一种肝癌诊断标志物及治疗靶点的应用的制作方法

1.本发明属于生物技术和生物医学邻域，具体涉及hsa_circrna_0000384作为肝细胞癌诊断的标志物和治疗靶点。


背景技术：

2.肝癌（liver cancer）是全球第六大常见癌症，也是致死率第四的癌症。2018年全球新增肝癌病例84.1万例，肝癌死亡病例78.2万例。中国恶性肿瘤流行情况分析显示2015年我国新增肝癌病例37万例，位列主要癌症新发病例第四位；肝癌死亡病例32.6万例，位列主要癌症死亡病例第二位。原发性肝癌主要分为肝细胞癌（hepatocellular carcinoma, hcc），占比为75%-85%；胆管癌（intrahepatic cholangiocarcinoma），占比为10%-15%。早期肝细胞癌不易发现，多数肝细胞癌患者被确诊时已处于中晚期。肝癌的治疗主要以手术、放疗、化疗为主，但是预后较差，患者存活期普遍较短。目前尚未有特异的肝细胞癌早期诊断靶标及预后生物标志物，且肝细胞癌靶向治疗药物的研发依然没有实质突破。因此，寻找肝细胞癌早期诊断特异性标志物，同时以标记物为突破口研发肝细胞癌靶向药物意义重大。
3.环状rna（circular rna, circ rna）与micro rna、长链非编码rna同属于非编码rna家族，近年来环状rna已经成为非编码rna研究领域的热点，受到广泛关注。环状rna是一类不具有游离的5'末端帽子和3'末端 poly (a)尾巴而主要依赖于反向剪接机制以共价键形式形成的闭合环状rna分子。目前的研究结果表明，环状rna在人体内广泛表达，且在不同组织器官中具有特异性，其主要作用是作为microrna的内源竞争性结合分子调控下游基因的表达；作为rna结合蛋白的诱饵调控rna结合蛋白的功能；作为蛋白的脚手架分子调控蛋白的修饰；直接翻译多肽等。越来越多的证据表明环状rna在肝细胞癌发生、发展中发挥着重要的作用，因此环状rna有望成为肝细胞癌理想的诊断标志物和治疗靶点。


技术实现要素：

4.为了实现肝细胞癌的早期诊断及靶向治疗，本发明提供了hsa_circrna_0000384作为肝细胞癌早期诊断靶标及临床治疗靶点。
5.本发明的第一个目的是提供一种环状rna用于肝细胞癌诊断的标志物。
6.本发明的第二个目的是提供一种肝细胞癌特异性诊断试剂盒。
7.本发明的第三个目的是提供一种环状rna作为肝细胞癌的治疗靶点。
8.为实现第一个目的，本发明提供在肝细胞癌中显著高表达circrna为生物标志物，所述标志物为hsa_circrna_0000384。seq id no.1所示，环化序列由420个碱基组成。
9.为实现第二个目的，本发明采取的技术方案是：提供了一种基于荧光定量pcr的检测试剂盒，其中包含hsa_circrna_0000384的特异检测引物。
10.荧光定量pcr的检测引物序列如下f: 5'-ccccagagcacgagtagtag-3'r: 5'-tgctgcaactgggtaaacac-3'
beta-actin内参引物序列如下f: 5'-agtgtgacgtggacatccgca-3'r: 5'-atccacatctgctggaaggtggac-3'为实现第三个目的，本发明采取的技术方案是：提供了一种在肝细胞癌细胞系中显著降低hsa_circrna_0000384表达，且不影响hsa_circrna_0000384来源基因mrps35表达的sirna，并利用肝癌细胞系验证了该sirna通过降低hsa_circrna_0000384表达抑制肝癌细胞的增殖和迁移。
11.hsa_circrna_0000384特异sirna序列如下f: 5'-guagucuuaagacggaaagtt-3'r: 5'-cuuuccgucuuaagacuactt-3'
附图说明
12.图1为环状rna标志物的表达分析。
13.图2为用于荧光定量pcr检测hsa_circrna_0000384表达的检测引物的融解曲线。
14.图3为sirna敲降效率及特异性分析。
15.图4为降低hsa_circrna_0000384表达抑制肝癌细胞的增殖和迁移。
16.具体实施方式
17.下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述。
18.下述实验方法如无特别说明，均为常规方法，所使用的实验材料如无特别说明，均可容易地从商业公司获取。
19.实施例11.1 样本的收集收集20例肝细胞癌患者癌组织和癌旁组织石蜡组织。
20.1.2 石蜡组织及细胞系总rna的提取与反转录利用石蜡组织rna提取试剂盒（天根公司）提取石蜡组织rna，利用nano drop测定rna浓度。利用trizol法提取肝细胞系及肝癌细胞系的rna，利用nano drop测定rna浓度。
21.利用反转录试剂盒（takara公司）进行反转录，体系如下：成分体积总rna500ngrandomprimer(50μm)0.5μldntpsmixture(10mm)0.5μl5xm-mlvbuffer2μlrnaseinhibitor（40u/μl）0.25μlrtasem-mlv（rnaseh-）（200u/μl）0.5μlrnasefreeh2oupto10μl反应条件30℃，10分钟；42℃，1小时；70℃，15分钟；冰上冷却，得到的cdna溶液。
22.1.4 cdna稀释反转录后，每孔加40 μl rnase free h2o稀释。
23.1.5 荧光定量pcr设计hsa_circrna_0000384跨剪切点引物:设计合成了三对跨剪切点引物（由生工生物公司合成），进行pcr检测，从中优选引物扩增条带明确且单一的引物组合，如下：f: 5'-ccccagagcacgagtagtag-3'r: 5'-tgctgcaactgggtaaacac-3'pcr产物大小为137bp。经测序确定pcr产物正确。
24.利用sybr green mixture（genstar公司）以beta-actin为内参检测hsa_circrna_0000384的相对表达，计算相对表达量。
25.荧光定量pcr体系成分体积2
×
sybrgreenmixture5μlf引物(10μm)0.4μlr引物(10μm)0.4μlcdna2μlrnasefreeh2o2.2μlpcr条件95℃，2min；40个pcr循环(95℃，15秒；60℃，15秒(收集荧光))。扩增反应结束后，从60℃缓慢加热到99℃(仪器自动进行-ramp rate为0.05℃/秒)，以获得pcr产物的熔解曲线。
26.实施例22.1 hsa_circrna_0000384特异sirna的选择基于hsa_circrna_0000384的序列，设计2对跨hsa_circrna_0000384成环剪切点的sirna（由吉玛基因公司合成）。通过检测其特异性和敲降效率优选以下sirna，其序列如下：f: 5'-guagucuuaagacggaaagtt-3'r: 5'-cuuuccgucuuaagacuactt-3'2.2 sirna转染细胞huh-7细胞系，hcclm3细胞系铺板于12孔板，待细胞汇合度达到60%-70%，利用lipo2000转染试剂（购自英潍捷基公司）转染细胞，每孔加入2μl sirna（20μm），48小时后提取细胞rna，反转录后荧光定量pcr检测hsa_circrna_0000384及mrps35的表达。
27.实施例33.1 cck-8检测细胞增殖细胞铺板于24孔板，转染sirna或nc-sirna，24小时后，消化细胞，计数，并以每孔约1000个铺板于96孔板，每孔的总体积为100 μl，测定5个时间点，每个时间点3次重复。待细胞贴壁后作为零点，每孔加入10 μl cck-8试剂（购自碧云天公司），37℃ 避光培养1小时，利用酶标仪检测450 nm 吸光度。
28.3.2划痕实验检测细胞迁移细胞铺板于12孔板，转染sirna或nc-sirna，24小时后，消化细胞，将细胞传代至6孔板中，待细胞长满后，换为无血清培养基，用10 μl枪头在孔板中笔直划线，用显微镜明场拍照
记为零点，48h后在同一位置拍照，比较间隙宽度。
29.3.3裸鼠成瘤实验检测体内肿瘤生长速率细胞铺板于10 cm 皿，转染sirna或nc-sirna，24小时后，消化细胞，计数，注射balb/c裸鼠皮下每只200万细胞，每隔5天计量肿瘤大小，25天取出肿瘤，计算重量。