一种羊源嵴病毒VP1重组蛋白、ELISA检测试剂盒及其制备方法与应用与流程

of aichi virus with antibody targeting of conserved viral protein 1epitope.applied microbiology and biotechnology[j],97:8529-8536.)分析了人爱知病毒vp1抗原表位，表达了一段保守的基序(dnspqprttfdytdnplppdtkl)，制备了抗人爱知病毒vp1的多克隆抗体(chen et al.,2013)。2013年田野表达了猪嵴病毒vp1原核蛋白，将纯化后的vp1蛋白作为抗原，建立了检测猪嵴病毒抗体的间接elisa检测方法(田野，猪嵴病毒vp1基因克隆与表达及抗体检测elisa方法的建立[m].扬州大学.)，2014年陈蕾表达猪嵴病毒vp1蛋白，利用纯化的重组蛋白建立一种检测猪血清中猪嵴病毒抗体的间接elisa方法(陈蕾，四川省猪嵴病毒病流行病学调查及间接elisa抗体检测方法的建立[m].四川农业大学.2014)。
[0006]
鉴于嵴病毒的流行和对畜牧业的危害，建立一种vp1感染和检测方法十分重要。


技术实现要素：

[0007]
申请人研究团队的实验研究证实，在国内山羊和藏绵羊中存在的kov是国内致羊腹泻的新发病毒；申请人进一步对四川，云南，重庆山羊腹泻粪便样本和川西北藏绵羊粪便样本进行病原流行病学调查结果显示，其中山羊腹泻粪便样本中kov的检出率为25.3％，场阳性率为53.3％，藏绵羊粪便样本中kov的平均检出率为8.7％，场阳性率为66.7％。其中腹泻粪便样本中kov阳性率(17.5％)，显著高于非腹泻粪便样本中kov阳性率(0.75％，p《0.001)，上述结果表明该病毒已经在我国羊群中广泛流行且与腹泻密切相关。到目前为止，国内外对羊源kov相关研究相对较少。
[0008]
本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，提供一种羊源嵴病毒vp1重组蛋白、elisa检测试剂盒及其制备方法与应用。本发明首先制备得到羊源嵴病毒vp1重组蛋白，其分子量约为31kda，能被kov阳性血清所识别，证明vp1重组蛋白具有生物活性和良好的免疫原性；然后以vp1重组蛋白为包被抗原对样本血清进行间接elisa检测，该方法具有良好的重复性、灵敏性、特异性，与羊小反刍兽疫、口蹄疫病毒、牛冠状病毒、牛轮状病毒、牛病毒性腹泻粘膜病毒无交叉反应。
[0009]
为了实现上述目的，本发明采用的技术方案是：
[0010]
本发明的第一目的在于提供一种羊源嵴病毒vp1重组蛋白，其氨基酸序列如seq id no.1所示。
[0011]
本发明的第二目的在于提供一种羊源嵴病毒vp1重组蛋白的制备方法，包括如下步骤：
[0012]
(4)提取羊源嵴病毒核酸后进行rt-pcr，拼接扩增序列，对该基因序列进行优化后，得到seq id no.2所示的核苷酸序列；
[0013]
(5)在seq id no.2所示的核苷酸序列两端加酶切位点，n端添加his标签，合成整个核苷酸序列后构建重组原核表达载体；
[0014]
(6)vp1重组蛋白的诱导表达及纯化。
[0015]
在构建表达载体时，目的基因通常由临床样本或实验室培养物中直接扩增后克隆转化，扩增受样本处理方式和核酸浓度影响大同时需要一对可完全扩增目的基因的引物，本发明在已知基因序列的情况下，利用生物软件对基因序列进行了大肠杆菌偏爱密码子优化，将改造后的序列全序列合成，无需单独设计完全扩增目的基因的引物，避免了直接从临
床样本或实验室培养物中扩增的对实验进程的影响，同时也便于对序列进行表达系统相应偏爱密码子优化和改造，有利于提高重组蛋白在表达系统中的产量和表达效率。
[0016]
相比真核表达系统，本发明采用原核表达系统成本更低，原核表达使用的试剂材料容易获得，且无需特殊仪器，便于操作，同时生产周期短，可在几天时间内合成大量优良的重组蛋白，易于形成产业化的规模，适合推广使用；抗原蛋白通过原核表达系统表达成包涵体，包涵体在变性条件下纯化，然后复性再折叠，再经过自我组装等过程而有效制备，弥补了原核表达系统缺少像真核系统重组蛋白表达后的修饰能力、不能产生正确的二硫键的缺点，同时缩短了重组蛋白的表达时间、提高了重组蛋白的生产效率。
[0017]
进一步地，所述羊源嵴病毒的核苷酸序列如seq id no.3所示。
[0018]
进一步地，在如seq id no.3所示的核苷酸序列的5’端增加酶切位点nde i，3’端增加酶切位点xho i。
[0019]
本发明的第三目的在于提供一种羊源嵴病毒vp1重组蛋白表达载体，所述表达载体的表达区的核苷酸序列如seq id no.2所示。
[0020]
本发明的第四目的在于提供一种羊源嵴病毒vp1重组蛋白表达工程菌，所述工程菌的核苷酸序列如seq id no.2所示。
[0021]
本发明的第五目的在于提供一种羊源嵴病毒vp1重组蛋白的抗体的elisa检测试剂盒，所述的氨基酸序列如seq id no.1所示。
[0022]
进一步地，所述的elisa检测试剂盒包括：
[0023]
(a)包被有氨基酸序列如seq id no.1所示的羊源嵴病毒vp1重组蛋白的elisa酶标板；
[0024][0025]
(b)标准阴性血清：羊源嵴病毒核酸检测为阴性的血清；
[0026]
(c)标准阳性血清：羊源嵴病毒阳性血清；
[0027]
(d)酶标二抗：hrp标记的兔抗羊igg；
[0028]
(e)样品稀释液、包被缓冲液、封闭液、elisa酶标板洗涤液、抗体稀释液、显色液和终止液。
[0029]
通常间接法elisa首先用抗原包被固相载体，然后加入特异性抗体即一抗，使之与固相抗原结合，再加入酶标记的二抗，使之与一抗结合，反应后加入底物显色，颜色的深浅与标本中抗原的量成正比，可通过酶标仪显示具体数据。由于这一过程有多次洗板操作，难免引起误差，造成标本假低值，甚至出现假阴性的错误结果，且较耗费时间。对此，发明人研究发现，对elisa检测过程中的试剂(包被液、稀释液、显色液、终止液)及浓度、孵育条件(温度、时间等)进行优化可进一步提高检测结果的准确率。
[0030]
进一步地，所述(a)中重组蛋白的包被浓度为0.6～0.9μg/ml，优选为0.75μg/ml；
[0031]
所述(e)中样品稀释液、包被液均为磷酸盐缓冲液，浓度为40～60mm，ph值为7.2～8，优选浓度为50mm，ph值为7.6；
[0032]
elisa酶标板洗涤液为pbst；
[0033]
抗体稀释液为1％牛血清白蛋白；
[0034]
封闭液为3.5～4.5％peg6000 pbs，优选为4％peg6000 pbs；
[0035]
显色液为tmb，终止液为1～3mol/l h2so4。
[0036]
本发明的第六目的在于提供一种羊源嵴病毒vp1重组蛋白的抗体的elisa检测方法，包括以下步骤：
[0037]
步骤1:制备检测elisa酶标板：包被缓冲液将权利要求1所述的羊源嵴病毒vp1重组蛋白稀释后包被于酶标板中，弃去包被液，用封闭液封闭；
[0038]
步骤2:阴性血清、阳性血清分别作为一抗，加样至elisa酶标板孔中进行孵育；
[0039]
步骤3:酶标二抗的孵育：将hrp标记的兔抗羊igg酶标二抗加入elisa酶标板，洗涤液洗涤；
[0040]
步骤4:加入显色液，避光孵育，加入终止液终止反应；在酶标仪上读取d
450nm
值；
[0041]
进一步地，所述步骤1中重组蛋白的包被浓度为0.6～0.9μg/ml，优选为0.75μg/ml；包被条件为34～38℃，2～2.5h，优选为37℃，2h；封闭时间为34～38℃，1～1.5h，优选为37℃，1h；
[0042]
进一步地，步骤2中一抗孵育条件为34～38℃，1～1.5h，优选为37℃，1h；
[0043]
进一步地，步骤3中酶标二抗的孵育条件为34～38℃，1～1.5h，优选为37℃，1h；
[0044]
进一步地，步骤4中显色的时间为8～12min，优选为10min。
[0045]
本发明的第七目的在于提供一种elisa检测试剂盒在制备兽医临床产品中的应用；所述产品包括抗vp1蛋白抗体的检测产品。
[0046]
本发明具有如下有益效果：
[0047]
(1)本发明羊源嵴病毒vp1重组蛋白特异性高，易纯化制备、成本低，可作为抗原能够简便、快速、准确的检测出待测血液样品中的嵴病毒抗体。
[0048]
(2)本发明重组蛋白是非复制型的，在机体内不增殖，不存在散毒危险，安全性更高。
[0049]
(3)本发明羊源嵴病毒vp1重组蛋白用作包被抗原建立的间接elisa抗体检测方法具有良好的特异性，与羊小反刍兽疫、口蹄疫病毒、牛冠状病毒、牛轮状病毒、牛病毒性腹泻粘膜病毒无交叉反应。
[0050]
(4)本发明建立的间接elisa抗体检测方法批内重复性、批间重复性良好，稳定性好；当阳性血清1:12800稀释时，阳性血清检测结果仍为阳性，方法灵敏度高，具有较好的敏感性。
附图说明
[0051]
此处所说明的附图用来提供对本发明的进一步理解，构成本发明的一部分，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。
[0052]
图1是本发明羊源嵴病毒重组vp1基因的重组表达质粒pet-28a-vp1鉴定图；
[0053]
图2是本发明羊源嵴病毒重组vp1基因蛋白表达形式分析结果图；
[0054]
图3是本发明纯化的羊源嵴病毒重组vp1基因蛋白sds-page电泳结果图；
[0055]
图4是本发明羊源嵴病毒重组vp1基因蛋白的western blot检测结果图；
[0056]
图5是本发明间接elisa检测方法灵敏度试验结果图。
[0057]
上图中，m表示dna标准dl2000，其中图1中，1表示基因扩增产物；图2中，1表示诱导前总蛋白，2表示20℃上清，3表示20℃沉淀，4表示37℃上清，5表示37℃沉淀；图3中，1表示上样液，2表示流出液，3表示20mmol/l imidazole洗脱组分，4表示50mmol/l imidazole洗
脱组分，5表示100mmol/l imidazole洗脱组分，6表示500mmol/l imidazole洗脱组分；图4中，1表示vp1蛋白。
具体实施方式
[0058]
下面对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施案例是本发明一部分实施案例，而不是全部的实施案例。基于本发明中的实施案例，本领域普通技术人员在没有做出创造性前提下所获得的所有其他实施案例，都属于本发明保护的范围。
[0059]
在本发明实施例中，需要说明的是，实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
[0060]
实施例1
[0061]
提供一种制备羊源嵴病毒重组vp1基因蛋白的方法，包括以下步骤：
[0062]
1、vp1基因的扩增：取适量由西南民族大学动物医学实验室保存的羊源嵴swun/ab18/2019株病毒(genbank登录号mw296158)核酸阳性的粪便样本，按常规方法提取总rna并反转录合成cdna，进行rt-pcr扩增，利用生物软件将基因片段拼接，获得一个完整的vp1基因的orf序列，核苷酸序列如seq id no.3所示，大小为819bp，编码273个的氨基酸。
[0063]
这一步是将接拼的vp1基因序列进行优化，在不改变任何氨基酸情况下，使其密码子偏爱性接近大肠杆菌，优化后的vp1编码基因如seq id no.2所示，在其5’增加酶切位点nde i，3’增加酶切位点xho i，n端添加his标签，然后将序列送至引物合成公司合成，nde i和xho i位点序列为catatg和ctcgag。
[0064]
2、将合成的序列作为模板nde i和xho i双酶切后，与同样经过nde i和xho i双酶切的pet-28a载体连接转化top10感受态。挑单克隆菌落，菌落pcr鉴定阳性克隆送测序，符合预期，证明成功获得了pet-28a-vp1表达质粒(如图1所示)。
[0065]
3、pet-28a-vp1表达质粒转化bl21(de3)，涂布lb固体培养基(含卡那霉素30ug/ml)，于恒温培养箱中37℃过夜培养。次日，挑单克隆菌落接入10ml lb液体培养基(含卡那霉素30ug/ml)中，37℃振摇培养10h。
[0066]
4、次日，菌种以1:100接入200ml lb液体培养基(含卡那霉素30ug/ml)，37℃振摇培养至od约为0.6～0.8时，加入终浓度为0.5mmol/l的iptg，一组20℃诱导过夜，另一组37℃诱导6h，同时以不添加iptg组作为阴性对照。离心收集菌体，以pbs 1:100(w/v)重悬，超声破碎、离心后分别收集上清和沉淀，沉淀用包涵体溶解液(8mol/lurea，50mmol/ltris-hcl，300mmol/lnacl，ph8.0)1:20(w/v)溶解，以12％的分离胶进行sds-page分析，结果显示vp6融合蛋白以包涵体形式表达(如图2所示)。
[0067]
5、大量诱导表达kov vp1重组蛋白，制备包涵体溶解液，按照镍琼脂糖亲和层析蛋白纯化说明书使用方法以5ml hiscap 6ff镍离子纯化柱进行纯化，以12％分离胶进行sds-page电泳(如图3所示)。收集到的组分进行sds-page检测后，纯度最好的几组分经6mol/l、4mol/l、2mol/l、0mol/l尿素梯度透析复性，最终透析至50mmol/ltris，300mmol/lnacl，ph8.0溶液中，经过peg20000浓缩，0.45μm滤膜过滤后分装1ml/管，-80℃冻存，按照bca蛋白浓度测定试剂盒说明书使用方法进行复性后重组蛋白的浓度测定。
[0068]
6、取纯化后的重组蛋白样品，以12％的分离胶进行sds-page，然后将重组蛋白转
移至硝酸纤维素膜，用5％脱脂牛奶进行封闭过夜处理；分别加入1:500倍稀释的羊源嵴病毒阳性血清和阴性血清，37℃摇床孵育2h，tbst洗涤3次，10min/次；加入1:10000倍稀释的hrp标记的兔抗羊二抗，37℃摇床孵育1h，tbst洗涤3次后进行ecl显色(如图4所示)，结果显示目的蛋白约31kda，其氨基酸序列如seq id no.1所示，能被kov阳性血清所识别，证明重组vp1蛋白具有生物活性和良好的免疫原性。
[0069]
实施例2
[0070]
提供一种非诊断目的的羊源嵴病毒抗体的间接elisa检测方法，包括以下步骤：
[0071]
1.elisa操作流程
[0072]
将实施例1的vp1重组蛋白用50mmol/l ph 7.6的磷酸盐缓冲液稀释后包被于酶标板中，100μl/孔，4℃过夜。次日弃去包被液，用pbst洗涤3次，200μl/孔。加入4％peg6000作为封闭液，100μl/孔，7℃1h。弃去包被液，洗涤3次后将阴性和阳性血清用1％牛血清白蛋白(bsa)分别按比例稀释后加入酶标板中，100μl/孔，37℃1h。弃去板中的液体，洗涤3次后加入用1％牛血清白蛋白(bsa)按一定比例稀释的hrp标记的兔抗羊igg，100μl/孔，37℃1h。弃去板中的液体，洗涤3次后加入tmb显色液，100μl/孔，37℃避光显色20min，然后加入2mol/l h2so4终止反应，100μl/孔，在酶标仪上读取od450nm值，阳性对照的od450nm读值记为p，阴性对照的od450nm读值记为n。
[0073]
2.最佳抗原浓度和最佳血清稀释度的确定
[0074]
纯化的重组蛋白稀释浓度为0.05-1.5μg/ml，阴性和阳性血清分别作1:5，1:10，1:25，1:50，1:75，1:100倍稀释，兔抗羊igg hrp酶标抗体按1:10000稀释，其余按elisa操作流程操作，在酶标仪上读取od450nm值。结果见表1，阳性血清od值接近1.0，阴性血清od值小于0.2，以p/n最大作为优选依据，确定最适重组蛋白包被浓度为0.75μg/ml。
[0075]
表1抗原最适包被浓度和血清的最佳稀释度的确定
[0076][0077]
注：阳性对照的od
450nm
读值记为p，阴性对照的od
450nm
读值记为n，下表同。
[0078]
3.最佳包被液和最佳包被时间的选择
[0079]
以最佳抗原浓度，分别用50mm ph 9.6碳酸盐缓冲液、50mm ph 7.6的磷酸盐缓冲液、50mm ph 7.6tris-hcl缓冲液作为包被液，每孔加100μl，包被条件分别按4℃过夜、37℃1h、37℃1.5h，37℃2h，其他条件按常规方法在酶标板上进行，根据p/n最大值确定50mm ph 7.6的磷酸盐缓冲液作为最佳包被液，37℃2h作为最佳包被时间。
[0080]
4.最佳封闭剂和最佳封闭时间的选择
[0081]
1％牛血清白蛋白(bsa)加pbst，4％peg6000加pbs，5％脱脂乳，5％犊牛血清作为封闭剂，封闭时间分别按37℃1h、37℃1.5h，37℃2h，其他条件按常规方法在酶标板上进行，根据p/n最大值确定4％peg6000加pbs作为最佳封闭剂，37℃1h作为最佳封闭时间。
[0082]
5.一抗最佳作用时间的选择
[0083]
将标准阳性、阴性血清作1:50稀释，酶标抗体作1:10000稀释，分别作用37℃1h、37℃1.5h，37℃2h，其他条件按常规方法在酶标板上进行，根据p/n最大值确定1h为一抗最适作用时间。
[0084]
6.酶标抗体最佳作用时间试验
[0085]
将标准阳性、阴性血清作1:50稀释，酶标抗体作1:10000稀释，分别作用37℃1h、37℃1.5h，37℃2h，其他条件按常规方法在酶标板上进行，根据p/n最大值确定1h为酶标抗体最适作用时间。
[0086]
7.底物最佳显色时间
[0087]
分别为5min、10min、15min、20min、25min，其他条件按常规方法在酶标板上进行，根据p/n最大值确定，底物最适作用时间为10min。
[0088]
优化后的elisa检测程序如下：纯化的重组蛋白用50mmol/l ph 7.6磷酸盐缓冲液稀释为0.75μg/ml后包被于酶标板中，100μl/孔，37℃包被2h。弃去包被液，用pbst洗涤3次，200μl/孔。加入4％peg6000，37℃封闭1min，100μl/孔，弃去封闭液，洗涤3次后将阴性和阳性血清用1％bsa分别按1:50比例稀释后加入酶标板中，100μl/孔，37℃1h。弃去板中的液体，洗涤3次后加入用1％bsa按1:10000稀释的hrp标记的兔抗羊igg，100μl/孔，37℃1h。弃去板中的液体，洗涤3次后加入tmb显色液，100μl/孔，37℃10min，然后加入2mol/l h2so4终止反应，100μl/孔。
[0089]
8.间接elisa阴、阳性临界值的确定
[0090]
30份bcov阴性血清样品中，用已建立的间接elisa方法检测，求得这些样品的d450nm的平均值(x)和标准差(s)，如果样品d450nm》x 3s，即判定为阳性；计算出od450nm值的平均值(x)为0.09，标准差(s)为0.031，则x 3s＝0.183。因此，在酶标仪上测定的od450nm＞0.183者判为阳性，od450nm＜0.183者判为阴性。
[0091]
9.特异性试验
[0092]
将包被好的酶标板分别加入羊小反刍兽疫(pprv)、羊口蹄疫病毒(fmd)，牛冠状病毒(bcov)、牛轮状病毒(brv)、牛病毒性腹泻粘膜病毒(bvdv)的阳性血清为待检样品，同时分别设羊源嵴病毒阳性和阴性血清对照，每种样品做3个重复，依据od450nm＜0.183者为无交叉反应。本次试验中待检样品的od值均小于为0.183(表2)，说明重组vp1蛋白用作包被抗原建立的间接elisa抗体检测方法具有良好的特异性，与羊小反刍兽疫、口蹄疫病毒、牛冠状病毒、牛轮状病毒、牛病毒性腹泻粘膜病毒无交叉反应。
[0093]
表2特异性实验结果
[0094][0095]
10.重复性试验
[0096]
10.1批内重复性试验用同一批的elisa板，按优化后的条件对包括阴阳性血清在内的6份样品进行检测，重复3孔，根据变异系数(cv)判定批内重复性。由表3可以看出同一血清各孔间的变异系数值在0.75％～3.77％之间，小于10％，表明该方法的批内重复性良好。
[0097]
10.2批间重复性试验在其他条件相同的情况下，用4次不同时间包被的反应板，对包括阴阳性血清在内的6份样品进行检测，根据变异系数(cv)判定批间重复性。由表4可以看出，批间重复试验的变异系数0.69％～4.83％之间，小于10％，表明不同批次包被的酶标板对同一份血清的检测结果具有较好的重复性，所建的elisa检测方法的稳定性良好。
[0098]
表3批内重复性试验
[0099][0100]
表4批间重复性试验
[0101]
[0102][0103]
11.灵敏性试验
[0104]
对包括阴阳性血清在内的4份样品从最优稀释比例开始做倍比稀释后进行检测，检测结果为阴性的阳性血清的稀释倍数越大，本方法的灵敏度越好。检测结果如图5所示，当阳性血清1:12800稀释时，3份阳性血清检测结果仍为阳性，表明所建立的方法灵敏度高，具有较好的敏感性。
[0105]
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。