号值3，得x染色体特异性内参位点检测信号值；依据公式计算x染色体的拷贝数；
48.检测信号值3用于判断待测样本的性别及是否为克氏综合征。
49.本发明的y染色体azf区域微缺失检测的方法，能同时对x和y染色体提进行检测，在对y染色体azf微缺失检测的同时有效提示克式综合征。
50.进一步的，azfa区以及azfbc内各分区是否有缺失是基于欧式几何距离法和z
‑
score方法获得的，包括：
51.利用欧式几何距离判断样本检测类型，初步确定azfa区和azfbc各区检测拷贝数；
52.若azfa区或azfbc内某分区计算的拷贝数z－score≤3，则判断azfa区或azfbc内某分区检测信号值符合欧式几何距离判断的拷贝数，则判断该区域检测结果准确；
53.若azfa区或azfbc内某分区计算的拷贝数z－score＞3，则判断azfa区或azfbc内某分区检测信号值不符合欧式几何距离判断的拷贝数，则判断该区域检测结果不准确；
54.若判断检测结果不准确的分区数量＜3时，则azfa区以及azfbc内各分区是否有缺失的判断结果准确。
55.与现有技术相比，本发明的有益效果是：
56.1.本发明通过引入多个常染色的特异性内参位点，并设计引物对样本进行检测，能够有效避免由于y染色体尤其是y染色体参照区域拷贝数≠1引起的检测错误；同时通过对azf区域探针分布进行优化，降低引物波动引起的检测结果准确度的影响。
57.2.本发明的y染色体azf区域微缺失检测的方法，同时对x和y染色体提进行检测，在对y染色体azf微缺失检测的同时有效提示克式综合征。
具体实施方式
58.下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
59.在本实施例的描述中，需要理解的是，术语“中心”、“纵向”、“横向”、“上”、“下”、“前”、“后”、“左”、“右”、“竖直”、“水平”、“顶”、“底”、“内”、“外”等指示的方位或位置关系为基于所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本发明创造和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本发明创造的限制。
60.此外，术语“第一”、“第二”、“第三”等仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”等的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征。在本发明创造的描述中，除非另有说明，“多个”的含义是两个或两个以上。
61.实施例1：
62.本实施例提供了一种y染色体azf区域微缺失检测的引物组合物，引物组合物包括第一引物组合物、第二引物组合物、第三引物组合物、end引物。
63.其中，第一引物组合物依据至少1个常染色体上若干个特异性内参位点设计形成，第一引物组合物用于检测常染色体以确定标准拷贝数为1；
64.具体的，设计上述第一引物组合物的常染色体的特异性内参位点包括：
65.1号染色体的特异性内参位点45477903＿45477962、249108698＿249108757；
66.2号染色体的特异性内参位点61272880＿61272939、149216358＿149216417、200298120＿200298179、242598528＿242598587；
67.3号染色体的特异性内参位点369895＿369954；
68.6号染色体的特异性内参位点112021399＿112021458；
69.7号染色体的特异性内参位点为73483036＿73483095；
70.8号染色体的特异性内参位点8998836＿8998895、61750747＿61750806、118849263＿118849322；
71.9号染色体的特异性内参位点140685330＿140685389；
72.11号染色体的特异性内参位点6412648＿6412707；
73.13号染色体的特异性内参位点20346558＿20346617；
74.16号染色体的特异性内参位点3828704＿3828763；
75.18号染色体的特异性内参位点47405456＿47405515、77227489_77227548、77798539_77798598、
76.20号染色体的特异性内参位点62575933＿62575992；
77.22号染色体的特异性内参位点17579669＿17579728、51115045_51115104。
78.依据上述常染色体的特异性内参位点设计第一引物组合物，包括seq idno：1～22内引物。
79.其中，第二引物组合物依据y染色体上至少1个特异性内参位点设计形成，第二引物组合物用于计算y染色体的拷贝数，并当y染色体的拷贝数≠1时，判断azf区域是否有缺失。
80.具体的，y染色体上特异性内参位点有10个，包括2653306－2653365、2655122－2655181、2655454－2655513、2657802－2657861、2721343－2721402、2827748－2827807、2837821－2837880、6739121－6739180、6858357－6858416、6936437－6936496。依据y染色体上特异性内参位点设计所述第二引物组合物，包括seq id no：32～41内引物。
81.其中，第三引物组合物依据y染色体azf区的至少1个引物位点设计形成，第三引物组合物用于计算y染色体的azf区域的分区拷贝数，并判断是否有缺失情况。
82.具体的，y染色体azf区内引物位点覆盖azfa区，以及azfbc区的y3y4、b5b6、u1、b、t、u2、u3、g、r、p1.2、grey亚区。
83.依据azfa区以及azfbc区的y3y4、b5b6、u1、b、t、u2、u3、g、r、p1.2、grey亚区内引物位点设计第三引物组合物，包括seq id no：42～204内引物。
84.实施例2：
85.本实施例提供了另一种y染色体azf区域微缺失检测的引物组合物，本实施例与实施例1的区别在于，本实施例的引物组合物在包括第一引物组合物、第二引物组合物、第三引物组合物、end引物的基础上，还包括第四引物组合物。
86.其中，本实施例的第一引物组合物、第二引物组合物、第三引物组合物、end引物与实施例1中的相同，在此不再进行赘述。
87.其中，第四引物组合物依据x染色体上至少1个特异性内参位点设计形成，第四引物组合物用于计算x染色体的拷贝数，并判断待测样本的性别及是否为克氏综合征。
88.具体的，x染色体上的特异性内参位点有9个，包括18797229＿18797288、24209340_24209399、24233830_24233889、70443549_70443608、77166300_77166359、110644463_110644522、135827435_135827494、154130351_154130410、155172516_155172575。依据特异性内参位点设计所述第四引物组合物，包括seq id no：23～31内引物。
89.需要说明的是，实施例1和实施例2中依据每一个位点设计的引物，可以将其引物划分为上游引物、中游引物、下游引物三个引物段，将引物划分为三个引物段，其可以有效提高序列捕获的准确度和灵敏度，降低相似序列对检测的干扰。具体的，每一条引物段的长度范围为15～35bp，择优选择长度为20bp。例如，实施例1和实施例2中每条引物的总长度均为60bp，经对引物以三段式划分，每一条引物的上游引物、中游引物、下游引物三个引物段的长度均为20bp。
90.实施例3：
91.本实施例提供了一种y染色体azf区域微缺失检测的试剂盒，包括实施例1或实施例2的引物组合物，还包括通用pcr引物、dna聚合酶、dna连接酶、末端转移酶、dntps、反应缓冲液。
92.其中，引物组合物用于对待测样本进行扩增，获得扩增产物，通用pcr引物、dna聚合酶、dna连接酶、末端转移酶、dntps、反应缓冲液为常用试剂，在此不再对其一一进行说明。
93.实施例4：
94.本具体实施方式提供了一种y染色体azf区域微缺失检测的方法，采用实施例1或实施例2的引物组合物，或者采用实施例3的试剂盒对待测样本进行处理。
95.具体的，y染色体azf区域微缺失检测的方法包括以下步骤：
96.s1、对待测样本进行扩增反应。
97.具体的，本步骤中，通过实施例1或实施例2的引物组合物，或实施例3的试剂盒对待测样本进行dna标记、杂交、连接、pcr扩增和文库富集，然后使用miseq dx桌面型测序仪的miseq dx模式对样本进行测序。
98.s2、基于测序文库对扩增后产物测序，获取测序数据并标记检测信号值；
99.s201、统计并计算第一引物组合物的测序数据平均值，标记为检测信号值1，得常染色体特异性内参位点检测信号值。
100.s202、统计并计算第三引物组合物内azfa区以及azfbc内各分区的测序数据平均值，得azfa区及各亚区的分检测信号值；依据公式计算得azfa区以及azfbc内各分区的拷贝数z－score；
101.s203、统计并计算第二引物组合物的测序数据平均值，标记为检测信号值2，得y染色体特异性内参位点检测信号值；依据公式计算y染色体的拷贝数，并当用于当y染色体的拷贝数≠1时，判断azfa区以及azfbc内各分区是否有缺失。
102.实施例5：
103.本具体实施方式提供的y染色体azf区域微缺失检测的方法，是在实施例4的方法的基础上进行改进的，由于。
104.因此，y染色体azf区域微缺失检测的方法除实施例4的步骤外，还包括：
105.s204、统计并计算第四引物组合物的测序数据平均值，标记为检测信号值3，得x染色体特异性内参位点检测信号值；依据公式计算x染色体的拷贝数；检测信号值3用于判断待测样本的性别及是否为克氏综合征。
106.需要说明的是，实施例4和实施例5的方法中，通过对获得各个检测信号值的分析，即azfa区以及azfbc内各分区是否有缺失是基于欧式几何距离法和z
‑
score方法获得的，包括：
107.利用欧式几何距离判断样本检测类型，初步确定azfa区和azfbc各区检测拷贝数；
108.若azfa区或azfbc内某分区计算的拷贝数z－score≤3，则判断azfa区或azfbc内某分区检测信号值符合欧式几何距离判断的拷贝数，则判断该区域检测结果准确；
109.根据拉依达准则，若数据值超出3个标准差即z
‑
score大于3时，则不属于随机误差，因此若azfa区或azfbc内某分区计算的拷贝数z－score＞3，则判断azfa区或azfbc内某分区检测信号值不符合欧式几何距离判断的拷贝数，则判断该区域检测结果不准确；
110.若判断检测结果不准确的分区数量＜3时，则azfa区以及azfbc内各分区是否有缺失的判断结果准确，否则azfa区以及azfbc内各分区是否有缺失的判断结果不准确，将其修改为未知(unknown)。
111.若azfa区或azfbc内某分区计算的拷贝数在检测拷贝数z－score≤3，则判断azfa区或azfbc内某分区检测结果准确；
112.若azfa区或azfbc内某分区计算的拷贝数z－score＞3，则判断azfa区或azfbc内某分区检测结果不准确；
113.若判断检测结果不准确的分区数量超过低于3个软件判断结果准确，否则软件判断结果修改为unknown。
114.以下通过样本1～样本5对本发明的y染色体azf区域微缺失检测方法进行说明：
115.首先，采用实施例1或实施例2的引物组合物，或实施例3的试剂盒对样本1～样本＊的dna进行扩增，获得扩增产物；
116.其次，对样本1～样本＊的扩增产物测序获取测序数据，并标记检测信号值，包括：
117.获取第一引物组合物中各个常染色体对应的测序数据信号值，并求取平均值得检测信号值1；
118.获取第二引物组合物的各引物的测序数据信号值，并求取测序数据平均值，得检测信号值2，依据公式计算y染色体的拷贝数；
119.获取第三引物组合物内azfa区以及azfbc内各分区内各引物的测序数据信号值，并分别求取测序数据平均值，获得azfa区以及azfbc内各分区的分检测信号值；依据公式计算得azfa区以及azfbc内各分区的拷贝数z－score；
120.获取第四引物组合物的各引物的测序数据信号值，求取测序数据平均值，得检测信号值3，依据公式计算x染色体的拷贝数。
121.最后，采用欧式几何距离法和z
‑
score方法对计算的数据进行分析，得出y染色体azf区域微缺失检测的结果。
122.上述样本1～样本5的计算及检测结果如下表所示：
[0123] 样本1样本2样本3样本4样本5检测信号值111111检测信号值20.9511.0010.9961.0210.954y染色体的拷贝数11111检测信号值30.9821.0630.9691.0390.999x染色体的拷贝数11111azfa区0.9310.9940.9160.120.964
azfa区拷贝数11101y3y41.7711.91.7472.0141.761y3y4拷贝数22222b5b61.9071.9152.2292.0231.845b5b6拷贝数22222u10.9310.950.9121.0460.947u1拷贝数11111b3.352.7712.4234.0651.745b拷贝数43342t1.6661.6721.6461.9851.641t拷贝数22222u20.8310.9590.8810.9990.878u2拷贝数11111u30.9250.970.0031.0610.005u3拷贝数11010g2.6211.8550.8853.0430.006g拷贝数32130r3.92.0142.0364.2490.008r拷贝数42240grey1.8441.0131.7712.1230.892grey拷贝数21221p1.21.7380.9110.7972.0270.004p1.2拷贝数21120结论正常gr/gr缺失b2/b3缺失azfa缺失b2/b4缺失
[0124]
分析：通过本发明的方法对5个样本进行测试，其测试结果与现有的方法的检测结果相同，说明本发明的方法是正确可信的。
[0125]
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
[0126]
此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。
技术领域
1.本发明属于生物技术领域，涉及一种y染色体azf区域微缺失检测的方法、引物组合物及试剂盒。
背景技术：
2.据统计，目前约有15％的夫妇患有不孕不育症，其中因男性因素引起不育症中35％是由遗传因素造成，而y染色体微缺失是除克式综合征外男性不育的最主要遗传因素。
3.y染色长臂上具有三个无精子因子(azoopermia factor，azf)区域，y染色体微缺失主要发生在azf区，azf区包括azfa、azfb、azfc三个亚区，三个亚区中有许多与精子形成有关的基因。当三个亚区发生的完全缺失或部分缺失时，可引起男性精子发生障碍、少精、弱精甚至无精症状。在无精子症或严重少精子症患者中，azf微缺失的占比远远大于azf区总体缺失，其中常见的azf微缺失类型包括azfc区缺失(缺失率约80％)、azfbc区缺失(缺失率为1％～3％)、azfb区缺失(缺失率为1％～5％)和azfa区缺失(缺失率为0.5％～4％)。
4.目前，检测y染色体azf区微缺失的方法很多，包括多重pcr、实时荧光pcr、芯片杂交、mlpa等技术，最常用的是通过设计引物，采用多重pcr扩增的方式进行检测，例如中国发明专利cn105176992a公开了y染色体azf区微缺失检测引物，其虽然能够定性定量检测azf区域微缺失的情况，但是由于探针引物设计的局限性，该方法仍有以下缺点：
5.1.无法区分空白对照与y染色体缺失样本；
6.2.只能检测参照区域拷贝数为1个的情况；
7.3.部分区域探针设计不足，无法获得准确的检测信号值；
8.4.y染色体异质区域未设计探针，无法检测y染色体异质区缺失的情况。
9.因此，需要对现有的y染色体azf区域微缺失的检测方法进行优化，已解决上述问题。
技术实现要素：
10.本发明的目的在于设计一种y染色体azf区域微缺失检测的方法、引物组合物及试剂盒。
11.实现发明目的的技术方案如下：
12.第一方面，本发明提供了一种y染色体azf区域微缺失检测的引物组合物，引物组合物包括第一引物组合物、第二引物组合物、第三引物组合物、end引物。
13.其中，第一引物组合物依据至少1个常染色体上若干个特异性内参位点设计形成，第一引物组合物用于检测常染色体以确定标准拷贝数为1；
14.其中，第二引物组合物依据y染色体上至少1个特异性内参位点设计形成，第二引物组合物用于计算y染色体的拷贝数，并当y染色体的拷贝数≠1时，判断azf区域是否有缺失；
15.其中，第三引物组合物依据y染色体azf区的至少1个引物位点设计形成，第三引物
组合物用于计算y染色体的azf区域的分区拷贝数，并判断是否有缺失情况。
16.本发明通过对检测y染色体azf区域的引物进行设计，通过引入多个常染色的特异性内参位点设计引物，能够有效避免由于y染色体尤其是y染色体参照区域拷贝数≠1引起的检测错误。
17.在本发明的一个实施例中，设计上述第一引物组合物的常染色体的特异性内参位点包括：
18.1号染色体的特异性内参位点45477903＿45477962、249108698＿249108757；
19.2号染色体的特异性内参位点61272880＿61272939、149216358＿149216417、200298120＿200298179、242598528＿242598587；
20.3号染色体的特异性内参位点369895＿369954；
21.6号染色体的特异性内参位点112021399＿112021458；
22.7号染色体的特异性内参位点为73483036＿73483095；
23.8号染色体的特异性内参位点8998836＿8998895、61750747＿61750806、118849263＿118849322；
24.9号染色体的特异性内参位点140685330＿140685389；
25.11号染色体的特异性内参位点6412648＿6412707；
26.13号染色体的特异性内参位点20346558＿20346617；
27.16号染色体的特异性内参位点3828704＿3828763；
28.18号染色体的特异性内参位点47405456＿47405515、77227489_77227548、77798539_77798598、
29.20号染色体的特异性内参位点62575933＿62575992；
30.22号染色体的特异性内参位点17579669＿17579728、51115045_51115104。
31.依据上述常染色体的特异性内参位点设计第一引物组合物，包括seq idno：1～22内引物。
32.在本发明的一个实施例中，上述y染色体上特异性内参位点有10个，包括2653306－2653365、2655122－2655181、2655454－2655513、2657802－2657861、2721343－2721402、2827748－2827807、2837821－2837880、6739121－6739180、6858357－6858416、6936437－6936496。
33.依据y染色体上特异性内参位点设计所述第二引物组合物，包括seq idno：32～41内引物。
34.在本发明的一个实施例中，上述y染色体azf区内引物位点覆盖azfa区，以及azfbc区的y3y4、b5b6、u1、b、t、u2、u3、g、r、p1.2、grey亚区。
35.依据azfa区以及azfbc区的y3y4、b5b6、u1、b、t、u2、u3、g、r、p1.2、grey亚区内引物位点设计第三引物组合物，包括seq id no：42～204内引物。
36.在本发明的一个实施例中，上述引物组合物还包括第四引物组合物，第四引物组合物依据x染色体上至少1个特异性内参位点设计形成，第四引物组合物用于计算x染色体的拷贝数，并判断待测样本的性别及是否为克氏综合征。
37.进一步的，x染色体上的特异性内参位点有9个，包括18797229_18797288、24209340_24209399、24233830_24233889、70443549_70443608、77166300_77166359、
110644463_110644522、135827435_135827494、154130351_154130410、155172516_155172575。
38.依据特异性内参位点设计所述第四引物组合物，包括seq id no：23～31内引物。
39.第二方面，本发明提供了一种y染色体azf区域微缺失检测的试剂盒，包括第一方面的引物组合物，还包括通用pcr引物、dna聚合酶、dna连接酶、末端转移酶、dntps、反应缓冲液。
40.第三方面，本发明还提供了一种y染色体azf区域微缺失检测的方法，采用第一方面的引物组合物或第二方面的试剂盒判断y染色体azf区域微缺失情况，方法包括以下步骤：
41.对待测样本进行扩增反应；
42.基于测序文库对扩增后产物测序，获取测序数据并标记检测信号值；
43.统计并计算第一引物组合物的测序数据平均值，标记为检测信号值1，得常染色体特异性内参位点检测信号值；
44.统计并计算第三引物组合物内azfa区以及azfbc内各分区的测序数据平均值，得azfa区及各亚区的分检测信号值；依据公式计算得azfa区以及azfbc内各分区的拷贝数z－score；
45.统计并计算第二引物组合物的测序数据平均值，标记为检测信号值2，得y染色体特异性内参位点检测信号值；依据公式计算y染色体的拷贝数，并当用于当y染色体的拷贝数≠1时，判断azfa区以及azfbc内各分区是否有缺失。
46.本发明的方法通过常染色的检测信号，能够有效避免由于y染色体尤其是y染色体参照区域拷贝数≠1引起的检测错误。
47.进一步的，上述方法还包括统计并计算第四引物组合物的测序数据平均值，标记为检测信号值3，得x染色体特异性内参位点检测信号值；依据公式计算x染色体的拷贝数；
48.检测信号值3用于判断待测样本的性别及是否为克氏综合征。
49.本发明的y染色体azf区域微缺失检测的方法，能同时对x和y染色体提进行检测，在对y染色体azf微缺失检测的同时有效提示克式综合征。
50.进一步的，azfa区以及azfbc内各分区是否有缺失是基于欧式几何距离法和z
‑
score方法获得的，包括：
51.利用欧式几何距离判断样本检测类型，初步确定azfa区和azfbc各区检测拷贝数；
52.若azfa区或azfbc内某分区计算的拷贝数z－score≤3，则判断azfa区或azfbc内某分区检测信号值符合欧式几何距离判断的拷贝数，则判断该区域检测结果准确；
53.若azfa区或azfbc内某分区计算的拷贝数z－score＞3，则判断azfa区或azfbc内某分区检测信号值不符合欧式几何距离判断的拷贝数，则判断该区域检测结果不准确；
54.若判断检测结果不准确的分区数量＜3时，则azfa区以及azfbc内各分区是否有缺失的判断结果准确。
55.与现有技术相比，本发明的有益效果是：
56.1.本发明通过引入多个常染色的特异性内参位点，并设计引物对样本进行检测，能够有效避免由于y染色体尤其是y染色体参照区域拷贝数≠1引起的检测错误；同时通过对azf区域探针分布进行优化，降低引物波动引起的检测结果准确度的影响。
57.2.本发明的y染色体azf区域微缺失检测的方法，同时对x和y染色体提进行检测，在对y染色体azf微缺失检测的同时有效提示克式综合征。
具体实施方式
58.下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
59.在本实施例的描述中，需要理解的是，术语“中心”、“纵向”、“横向”、“上”、“下”、“前”、“后”、“左”、“右”、“竖直”、“水平”、“顶”、“底”、“内”、“外”等指示的方位或位置关系为基于所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本发明创造和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本发明创造的限制。
60.此外，术语“第一”、“第二”、“第三”等仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”等的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征。在本发明创造的描述中，除非另有说明，“多个”的含义是两个或两个以上。
61.实施例1：
62.本实施例提供了一种y染色体azf区域微缺失检测的引物组合物，引物组合物包括第一引物组合物、第二引物组合物、第三引物组合物、end引物。
63.其中，第一引物组合物依据至少1个常染色体上若干个特异性内参位点设计形成，第一引物组合物用于检测常染色体以确定标准拷贝数为1；
64.具体的，设计上述第一引物组合物的常染色体的特异性内参位点包括：
65.1号染色体的特异性内参位点45477903＿45477962、249108698＿249108757；
66.2号染色体的特异性内参位点61272880＿61272939、149216358＿149216417、200298120＿200298179、242598528＿242598587；
67.3号染色体的特异性内参位点369895＿369954；
68.6号染色体的特异性内参位点112021399＿112021458；
69.7号染色体的特异性内参位点为73483036＿73483095；
70.8号染色体的特异性内参位点8998836＿8998895、61750747＿61750806、118849263＿118849322；
71.9号染色体的特异性内参位点140685330＿140685389；
72.11号染色体的特异性内参位点6412648＿6412707；
73.13号染色体的特异性内参位点20346558＿20346617；
74.16号染色体的特异性内参位点3828704＿3828763；
75.18号染色体的特异性内参位点47405456＿47405515、77227489_77227548、77798539_77798598、
76.20号染色体的特异性内参位点62575933＿62575992；
77.22号染色体的特异性内参位点17579669＿17579728、51115045_51115104。
78.依据上述常染色体的特异性内参位点设计第一引物组合物，包括seq idno：1～22内引物。
79.其中，第二引物组合物依据y染色体上至少1个特异性内参位点设计形成，第二引物组合物用于计算y染色体的拷贝数，并当y染色体的拷贝数≠1时，判断azf区域是否有缺失。
80.具体的，y染色体上特异性内参位点有10个，包括2653306－2653365、2655122－2655181、2655454－2655513、2657802－2657861、2721343－2721402、2827748－2827807、2837821－2837880、6739121－6739180、6858357－6858416、6936437－6936496。依据y染色体上特异性内参位点设计所述第二引物组合物，包括seq id no：32～41内引物。
81.其中，第三引物组合物依据y染色体azf区的至少1个引物位点设计形成，第三引物组合物用于计算y染色体的azf区域的分区拷贝数，并判断是否有缺失情况。
82.具体的，y染色体azf区内引物位点覆盖azfa区，以及azfbc区的y3y4、b5b6、u1、b、t、u2、u3、g、r、p1.2、grey亚区。
83.依据azfa区以及azfbc区的y3y4、b5b6、u1、b、t、u2、u3、g、r、p1.2、grey亚区内引物位点设计第三引物组合物，包括seq id no：42～204内引物。
84.实施例2：
85.本实施例提供了另一种y染色体azf区域微缺失检测的引物组合物，本实施例与实施例1的区别在于，本实施例的引物组合物在包括第一引物组合物、第二引物组合物、第三引物组合物、end引物的基础上，还包括第四引物组合物。
86.其中，本实施例的第一引物组合物、第二引物组合物、第三引物组合物、end引物与实施例1中的相同，在此不再进行赘述。
87.其中，第四引物组合物依据x染色体上至少1个特异性内参位点设计形成，第四引物组合物用于计算x染色体的拷贝数，并判断待测样本的性别及是否为克氏综合征。
88.具体的，x染色体上的特异性内参位点有9个，包括18797229＿18797288、24209340_24209399、24233830_24233889、70443549_70443608、77166300_77166359、110644463_110644522、135827435_135827494、154130351_154130410、155172516_155172575。依据特异性内参位点设计所述第四引物组合物，包括seq id no：23～31内引物。
89.需要说明的是，实施例1和实施例2中依据每一个位点设计的引物，可以将其引物划分为上游引物、中游引物、下游引物三个引物段，将引物划分为三个引物段，其可以有效提高序列捕获的准确度和灵敏度，降低相似序列对检测的干扰。具体的，每一条引物段的长度范围为15～35bp，择优选择长度为20bp。例如，实施例1和实施例2中每条引物的总长度均为60bp，经对引物以三段式划分，每一条引物的上游引物、中游引物、下游引物三个引物段的长度均为20bp。
90.实施例3：
91.本实施例提供了一种y染色体azf区域微缺失检测的试剂盒，包括实施例1或实施例2的引物组合物，还包括通用pcr引物、dna聚合酶、dna连接酶、末端转移酶、dntps、反应缓冲液。
92.其中，引物组合物用于对待测样本进行扩增，获得扩增产物，通用pcr引物、dna聚合酶、dna连接酶、末端转移酶、dntps、反应缓冲液为常用试剂，在此不再对其一一进行说明。
93.实施例4：
94.本具体实施方式提供了一种y染色体azf区域微缺失检测的方法，采用实施例1或实施例2的引物组合物，或者采用实施例3的试剂盒对待测样本进行处理。
95.具体的，y染色体azf区域微缺失检测的方法包括以下步骤：
96.s1、对待测样本进行扩增反应。
97.具体的，本步骤中，通过实施例1或实施例2的引物组合物，或实施例3的试剂盒对待测样本进行dna标记、杂交、连接、pcr扩增和文库富集，然后使用miseq dx桌面型测序仪的miseq dx模式对样本进行测序。
98.s2、基于测序文库对扩增后产物测序，获取测序数据并标记检测信号值；
99.s201、统计并计算第一引物组合物的测序数据平均值，标记为检测信号值1，得常染色体特异性内参位点检测信号值。
100.s202、统计并计算第三引物组合物内azfa区以及azfbc内各分区的测序数据平均值，得azfa区及各亚区的分检测信号值；依据公式计算得azfa区以及azfbc内各分区的拷贝数z－score；
101.s203、统计并计算第二引物组合物的测序数据平均值，标记为检测信号值2，得y染色体特异性内参位点检测信号值；依据公式计算y染色体的拷贝数，并当用于当y染色体的拷贝数≠1时，判断azfa区以及azfbc内各分区是否有缺失。
102.实施例5：
103.本具体实施方式提供的y染色体azf区域微缺失检测的方法，是在实施例4的方法的基础上进行改进的，由于。
104.因此，y染色体azf区域微缺失检测的方法除实施例4的步骤外，还包括：
105.s204、统计并计算第四引物组合物的测序数据平均值，标记为检测信号值3，得x染色体特异性内参位点检测信号值；依据公式计算x染色体的拷贝数；检测信号值3用于判断待测样本的性别及是否为克氏综合征。
106.需要说明的是，实施例4和实施例5的方法中，通过对获得各个检测信号值的分析，即azfa区以及azfbc内各分区是否有缺失是基于欧式几何距离法和z
‑
score方法获得的，包括：
107.利用欧式几何距离判断样本检测类型，初步确定azfa区和azfbc各区检测拷贝数；
108.若azfa区或azfbc内某分区计算的拷贝数z－score≤3，则判断azfa区或azfbc内某分区检测信号值符合欧式几何距离判断的拷贝数，则判断该区域检测结果准确；
109.根据拉依达准则，若数据值超出3个标准差即z
‑
score大于3时，则不属于随机误差，因此若azfa区或azfbc内某分区计算的拷贝数z－score＞3，则判断azfa区或azfbc内某分区检测信号值不符合欧式几何距离判断的拷贝数，则判断该区域检测结果不准确；
110.若判断检测结果不准确的分区数量＜3时，则azfa区以及azfbc内各分区是否有缺失的判断结果准确，否则azfa区以及azfbc内各分区是否有缺失的判断结果不准确，将其修改为未知(unknown)。
111.若azfa区或azfbc内某分区计算的拷贝数在检测拷贝数z－score≤3，则判断azfa区或azfbc内某分区检测结果准确；
112.若azfa区或azfbc内某分区计算的拷贝数z－score＞3，则判断azfa区或azfbc内某分区检测结果不准确；
113.若判断检测结果不准确的分区数量超过低于3个软件判断结果准确，否则软件判断结果修改为unknown。
114.以下通过样本1～样本5对本发明的y染色体azf区域微缺失检测方法进行说明：
115.首先，采用实施例1或实施例2的引物组合物，或实施例3的试剂盒对样本1～样本＊的dna进行扩增，获得扩增产物；
116.其次，对样本1～样本＊的扩增产物测序获取测序数据，并标记检测信号值，包括：
117.获取第一引物组合物中各个常染色体对应的测序数据信号值，并求取平均值得检测信号值1；
118.获取第二引物组合物的各引物的测序数据信号值，并求取测序数据平均值，得检测信号值2，依据公式计算y染色体的拷贝数；
119.获取第三引物组合物内azfa区以及azfbc内各分区内各引物的测序数据信号值，并分别求取测序数据平均值，获得azfa区以及azfbc内各分区的分检测信号值；依据公式计算得azfa区以及azfbc内各分区的拷贝数z－score；
120.获取第四引物组合物的各引物的测序数据信号值，求取测序数据平均值，得检测信号值3，依据公式计算x染色体的拷贝数。
121.最后，采用欧式几何距离法和z
‑
score方法对计算的数据进行分析，得出y染色体azf区域微缺失检测的结果。
122.上述样本1～样本5的计算及检测结果如下表所示：
[0123] 样本1样本2样本3样本4样本5检测信号值111111检测信号值20.9511.0010.9961.0210.954y染色体的拷贝数11111检测信号值30.9821.0630.9691.0390.999x染色体的拷贝数11111azfa区0.9310.9940.9160.120.964
azfa区拷贝数11101y3y41.7711.91.7472.0141.761y3y4拷贝数22222b5b61.9071.9152.2292.0231.845b5b6拷贝数22222u10.9310.950.9121.0460.947u1拷贝数11111b3.352.7712.4234.0651.745b拷贝数43342t1.6661.6721.6461.9851.641t拷贝数22222u20.8310.9590.8810.9990.878u2拷贝数11111u30.9250.970.0031.0610.005u3拷贝数11010g2.6211.8550.8853.0430.006g拷贝数32130r3.92.0142.0364.2490.008r拷贝数42240grey1.8441.0131.7712.1230.892grey拷贝数21221p1.21.7380.9110.7972.0270.004p1.2拷贝数21120结论正常gr/gr缺失b2/b3缺失azfa缺失b2/b4缺失
[0124]
分析：通过本发明的方法对5个样本进行测试，其测试结果与现有的方法的检测结果相同，说明本发明的方法是正确可信的。
[0125]
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
[0126]
此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。
再多了解一些
本文用于企业家、创业者技术爱好者查询，结果仅供参考。
