芽孢杆菌及其防治黄精茎点霉叶斑病的应用和使用方法与流程

sp.)，芽孢杆菌(bacillus sp.) 的保藏编号为：gdmcc no.62004，芽孢杆菌(bacillus sp.)在菌体种子液的菌体浓度不小于5
×
108cfu/ml；
10.步骤二、种植浸泡后的黄精根茎或黄精种子，待抽出新苗后，于2-5 天内在新苗上喷洒菌体种子液，喷洒量为0.5-1ml/株。
11.进一步的改进，所述步骤一中菌体种子液的配置方法如下：
12.a.菌种活化培养：将芽孢杆菌(bacillus sp.)接种于牛肉膏蛋白胨琼脂培养基斜面试管中，温度25℃培养2～5d，得到斜面菌种；
13.b.将斜面菌种分散到无菌生理盐水中，得到浓度高于108cfu/ml的种子菌液；
14.c.通过液体摇瓶进行扩大培养，得到种子液：在容器装入液体摇瓶种子培养基，将种子菌液接种到液体摇瓶种子培养基中，在温度15～ 25℃、转速150～180r/min下振荡培养2～3天，得到液体摇瓶种子液；其中液体摇瓶种子培养基与种子菌液的体积比为50-100:1-3。
15.进一步的改进，每1000ml液体摇瓶种子培养基中含牛肉膏3.0g，蛋白胨10.0g，nacl 5.0g，水1000ml，然后调ph：7.4-7.6；液体摇瓶种子培养基配置好后121℃灭菌20min。
附图说明
16.图1为本发明黄精内生菌ly4与黄精茎点霉叶斑病菌在pda培养基上对峙培养图。
17.图2为菌株ly4形态特征，a为菌落形态，b为革兰氏染色图，c 为芽孢染色图。
具体实施方式
18.以下通过具体实施方式并且结合附图对本发明的技术方案作具体说明。
19.实施例1：
20.菌株的筛选与鉴定
21.1.菌株的分离纯化
22.采自湖南雪峰山区檀木山，海拔900-1000米上的野生健壮黄精，去叶取茎，用流水清洗健壮的茎表面的泥土残渍，晾干水分，将茎剪成长4cm小段，放入75％乙醇中处理2min无菌水冲去残留的乙醇，采用1.5％的次氯酸钠溶液对茎进行表面消毒，无菌水冲去残留的次氯酸钠溶液，沥去水分，无菌条件下将消毒后的黄精茎研磨成浆，无菌水稀释10倍后，涂布于牛肉膏蛋白胨琼脂培养基上，25℃的培养 5-7d。挑去培养出的单菌落进行纯化。
23.菌种保藏于广东省微生物菌种保藏中心(gdmcc)，地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，保藏时间为2021年10月20 日，保藏编号为：gdmcc no.62004。
24.牛肉膏蛋白胨琼脂培养基：1000ml的含牛肉膏3.0g，蛋白胨 10.0g，nacl 5.0g，琼脂15-25g，水1000ml，ph：7.4-7.6。121℃灭菌 20min。
25.2.拮抗菌株的筛选
26.黄精茎点霉叶斑病病原菌(phoma herbarum)由本技术单位分离保存分离保存。
27.在马铃薯蔗糖琼脂培养基平板中央，接种直径5mm的黄精茎点霉叶斑病病原菌菌饼，在距离菌饼2.5cm处点种分离的黄精内生细菌，以不接内生菌为对照，于25℃恒温箱中培养3d，测量内生菌的抑菌圈直径，根据以下公式，计算抑菌率。
[0028][0029]
结果共得到5株对黄精茎点霉叶斑病病原菌具有抑制作用，其中一株名称为ly4，对黄精茎点霉叶斑病病原菌的抑制率为61.5％。
[0030]
3.鉴定
[0031]
直接观察：将放置在恒温箱中纯化完成的平板拿到光线明亮的地方，以黑色绒布为背景，观察菌种形态特征并记录。
[0032]
显微镜观察(革兰氏染色)：首先用75％的酒精棉球擦拭桌面，然后点燃酒精灯，再在载玻片上滴加一小滴清水，用灭好菌的接种环取一个单菌落，轻轻的在清水中涂匀，待其自然干，然后滴加1-2滴草酸铵结晶紫染液初染，染色1min，用小水缓慢洗掉染液，再滴加 1-2滴碘液媒染，染色1min，水洗，再滴加95％的乙醇脱色20-40s，水洗，最后滴加1-2滴番红复染，染色1min，水洗，待载玻片干后，盖上盖玻片，用油镜观察菌体颜色、大小、形状。
[0033]
菌株的16s rdna鉴定。用细菌基因组试剂盒提取ly4菌株的基因组dna，用扩增细菌16s rdna的通用引物27f:5’to 3
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agagtttgatcmtggctcag-、1541r:5’to 3
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aaggaggtgatccagccgca-，扩增ly4菌株的16s rdna序列，扩增片段dna纯化后送擎科(长沙)生物科技有限公司测序，序列在ncbi数据库中进行blast对比，并构建系统发育树，结果表明 ly4菌株与bacillusflexus在同一个分支上，同源性最高的为99％。综合菌体形态特征和分子生物学特征，菌株ly4为bacillus sp.。
[0034]
实施例2菌株ly4对黄精茎点霉叶斑病的抑制作用
[0035]
1.菌种活化培养。将bacillus sp菌株ly4，接种于牛肉膏蛋白胨琼脂培养基斜面试管中，温度25℃培养2～5d，得到斜面菌种；
[0036]
2.将无菌生理盐水加入含活化菌试管斜面中，使菌液浓度高于 108/ml。
[0037]
3.通过液体摇瓶进行扩大培养，得到种子液。在250ml锥形瓶中装入50ml液体摇瓶种子培养基，将斜面ly4菌接种到液体摇瓶种子培养基中，在温度15～25℃、转速150～180r/min下振荡培养2～3 天，得到液体摇瓶种子液(种子液浓度高于8
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108cfu/ml)。
[0038]
所述液体摇瓶种子培养基为：1000ml的含牛肉膏3.0g，蛋白胨 10.0g，nacl 5.0g，水1000ml，ph：7.4-7.6。121℃灭菌20min。
[0039]
4.浸泡。将待种植的黄精根茎或黄精种子浸泡在ly4种子液中， 2h后，再栽培。
[0040]
栽培1个月后，等种子或块茎抽出新苗后，采用刺伤接种黄精茎点霉叶斑病病原菌(phoma herbarum)菌悬液，2-5天内喷洒一次ly4 种子液0.5ml/株，菌体浓度》8
×
108cfu/ml。以不浸泡ly4种子液，不喷洒种子液的为对照。发现可以100％防止黄精茎点霉叶斑病病发生。
[0041]
实施例3
[0042]
1.用50％多菌灵可湿性粉剂按1％的用量处理黄精种子或黄精块茎，即每100千克使用1千克50％多菌灵可湿性粉剂，拌种栽培。
[0043]
2.栽培1个月后，等种子或块茎抽出新苗后，采用刺伤接种黄精茎点霉叶斑病病原菌(phoma herbarum)菌悬液，2-5天内喷洒多菌灵有效成分5mg/株。以不拌多菌灵粉不喷洒多菌灵的为对照。发现可以100％防止黄精茎点霉叶斑病病发生。
[0044]
实施例4
[0045]
与实施例2相比，刺伤接种黄精茎点霉叶斑病病原菌(phomaherbarum)菌悬液后不喷洒ly4种子液，其它与实施例2相同，发现患病率低于40％，
[0046]
实施例5
[0047]
与实施例3相比，刺伤接种黄精茎点霉叶斑病病原菌(phomaherbarum)菌悬液后不喷洒多菌灵，其它与实施例3相同，结果表明并不能防治黄精茎点霉叶斑病。
[0048]
实施例6
[0049]
与实施例3相比，刺伤接种黄精茎点霉叶斑病病原菌(phomaherbarum)菌悬液，待病斑出现后，再喷洒多菌灵，其它与实施例3相同，结果表明一个月后或雨水后，黄精茎点霉叶斑病发病率高于70％。
[0050]
上述仅为本发明的一个具体导向实施方式，但本发明的设计构思并不局限于此，凡利用此构思对本发明进行非实质性的改动，均应属于侵犯本发明的保护范围的行为。