用于检测膀胱癌的组合物及其试剂盒和应用的制作方法

1.本发明属于生物技术领域，涉及一种组合物及其在疾病检测中的用途，具体地涉及一种用于检测膀胱癌的组合物及其相应的试剂盒和应用。


背景技术：

2.膀胱癌(bladdercancer，bc)是指发生在膀胱黏膜上的恶性肿瘤，是一种常见的泌尿系统肿瘤疾病，也是全身十大常见肿瘤之一，占我国泌尿生殖系肿瘤发病率的首位，也是引起泌尿系统肿瘤患者死亡的第二大肿瘤。膀胱癌可发生于任何年龄，多发生于50岁以上，发病率随年龄增长呈增加趋势，男性发病率为女性的3-4倍。膀胱癌根据治疗模式及疾病预后的不同可分为非肌层沼泽性膀胱癌(nmibc)和肌层浸润性膀胱癌(mibc)，按组织来源可分为膀胱尿路上皮癌、膀胱鳞癌、膀胱腺癌等，其中膀胱尿路上皮癌占90％以上。膀胱癌最常见的临床特征为肉眼可见无痛性血尿，同时常伴有尿频、尿急、尿痛等刺激症状。膀胱癌治疗效果与临床分期密切相关，早期癌膀胱癌通常有较好的预后，尽早发现膀胱癌可增加手术保留膀胱的机会，提高总体生存率，早诊早治是提高治愈率的关键，同时膀胱癌的复发率为50％-70％，居所有实体瘤的首位，其中10-20％的复发患者会发展为浸润性膀胱癌，因此预后监控亦要引起重视，如何尽早发现膀胱肿瘤以及术后如何及时检测到膀胱肿瘤的复发具有非常重要的临床意义。
3.目前针对膀胱的检查方法主要有尿液检查、影像学检查、膀胱镜检查等，尿液检查中，尿常规检查可早期发现镜下血尿，尿脱落细胞检查可检测肿瘤细胞，但两者检测灵敏度低，易于漏检早期肿瘤；影像学检查包括超声检查、x线造影、ct等，其中超声检查广泛用于膀胱癌的诊断与血尿患者的筛查，ct尿路造影对于评估疾病分期有着不可替代的作用，但此类方法对较小的肿瘤不够灵敏，无法进行明确诊断；膀胱镜检查是目前诊断膀胱癌的可靠方法，活检病理结果是诊断膀胱癌的金标准，膀胱镜通过尿路进入膀胱，进行可视化观察，发现早期肿瘤并取样活检，但方法是一种有创操作，对需要长期跟踪观察的患者，会造成身体不适，且经济负担较重。因此有必要开发一种无创的可靠的新型膀胱癌标识物和检测技术，提高膀胱癌早癌检出率，改善膀胱癌治疗效果，降低膀胱癌死亡率。
4.表观遗传学是近年来肿瘤研究的热点领域，dna的甲基化、组蛋白修饰、染色质重塑以及非编码rna调控等表观遗传学改变都被认为与肿瘤的发生有着密切关系，其中dna的甲基化是最为常见的表观遗传学改变，其可调控细胞增殖、凋亡与分化，且水平与肿瘤的生物学特性密切相关。目前研究表明膀胱癌与其他多种癌症一样，是由多种致癌因素长期作用的结果，其病变过程是一个多基因变异累积的复杂过程，涉及多种癌基因和抑癌基因的异常甲基化，其中大多数异常甲基化为抑癌基因的高甲基化，高甲基化往往导致抑癌基因的转录沉默。dna甲基化异常通常发生在癌症早期，并贯穿癌症的发生和发展过程，其甲基化状态一旦形成需要受到外界环境较长时间的持续刺激才会发生改变，因此dna甲基化指标的检测可以作为癌症诊断、早期筛查以及预后的重要生物指标。
5.针对dna甲基化检测方法大致可分为两类：全基因组甲基化分析和特异位点甲基
化检测。全基因组甲基化分析检测成本较高，常作为一种高通量的筛选发现目标基因的手段；特异位点甲基化检测方法有联合亚硫酸氢钠的限制性内切酶分析法(cobra)、甲基化特异性pcr法(msp)、甲基化荧光定量法(methylight)、甲基化敏感性高分辨率熔解曲线分析法等，限制性内切酶分析法只能获得特殊酶切位点的甲基化情况，甲基化特异性pcr法基于普通pcr及电泳分析操作繁琐且易造成样品污染，甲基化敏感性高分辨率熔解曲线分析法对仪器要求较高，需要带高分辨率熔解(hrm)模块的荧光定量pcr仪，甲基化荧光定量法基于其高通量和高灵敏性，且无需在pcr后电泳、杂交等操作，减少了污染和操作误差，在dna甲基化的检测中应用广泛。目前基于甲基化荧光定量法检测膀胱癌dna甲基化方法中针对单个基因的检测精准度未如理想，诊断效果有限，研究者常通过组合多个基因的联合检测来提高检测灵敏度，但多基因联合检测可能会导致特异性的降低，同时若采用单管单基因测试的方式进行检测，需要消耗较多的试剂，增加实验人员的操作，实验成本较高。
6.因此，市场迫切需要开发一种稳定可靠且具有高灵敏度与特异性的无创的膀胱癌检测方法。


技术实现要素：

7.有鉴于此，本发明提供用于检测膀胱癌的组合物及其试剂盒和应用，采用亚硫酸氢盐修饰法对待测膀胱癌核酸样品进行亚硫酸氢盐转化，结合荧光定量pcr技术，综合分析文献研究结果、tcga甲基化芯片数据库以及转录组测序表达谱，通过多重数据过滤分析，筛选膀胱癌高甲基化候选基因，针对膀胱癌高甲基化候选基因上的多个甲基化检测位点设计特异性的基因甲基化检测引物和探针，覆盖10个以上甲基化cpg位点，通过多重pcr扩增技术扩增经亚硫酸氢盐修饰的待测dna样品，根据pcr扩增结果来确定待测样品中目标基因的甲基化情况，通过多种途径提高试剂盒的灵敏度与特异性，实现膀胱癌的早期筛查与诊断。
8.为达到上述目的，本发明第一方面提供膀胱癌基因甲基化检测位点，所述的基因甲基化检测位点包括ecrg4、tmeff2、twist1中的一种或多种。
9.本发明第二方面提供膀胱癌基因甲基化检测的pcr引物探针组合，包括以下1)-3)所示的核酸序列组合中的一种或多种：
10.1)ecrg4甲基化检测的pcr引物及探针，包括引物探针组合1、引物探针组合2、引物探针组合3中的一种或多种，其中所述引物探针组合1包括如seq id no.1所示的上游引物、如seq id no.2与seq id no.3所示的下游引物、如seq id no.4所示的荧光探针，所述引物探针组合2包括如seq id no.5所示的上游引物、如seq id no.6所示的下游引物、如seq id no.7所示的荧光探针，所述引物探针组合3包括如seq id no.8所示的上游引物、如seq id no.9所示的下游引物、如seq id no.10所示的荧光探针；
11.2)tmeff2甲基化检测的pcr引物及探针，包括引物探针组合4、引物探针组合5、引物探针组合6中的一种或多种，其中所述引物探针组合4包括如seq id no.11所示的上游引物、如seq id no.12所示的下游引物、如seq id no.13所示的荧光探针，所述引物探针组合5包括如seq id no.14所示的上游引物、如seq id no.15与seq id no.16所示的下游引物、如seq id no.17所示的荧光探针，所述引物探针组合6包括如seq id no.18所示的上游引物、如seq id no.19所示的下游引物、如seq id no.20所示的荧光探针。
12.3)twist1甲基化检测的pcr引物及探针，包括引物探针组合7、引物探针组合8、引
物探针组合9中的一种或多种，其中所述引物探针组合7包括如seq id no.21所示的上游引物、如seq id no.22所示的下游引物、如seq id no.23所示的荧光探针，所述引物探针组合8包括如seq id no.24所示的上游引物、如seq id no.25所示的下游引物以、如seq id no.26所示的荧光探针，所述引物探针组合9包括如seq id no.27与seq id no.28所示的上游引物、如seq id no.29所示的下游引物、如seq id no.30所示的荧光探针。
13.在本发明一实施例中，所述的膀胱癌基因甲基化检测的pcr引物探针组合，还包括括检测内参基因gapdh的pcr引物及探针，所述引物包括如seq id no.31所示的上游引物、如seq id no.32所示的下游引物，所述探针包括如seq id no.33所示的荧光探针。
14.在本发明一实施例中，所述荧光探针的5’端包含有荧光报告基团，包括fam、hex、ned、rox、tet、joe、tamra、cy3、cy5中的任意一种。
15.在本发明一实施例中，所述荧光探针的3’端包含有荧光淬灭基团，包括mgb、bhq-1、bhq-2、bhq-3中的任意一种。
16.在本发明一优选实施例中，所述荧光淬灭基团为mgb。
17.本发明第三方面提供膀胱癌基因甲基化检测试剂盒，所述试剂盒包括如本发明第二方面所述的pcr引物探针组合，还包括阳性质控品以及阴性质控品。
18.在本发明一实施例中，所述阳性质控品为膀胱癌组织dna。
19.在本发明一实施例中，所述阴性质控品为白细胞dna。
20.在本发明一实施例中，所述膀胱癌基因甲基化检测试剂盒反应体系的终浓度组成包括：0.1-1μm pcr引物、0.1-1μm探针。
21.在本发明一优选实施例中，所述膀胱癌基因甲基化检测试剂盒反应体系的终浓度组成包括：0.1-0.5μmpcr引物、0.1-0.5μm探针。
22.在本发明一实施例中，所述膀胱癌基因甲基化检测试剂盒的荧光定量pcr反应条件如下：件如下：
23.在本发明一实施例中，所述膀胱癌基因甲基化检测试剂盒的荧光定量pcr反应条件如下：
24.本发明第四方面提供膀胱癌基因甲基化检测的检测方法，包括以下步骤：
25.1)分离待测生物样品中目标基因的核酸；
26.2)将步骤1)所得核酸经亚硫酸氢盐转化处理，得到亚硫酸氢盐转化的dna(bis-dna)；
27.3)采用甲基化荧光定量pcr技术检测步骤2)所得bis-dna的甲基化状态。
28.在本发明一实施例中，步骤1)所述生物样品包括组织、细胞、尿液中的一种。
29.在本发明一优选实施例中，步骤1)所述生物样品包括尿液。
30.本发明第五方面提供如本发明第一方面所述的膀胱癌基因甲基化检测位点、如本发明第二方面所述的膀胱癌基因甲基化检测的pcr引物探针组合、如本发明第三方面所述的膀胱癌基因甲基化检测试剂盒或如本发明第四方面所述的膀胱癌基因甲基化检测的检测方法在制备检测膀胱癌试剂盒中的应用。
31.本发明有益效果如下：
32.1)可作为膀胱癌的早期筛查、进程监测、预后评估的重要指标：本发明提供的膀胱癌基因甲基化检测试剂盒以dna甲基化异常作为检测对象，dna甲基化异常通常发生在癌症早期，并贯穿癌症的发生和发展过程，其甲基化状态一旦形成需要受到外界环境较长时间的持续刺激才会发生改变，因此dna甲基化指标的检测可以作为膀胱癌的早期筛查、进程监测、预后评估的重要生物指标；
33.2)无创检测：本发明提供的膀胱癌基因甲基化检测试剂盒可通过检测尿脱落细胞中膀胱癌相关基因甲基化状态来辅助诊断膀胱癌，实现无创检测；
34.3)单管多重基因甲基化检测：建立单管多重基因甲基化检测位点联检，减少试剂消耗，降低耗材成本，同时减少实验人员的操作步骤，减少劳动成本。
35.4)准确性高：本发明提供的膀胱癌基因甲基化检测试剂盒通过多重数据分析筛选膀胱癌高甲基化候选基因，针对膀胱癌高甲基化候选基因上的多个甲基化检测位点设计特异性的基因甲基化检测引物和探针，覆盖10个以上甲基化cpg位点，采用多重pcr扩增技术扩增经亚硫酸氢盐修饰的待测dna样品，通过组合不同基因的甲基化情况进行联合检测或者通过检测单一基因的多个不同甲基化检测区域，同时为进一步提高检测灵敏度，本发明针对性地对单一基因的其中一个甲基化检测区域设计了两条上游引物或两条下游引物，通过多种途径提高试剂盒的灵敏度与特异性，实现膀胱癌早期筛查与诊断的准确检测。
附图说明
36.图1为本发明实施例提供的膀胱癌基因甲基化检测的典型检测结果阴性图，其中
内参基因有扩增且ct值≤25，基因甲基化检测位点有扩增但ct值》20，判定检测结果为阴性；
37.图2为本发明实施例提供的膀胱癌基因甲基化检测的另一典型检测结果阴性图，其中内参基因有扩增且ct值≤25，基因甲基化检测位点有扩增且ct值≤20，
△
ct值(基因甲基化检测位点ct值-内参基因ct值)》10，判定检测结果为阴性；
38.图3为本发明实施例提供的膀胱癌基因甲基化检测的典型检测结果阳性图，其中内参基因有扩增且ct值≤25，基因甲基化检测位点有扩增且ct值≤20，
△
ct值(基因甲基化检测位点ct值-内参基因ct值)≤10，判定检测结果为阳性。
具体实施方式
39.以下通过具体实施例对本发明进行详细描述，以使本领域技术人员能够容易地根据本说明书的公开内容实施本发明。以下所描述的实施例仅是本发明的一部分实施例，而不是全部。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备，未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或制造厂商所建议条件实施。
40.本发明通过采用亚硫酸氢盐修饰法对待测膀胱癌核酸样品进行亚硫酸氢盐转化，结合荧光定量pcr技术，综合分析文献研究结果、tcga甲基化芯片数据库以及转录组测序表达谱，通过多重数据过滤分析，筛选膀胱癌高甲基化候选基因，并设计特异性的基因甲基化检测引物和探针，扩增经亚硫酸氢盐修饰的待测dna样品，根据pcr扩增结果来确定待测样品中目标基因的甲基化情况，实现膀胱癌的早期筛查与诊断。
41.本发明提供的膀胱癌基因甲基化检测试剂盒的基因甲基化检测位点包括ecrg4、tmeff2、twist1中的一种或多种。
42.本发明提供的膀胱癌基因甲基化检测试剂盒的pcr引物探针组合，包括以下1)-3)所示的核酸序列组合中的一种或多种：
43.1)ecrg4甲基化检测的pcr引物及探针，包括引物探针组合1、引物探针组合2、引物探针组合3中的一种或多种，其中所述引物探针组合1包括如seq id no.1所示的上游引物、如seq id no.2与seq id no.3所示的下游引物、如seq id no.4所示的荧光探针，所述引物探针组合2包括如seq id no.5所示的上游引物、如seq id no.6所示的下游引物、如seq id no.7所示的荧光探针，所述引物探针组合3包括如seq id no.8所示的上游引物、如seq id no.9所示的下游引物、如seq id no.10所示的荧光探针；
44.2)tmeff2甲基化检测的pcr引物及探针，包括引物探针组合4、引物探针组合5、引物探针组合6中的一种或多种，其中所述引物探针组合4包括如seq id no.11所示的上游引物、如seq id no.12所示的下游引物、如seq id no.13所示的荧光探针，所述引物探针组合5包括如seq id no.14所示的上游引物、如seq id no.15与seq id no.16所示的下游引物、如seq id no.17所示的荧光探针，所述引物探针组合6包括如seq id no.18所示的上游引物、如seq id no.19所示的下游引物、如seq id no.20所示的荧光探针。
45.3)twist1甲基化检测的pcr引物及探针，包括引物探针组合7、引物探针组合8、引物探针组合9中的一种或多种，其中所述引物探针组合7包括如seq id no.21所示的上游引
物、如seq id no.22所示的下游引物、如seq id no.23所示的荧光探针，所述引物探针组合8包括如seq id no.24所示的上游引物、如seq id no.25所示的下游引物、如seq id no.26所示的荧光探针，所述引物探针组合9包括如seq id no.27与seq id no.28所示的上游引物、如seq id no.29所示的下游引物、如seq id no.30所示的荧光探针。
46.本发明提供的膀胱癌基因甲基化检测试剂盒的pcr引物探针组合，还包括检测内参基因gapdh的pcr引物及探针，所述引物包括如seq id no.31所示的上游引物、如seq id no.32所示的下游引物，所述探针包括如seq id no.33所示的荧光探针。
47.优选地，所述荧光探针的5’端包含有荧光报告基团，包括fam、hex、ned、rox、tet、joe、tamra、cy3、cy5中的任意一种。
48.优选地，所述荧光探针的3’端包含有荧光淬灭基团，包括mgb、bhq-1、bhq-2、bhq-3中的任意一种。
49.进一步优选地，所述荧光淬灭基团为mgb。
50.本发明提供的膀胱癌基因甲基化检测试剂盒检测样品包括组织、细胞、尿液中的一种。
51.本发明提供的膀胱癌基因甲基化检测试剂盒检测结果判读包括：
52.1)阈值设定：可按仪器自动输出，也可根据仪器的使用说明手动调整基线，将阈值设定在荧光值对数图的线性部分，从软件中导出数据并读取ct值。
53.2)试剂盒有效性判定：
54.阴性质控品内参基因有扩增且ct值≤25，基因甲基化检测位点没扩增；阳性质控品内参基因与基因甲基化检测位点均有扩增且ct值≤25。
55.3)样品有效性判定：
56.a)内参基因有扩增且ct值≤25，则可继续分析；
57.b)内参基因ct值≥25或无扩增，但基因甲基化检测位点有扩增且ct值≤25，则可继续分析；
58.c)内参基因ct值》25或无扩增，基因甲基化检测位点无扩增或有扩增但ct值》25，则无法继续分析，需重复检测，若重复检测内参基因ct值》25或无扩增，则需要重新采样检测。
59.4)甲基化检测结果的判定
60.a)基因甲基化检测位点有扩增但ct值》20，判定检测结果为阴性；
61.b)基因甲基化检测位点有扩增且ct值≤20，
△
ct值(基因甲基化检测位点ct值-内参基因ct值)≤10，判定检测结果为阳性，
△
ct值》10，判定检测结果为阴性。
62.为更清楚展示本发明的技术方案，下面将结合具体实施例进一步阐述本发明。
63.实施例1：样品dna提取及亚硫酸氢盐转化
64.1、样品的处理及dna的提取
65.1)样品预处理：
66.组织、细胞样品无须预处理，尿液样品预处理操作如下：取80ml晨尿于100ml离心管中，4200rpm离心10min，弃上清，加入10mlpbs混匀清洗细胞沉渣，4200rpm离心5min，弃部分上清只保留约1ml上清，混匀后转至1.5ml无菌离心管。
67.2)dna提取：
68.通过使用安徽达健医学科技有限公司生产的核酸提取或纯化试剂(通用型)提取膀胱脱落细胞dna，具体步骤如下：
69.(a)往待测样品加入200μl裂解液i和30μl蛋白酶k，充分混匀，60℃孵育2小时至样品完全裂解；
70.(b)短暂离心，去除管盖及管壁上的液滴，加入200μl裂解液ii涡旋混匀，室温放置10min；
71.(c)加入200μl无水乙醇，涡旋震荡，充分混匀，短暂离心，将混合液全部加入吸附柱中(吸附柱放入收集管中)，12000rpm室温离心1min；
72.(d)向吸附柱中加入600μl漂洗液i，12000rpm室温离心1min，弃废液；
73.(e)向吸附柱中加入600μl漂洗液ii，12000rpm室温离心1min，弃废液；
74.(f)将吸附柱置于新的收集管中，12000rpm室温离心2min，弃废液；
75.(g)打开管盖，向吸附柱的膜中间部位悬空滴加70℃预热的洗脱液50μl，室温放置5min，12000rpm室温离心2min，将dna洗脱液收集到离心管，放入-20度冰箱保存。
76.2、亚硫酸氢盐转化：
77.通过使用安徽达健医学科技有限公司生产的核酸提取或纯化试剂(离心柱型)对步骤所得基因组dna进行亚硫酸氢盐转化，具步骤如下：
78.(a)取45μl待测dna样品于新的1.5ml离心管中并加入5μl转化缓冲液，置于金属浴37℃恒温孵育15min。
79.(b)孵育完成后，向每个样品中加入100μl预先制备的转化液，混匀并短暂离心，金属浴50℃避光孵育12～16小时
80.(c)样品置于冰上(0～4℃)孵育10min
81.(d)将吸附柱置于收集管中，向吸附柱中加入400μl结合液
82.(e)将步骤c中的样品加入吸附柱中(含有结合液)，盖紧管盖上下颠倒混匀数次，全速(14000rpm)离心30s，弃废液
83.(f)向吸附柱中加入100μl漂洗液，全速离心30s，弃废液
84.(g)向吸附柱中加入200μl脱磺液，室温(20℃～30℃)孵育20min，之后全速离心30s，弃废液
85.(h)向吸附柱中加入200μl漂洗液，全速离心30s，重复加入200μl漂洗液，全速离心30s，弃废液及收集管
86.(i)将吸附柱放入1.5ml无菌离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加30μl洗脱液，洗脱转化dna，全速离心1min，收集bis-dna，-20℃保存。
87.实施例2：膀胱癌高甲基化候选基因及特异性引物、探针筛选
88.1、膀胱癌患者尿液高甲基化候选基因的筛选
89.综合分析文献研究结果、tcga甲基化芯片数据库以及转录组测序表达谱，筛选具有显著差异的甲基化位点，通过多重数据过滤分析，最终筛选确定ecrg4、tmeff2、twist1为膀胱癌高甲基化候选基因。
90.2、膀胱癌甲基化检测的引物探针组合筛选
91.1)特异性引物、探针筛选：
92.根据上述ecrg4、tmeff2、twist1的核酸序列，在methyl primer expressv1.0软件
上进行甲基化引物和探针的设计，经申请人反复设计和推敲，筛选得到相关基因甲基化的pcr探针和引物，并将设计好的引物和探针送北京睿博兴科生物技术有限公司合成，具体序列见下表：列见下表：
93.同时设置针对内参基因gapdh的特异性引物及探针，具体序列如下：名称序列(5’—3’)methy-gapdh-fgtggagagaaatttgggaggttag(seq id no.31)methy-gapdh-rcaacacaaacacatccaacctaca(seq id no.32)methy-gapdh-patggtttgaaggtggtaggg(seq id no.33)
94.其中上述探针序列的5’端修饰有荧光基团，选自fam、hex、ned、rox、tet、joe、tamra、cy3、cy5中的任一种，3’端标记有荧光淬灭基团，选自mgb、bhq-1、bhq-2、bhq-3中的任一种。
95.实施例3：膀胱癌高甲基化候选基因的甲基化荧光定量pcr扩增检测
96.1、甲基化荧光定量pcr的反应体系如下：2
×
甲基化pcr反应预混液10μl，10μm的gapdh引物及探针各0.1μl，10μm上述引物探针组合中引物各0.5μl，探针各0.2μl，5μlbis-dna，补水至20μl。
97.2、甲基化荧光定量pcr的反应条件2、甲基化荧光定量pcr的反应条件
98.3、甲基化荧光定量pcr的检测结果判读
99.1)阈值设定：可按仪器自动输出，也可根据仪器的使用说明手动调整基线，将阈值设定在荧光值对数图的线性部分，从软件中导出数据并读取ct值。
100.2)试剂盒有效性判定：
101.阴性质控品内参基因有扩增且ct值≤25，基因甲基化检测位点没扩增；阳性质控品内参基因与基因甲基化检测位点均有扩增且ct值≤25。
102.3)样品有效性判定：
103.a)内参基因有扩增且ct值≤25，则可继续分析；
104.b)内参基因ct值≥25或无扩增，但基因甲基化检测位点有扩增且ct值≤25，则可继续分析；
105.c)内参基因ct值》25或无扩增，基因甲基化检测位点无扩增或有扩增但ct值》25，则无法继续分析，需重复检测，若重复检测内参基因ct值》25或无扩增，则需要重新采样检测。
106.4)甲基化检测结果的判定
107.a)基因甲基化检测位点有扩增但ct值》20，判定检测结果为阴性；
108.b)基因甲基化检测位点有扩增且ct值≤20，
△
ct值(基因甲基化检测位点ct值-内参基因ct值)≤10，判定检测结果为阳性，
△
ct值》10，判定检测结果为阴性。
109.实施例4：临床样品检测验证试剂盒效果
110.1、尿液样品检测
111.依据上述实施例1、2、3所述实验步骤对临床尿液样品进行检测验证试剂盒效果，为验证膀胱癌基因甲基化检测的引物探针组合的检测效果，分别用上述实施例2中的引物探针组合对20例膀胱癌尿液样品以及10例非膀胱癌尿液样品进行检测，其中编号1-20为膀胱癌尿液样品，21-30为非膀胱癌尿液样品，在阴性质控品、阳性质控品符合试剂盒有效性判定的情况下，典型的甲基化检测结果扩增图如图1、图2、图3所示，详细结果见下表，“ ”代表检测阳性，
“-”
代表检测阴性：代表检测阴性：
112.根据上述结果，统计分析如下：
113.从上述结果可得，本发明提供的膀胱癌基因甲基化检测试剂盒中单重引物探针组合的检测灵敏度在75-85％之间，特异性在90-100％之间。
114.为进一步提高试剂盒的性能，通过对上述引物探针组合进行组合，期望以多重联检的方式提高试剂盒的检测效果，结果表明以ecrg4、tmeff2、twist1三基因联合的检测方式，试剂盒的检测灵敏度在85-95％之间，特异性在70-100％之间，表明三基因联合的检测方式在提高灵敏度的同时可能会导致特异性的下降，其中以下组合的检测灵敏度与特异性均在90％以上：
115.同时以ecrg4、tmeff2或twist1的三组引物探针组合的联合检测效果如下：
116.结果表明，通过对单个基因甲基化检测位点的三组引物探针组合的联合检测，试剂盒的检测灵敏度可提高至90-95％之间，同时其特异性没有明显下降，在80-90％之间。
117.上述结果是基于膀胱癌单基因单检测位点的单管检测再经统计分析所得，此检测方式需要消耗较多的试剂同时增加实验人员的操作，实验成本较高，而单管多重基因甲基化检测位点联检可在较大程度减少试剂消耗，降低耗材成本，同时减少实验人员的操作，减少劳动成本。因此本发明建立单管多重基因甲基化检测位点联检进一步筛选膀胱癌基因甲基化检测试剂盒的优选组合，以膀胱癌尿液样品以及非膀胱癌尿液样品的dna样本为模板，测试单管多重基因甲基化检测位点联检的检测效果，结果如下：测试单管多重基因甲基化检测位点联检的检测效果，结果如下：
118.结果显示部分单管多重基因甲基化检测位点联检的检测灵敏度与特异性出现一定幅度的下降，其中引物探针组合1、2、3，其检测灵敏度降低至80％，特异性降低至70％，引物探针组合1、4、9的检测特异性虽然没有下降，但其检测灵敏度降低至75％，而其它组合的总体检测灵敏度在90-95％之间，特异性在90-100％之前，仍保持较高的检测灵敏度与特异性，因此筛选去除掉引物探针组合1、2、3以及引物探针组合1、4、9。
119.2、组织样品检测
120.通过用上述优选组合检测组织样品，检测其对组织样品的检测效果，结果如下：
121.结果在17例膀胱癌确诊患者中，共检出膀胱癌基因甲基化阳性样本16-17例，灵敏度为94％-100％，10例非膀胱癌样品，引物探针组合3、5、9以及引物探针组合4、5、6均检出阳性1例，其它组没检出，特异性为90-100％，表明本发明提供的膀胱癌基因甲基化检测试剂盒在检测膀胱癌组织样品基因甲基化时具备较高的检测灵敏度和检测特异性。
122.综上所述，本发明提供的膀胱癌基因甲基化检测试剂盒有着较高的检测灵敏度和检测特异性，具备成为膀胱癌诊断、早期筛查的理想选择，助力膀胱癌的早诊早治。
123.上述说明示出并描述了发明的若干优选实施例，但如前所述，应当理解发明并非局限于本文所披露的形式，不应看作是对其他实施例的排除，而可用于各种其他组合、修改和环境，并能够在本文所述发明构想范围内，通过上述教导或相关领域的技术或知识进行改动。而本领域人员所进行的改动和变化不脱离发明的精神和范围，则都应在发明所附权利要求的保护范围内。