一种金属基纳米聚合物及其制备方法与应用与流程

1.本发明生物医药技术领域，尤其是指一种金属基纳米聚合物及其制备方法与应用。


背景技术：

2.根据近期世界卫生组织国际癌症研究机构(iarc)以及学术期刊ca发布的全球癌症负担数据显示，2020年全球新发癌症1929万例，死亡近996万例。其中结直肠癌是世界上最常见的癌症之一。全球每年新发癌症和癌症相关死亡病例中，约有10％是结肠癌(居第四位)，其死亡率高居所有病例的第三位，仅次于肺癌和乳腺癌。据估计，到2030年，全球结直肠癌负担将增加60％，新增病例将超过220万，死亡病例将超过110万。中国癌症中心最新发布的《中国肿瘤登记年报》也显示，我国每年结直肠癌的新发病例数为37.6万人，死亡人数19.1万人，发病率和死亡率分别高达9.8％和8.0％。由此可见，结直肠癌已经严重威胁着人类的健康，给社会经济带来沉重负担。
3.近年来，随着对肿瘤免疫学认识的深入，免疫治疗逐渐成为炙手可热的肿瘤治疗方法。免疫疗法已经成为继手术、放疗和化疗之后的第四大癌症治疗支柱。一些化疗药物，特别是蒽环类药物，可以诱导特异性免疫反应，导致免疫原性细胞死亡(immunogenic cell death；icd)或免疫刺激副作用。在过去的三十年里，fda批准了700种肿瘤化疗药物。其中，铂类化疗药物有顺铂(cisplatin)、卡铂(carboplatin)、奈达铂(nedaplatin)、奥沙利铂(oxaliplatin)、洛铂(lobaplatin)和庚铂(heptaplatin)(图1)。研究表明奥沙利铂被确定为icd诱导剂，其可以与检查点阻断结合治疗结直肠癌。另外，2015年ang等人(图2)系统地筛选了12种单分子铂基配合物的icd能力。结果显示，一种n-杂环卡宾铂类衍生物(pt-nhc)表现出良好的ii型icd诱导剂的特征，被鉴定为第一种小分子免疫化疗剂。
4.铂-硫(pt-s)配位化学在肿瘤治疗中也扮演着重要角色。铂类药物进入细胞后会与细胞内的含硫内源性物质如谷胱甘肽，含硫氨基酸等发生反应进而形成pt-s配位键，进而将药物泵出细胞外，导致铂药的实际作用率低、毒副作用大、多药耐药等。因此，研究者们提出通过引入外源含硫分子如硫代硫酸钠、谷胱甘肽等作为细胞保护剂进而减轻铂类药物毒副作用。如图3所示，moi等人合成了铂-氮杂环胺配合物(c-1)及其水解产物(c-2)，以及其与谷胱甘肽和蛋氨酸取代的pt-s配合物(c-3，c-4)，实验结果显示通过含硫氨基酸修饰后，化合物c-3及c-4对hep 2(咽喉癌)、mda-mb-231(乳腺癌)和a549(肺癌)细胞系的抗癌活性较c-1及c-2有了显著提升。
5.纳米载体技术如聚合物胶束、脂质体(如图6)和无机纳米粒子等的最新进展为提高抗癌药物的治疗效果和减少副作用带来了巨大的希望。例如2020年，lee等人先利用两亲性的共嵌段聚合物pdma-pcl包裹疏水性奥沙利铂药物的前驱体二氯(1，2-二氨基环己烷)铂(ii)(dachpt)形成聚合物胶束(acs appl.mater.interfaces 2020,12,4254-4264)，然后再在胶束表面包裹一层金纳米粒子，最后，利用巯基聚乙二醇上sh与金纳米粒子之间强的au-s金属配位键，进一步修饰固定金纳米壳的表面，进而形成具有多分子体系的铂类药
物递送系统(图5)。这种通过物理包裹制备的纳米递送系统一方面因药物的溶解度低而导致负载率不高；另一方面，纳米递送系统稳定性差，容易受到癌细胞内环境如强酸性，不均匀的氧化还原环境的影响而发生提前释药，进而导致较差的肿瘤治疗效果；尤其重要的是，纳米给药体系在制备过程涉及多种分子之间的化学反应，导致制备过程复杂且耗时过长，所得材料的组分也极其复杂，无向临床转化的可能性。


技术实现要素：

6.为解决上述技术问题，本发明提供了一种金属基纳米聚合物及其制备方法与应用。
7.一种金属基纳米聚合物，所述金属基纳米聚合物结构式如式(1)-式(4)所示：
[0008][0009]
其中，n＝10-120的整数；
[0010]
t为
[0011]
m＝3000-4000的整数；
[0012]
m为pd、pt或ni；
[0013]
x为s或se。
[0014]
所述的金属基纳米材料的制备方法，所述金属基纳米聚合物结构式为式(1)时，包括以下制备步骤：
[0015]
s1：将m(pph3)2cl2与xh-mpeg混合溶于有机溶剂1中进行加热反应，待反应结束固液分离取滤液，将滤液进行重结晶得到固体沉淀；
[0016]
s2：将s1中所述固体沉淀溶于有机溶剂2中，超声溶解并以0.03-1ml/min的速度加入水，透析过滤得到所述金属基纳米聚合物；
[0017]
所述金属基纳米聚合物结构式为式(2)时，包括以下制备步骤：
[0018]
s1’：将m(pph3)2cl2与xh-mpeg-t混合悬浮于混合溶剂中，搅拌反应得到固体产物1；
[0019]
s2’：将s1’中所得固体产物溶于有机溶剂3中，搅拌并以0.03-1ml/min的速度加入
水，透析过滤得到所述金属基纳米聚合物；
[0020]
所述金属基纳米聚合物结构式为式(3)-(4)时，包括以下制备步骤：
[0021]
s1”：将m(dach)cl2与agno3或ag(cf3so3)在水溶液中避光搅拌，并离心得到[m(dach)(h2o)2][no3]2或[m(dach)(h2o)2][cf3so3]2，随后分别加入xh-mpeg或xh-mpeg-t，搅拌反应得到混合溶液并冷冻干燥得到固体产物；
[0022]
s2”：将s1”中所得固体产物溶于有机溶剂4中，超声溶解并以0.025-1.5ml/min的速度加入水，透析过滤得到所述金属基纳米聚合物；
[0023]
其中，n＝10-120；
[0024]
t为
[0025]
m＝3000-4000的整数；
[0026]
m为pd、pt、ni；
[0027]
x为s或se。
[0028]
进一步的，s1中所述m(pph3)2cl2与xh-mpeg的摩尔比为1:1-3:1。
[0029]
进一步的，s1中的所述加热反应时间为3-7天。
[0030]
进一步的，s1’中所述m(pph3)2cl2与xh-mpeg-t摩尔比为1：1-3：1。
[0031]
进一步的，s1”中所述[m(dach)(h2o)2][no3]2或[m(dach)(h2o)2][cf3so3]2与xh-mpeg的摩尔比为1：1-2.5：1。
[0032]
一种金属基纳米聚合物在制备治疗癌症药物中的应用。
[0033]
进一步的，所述癌症为结肠癌、肺癌、乳腺癌、脑胶质瘤、肝癌或卵巢癌。
[0034]
一种掺杂罗丹明的金属基纳米聚合物，所述金属基纳米聚合物掺杂罗丹明，所述铂基纳米聚合物与罗丹明质量比为12.5：1-50：1。
[0035]
一种掺杂罗丹明的金属基纳米聚合物在制备荧光探针中的应用。
[0036]
本发明的上述技术方案相比现有技术具有以下优点：
[0037]
本发明合成了两种含有左旋-反式-1,2-环己二胺((1r,2r)-(-)-1,2-diamino cyclohexane；dach)的单分子铂-硫配位化合物纳米制剂，即[m2(x-peg)2(dach)2](3)和[m2(x-peg-t)2(dach)2](4)。如图4所示，化合物3和4的分子结构中含有疏水性的[m2x2(dach)2]内核(红色)以及亲水性的peg(3)及peg-t(4)高分子侧链(绿色)。化合物3和4在水相中可自发组装成具有核-壳结构的粒子。组装成粒子后，peg壳层结构可有效地对[m2(x-peg)2(dach)2]内核进行包裹。另外，pd、pt、ni为软亲电试剂，对软的亲核s、se或te配体有较高的亲和力，从而形成相对稳定纳米配合物，不会导致药物的提前或爆发式释放。化合物4外围所修饰的靶向基团如叶酸、多巴胺、透明质酸可以有效地和癌细胞如人结肠癌细胞(ht-29、
hct-116、sw-620)，人结肠腺癌细胞(caco-2)，人原发性结肠癌(sw-480)表面上相应的受体结合，提高药物的摄入水平。为了探究3和4中[m2(x-peg)2(dach)2]内核是否可以诱导icd，本发明还合成了不含dach的同系物[m2(x-peg)2(pph3)4](1)、[m2(x-peg-t)2(pph3)4](2)。本发明通过1h核磁共振谱、透射电子显微镜(tem)、傅里叶变换红外(ft-ir)等确定了其结构及组成，并进行了mtt法细胞毒性测试。另外，为了研究细胞吞噬和免疫荧光成像，本发明还制备了四种具有罗丹明b(rh-b)标记的纳米制剂[m2(x-peg)2(pph3)4]-rhb(5)、[m2(x-peg-t)2(pph3)4]-rhb(6)、[m2(x-peg)2(dach)2]-rhb(7)、[m2(x-peg-t)2(dach)2]-rhb(8)。实验结果表明，含有[m2(x-peg)2(dach)]内核3(7)和4(8)可以成功导致结肠腺癌caco-2细胞中钙网蛋白(crt)的外翻，具有icd诱导效应，而不含[m2(x-peg)2(dach)]内核1(5)和2(6)则无icd效应。
[0038]
本发明以具有抗癌活性的金属m(如pt、pd、ni)为多种功能化模块的交联中心，通过形成m-x(如pt-s)(软酸与软碱)键引入具有水溶性的peg/peg-t(t＝叶酸等)作为所得粒子的壳层；通过金属m与n配位键形成可能具有icd效能的[m2x2(dach)2]内核，同时所得的[m2x2(dach)2]内核由于其疏水性可以作为粒子的内核。通过简单高效的化学反应及将所得产物在水中自组装，本发明方便地得到了组分唯一、高度集成、具有靶向性及icd效应的单分子纳米药物递送体系。该体系中所有组分均通过金属(如pt、pd、ni)相连，无需进一步与其他药物进一步组装，所得材料既是载体又是药物，大大提升了药物在递送过程中的稳定性，展示了此药物设计独特的优势。同时，以[m2x2(dach)2]为内核的铂基药物对caco-2细胞表现出优异的icd效果。
附图说明
[0039]
为了使本发明的内容更容易被清楚的理解，下面根据本发明的具体实施例并结合附图，对本发明作进一步详细的说明，其中
[0040]
图1是临床使用铂类药物的化学结构。
[0041]
图2是多种铂类配合物的免疫原性死亡icd能力研究。
[0042]
图3是铂-氮杂环胺配合物与谷胱甘肽和蛋氨酸取代的pt-s配合物的细胞毒性研究。
[0043]
图4是本发明含疏水性[pt2s2(dach)2]内核的配位化合物的合成及粒子形成示意图。
[0044]
图5是聚合物-无机纳米粒子构成的多分子纳米递送系统。
[0045]
图6是脂质体自组装多分子纳米递送系统。
[0046]
图7是本发明纳米制剂1-4的合成流程示意图。
[0047]
图8是本发明测试例纳米制剂1，2，3，4的透射电镜图像；其中(a)、(b)、(c)、(d)分别为1，2，3，4的透射电镜图像。
[0048]
图9-a、图9-b是分别本发明纳米制剂1、3的1h nmr。
[0049]
图10-a是纳米制剂1，2的ft-ir光谱；图10-b是纳米制剂3，4的ft-ir光谱。
[0050]
图11-a、图11-b、图11-c、图11-d是纳米制剂1，2，3，4的能量分散x-射线光谱(eds)。
[0051]
图12-a、图12-b、图12-c、图12-d是纳米制剂1，2，3，4的zeta电位。
[0052]
图13-a、图13-b分别是纳米制剂5-8对caco-2、ct-26细胞的免疫荧光染色实验。
[0053]
图14-a是本发明纳米制剂1对小鼠黑色素瘤b16f10细胞系的细胞活力数据(n＝5)。
[0054]
图14-b、图14-c分别是本发明纳米制剂2对小鼠黑色素瘤b16f10细胞系的细胞活力数据和ic
50
(n＝4)。
[0055]
图15是本发明纳米制剂5的细胞吞噬实验。
具体实施方式
[0056]
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。
[0057]
实施例1
[0058]
(1)纳米制剂[pt2(s-peg)2(pph3)4](1)的合成及制备：
[0059]
合成：将pt(pph3)2cl2(0.060g，0.076mmol)、sh-mpeg(0.15g，0.076mmol)悬浮于15.0ml甲苯中，83℃搅拌7天，反应完成后离心。收集甲苯上清液，加适量乙醚，产生白色沉淀。离心收集白色沉淀，60℃干燥得淡黄色油状物，随后风干得1的淡黄色蜡状物0.045g。
[0060]
制备：取1的淡黄色蜡状固体(0.010g，0.0025mmol)溶于1.0ml thf，每3分钟加入100μl至3.0ml超声水(功率10％)，用截留分子量3500的透析袋透析过夜，并用450nm过滤器过滤。将所得1的纳米溶液冷冻干燥以备用。
[0061]
(2)纳米制剂[pt2(s-peg-fa)2(pph3)4](2)的合成及制备：
[0062]
合成：将pt(pph3)2cl2(4.0mg，0.005mmol)、sh-mpeg-fa(10.0mg，0.005mmol)悬浮在含有10.0μl三乙胺的h2o:ch3cn(3：1)混合溶液中，搅拌三天。溶剂在室温下风干得到2的14.0mg固体产物。
[0063]
制备：将2的8.0mg固体溶解于3.0ml的dmso中，每3分钟加入100μl混合溶液至3.0ml搅拌水中(转速1400转)。将混合液转入截流分子量为3000得透析袋中透析过夜，用450nm过滤器过滤后得到2的纳米溶液冷冻干燥所得固体备用。
[0064]
(3)纳米制剂[pt2(s-peg)2(dach)2](3)的合成及制备：
[0065]
合成：pt(dach)cl2(25.3mg，0.067mmol)和agno3(21.5mg，0.13mmol)在3.0ml去离子水中避光搅拌24h，离心除去agcl的白色沉淀。将得到的上清液用220nm滤膜过滤得到3.0ml[pt(dach)(h2o)2][no3]2水溶液，然后加入sh-mpeg(50.0mg，0.025mmol)混合均匀，搅拌30h后溶液变为微黄色。将溶液转移到截留分子量为1000的透析袋中24小时。透析液冷冻干燥，得到3的固体粉末38.0mg备用。
[0066]
制备：将3的固体粉末(23.5mg)溶解在1.0ml的dmso中，每3分钟将100μl溶液加入3.0ml超声波水中(功率10％)，然后将胶束溶液转移至截止分子量为3000在透析袋中透析12小时后，用450nm过滤器过滤得到3的纳米制剂并进行透射电子显微镜和动态光散射测试。
[0067]
(4)纳米制剂[pt2(s-peg-fa)2(dach)2](4)的合成及制备：
[0068]
合成：pt(dach)cl2(25.3mg，0.067mmol)、agno3(21.5mg，0.127mmol)在3.0ml去离子水中避光搅拌24h，离心除去agcl的白色沉淀。将得到的上清液用220nm滤头过滤后得3.0ml[pt(dach)(h2o)2][no3]2水溶液，随后加入sh-mpeg-fa(5.0mg，0.0025mmol)混匀，搅
拌30h后溶液变为黄色液体，透析(截留分子量：1000)24小时后冻干透析液，得到4的5.0mg固体粉末。
[0069]
制备：将4的2.0mg溶于1.0ml的dmso中，每2分钟加入50.0μl至3.0ml超声水(功率10％)，用截流分子量3000透析袋透析4小时，然后用450nm滤膜过滤，将胶束溶液冷冻干燥后备用。
[0070]
(5)罗丹明标记的纳米制剂[pt2(s-peg)2(pph3)4]-rhb(5)的合成：
[0071]
按照纳米制剂1的投料比并另外加入sh-mpeg-rhb(0.15mg，0.000075mmol)，后处理与1相同，得到5的67.8mg红色蜡状固体，通过紫外光谱测得其罗丹明掺杂率为7.3％。
[0072]
(6)罗丹明标记的纳米制剂[pt2(s-peg-fa)2(pph3)4]-rhb(6)的合成：
[0073]
按照纳米机制2的投料比并另外加入sh-mpeg-rhb(1.0mg，0.0005mmol)，后处理与2相同，得到6的14.0mg红色的粘性产物。
[0074]
(7)罗丹明标记的纳米制剂[pt2(s-peg)2(dach)2]-rhb(7)的合成：
[0075]
按照纳米制剂3的投料比并另外加入sh-mpeg-rhb(3.0mg,0.0015mmol)后处理与3相同，得到7固体粉末38.0mg备用。通过紫外光谱测得其罗丹明掺杂率为1.73％。
[0076]
(8)纳米制剂[pt2(s-peg-fa)2(dach)2]-rhb(8)的合成:
[0077]
按照纳米制剂4的投料比另外加入sh-mpeg-rhb(10.0mg,0.005mmol)后处理与4相同，得到8固体粉末8.0mg备用。
[0078]
实施例2
[0079]
(1)纳米制剂[pd2(se-peg)2(pph3)4](1)的合成及制备：
[0080]
合成：将pd(pph3)2cl2(0.050g，0.071mmol)、seh-mpeg(0.142g，0.071mmol)悬浮于10.0ml甲苯中，83℃真空避光搅拌5天，反应完成后离心。收集甲苯上清液，旋干甲苯溶剂，得褐色的油状物，随后风干得1的褐色蜡状物0.032g。
[0081]
制备：取1的褐色蜡状固体(0.010g，0.0025mmol)溶于1.0ml dmf，每3分钟加入120μl至2.0ml超声水(功率10％)，用截留分子量3500的透析袋透析过夜，并用450nm过滤器过滤。将所得1的纳米溶液冷冻干燥以备用。
[0082]
(2)纳米制剂[pd2(se-peg-fa)2(pph3)4](2)的合成及制备：
[0083]
合成：将pd(pph3)2cl2(10.0mg，0.014mmol)、seh-mpeg-fa(40.0mg，0.020mmol)悬浮在含有20.0μl三乙胺的h2o:ch3cn(3：1)混合溶液中，搅拌三天。溶剂在室温下风干得到2的14.0mg固体产物。
[0084]
制备：将2的5.0mg固体溶解于3.0ml的dmso中，每3分钟加入150μl混合溶液至3.0ml搅拌水中(转速1400转)。将混合液转入截流分子量为3000得透析袋中透析过夜，用450nm过滤器过滤后得到2的纳米溶液冷冻干燥所得固体备用。
[0085]
(3)纳米制剂[pd2(se-peg)2(dach)2](3)的合成及制备：
[0086]
合成：pd(dach)cl2(21.5mg，0.074mmol)和agno3(25.3mg，0.149mmol)在3.0ml去离子水中避光搅拌24h，离心除去agcl的白色沉淀。将得到的上清液用220nm滤膜过滤得到3.0ml[pd(dach)(h2o)2][no3]2水溶液，然后加入seh-mpeg(50.0mg，0.025mmol)混合均匀，搅拌30h后溶液变为黄褐色。将溶液转移到截留分子量为1000的透析袋中24小时。透析液冷冻干燥，得到3的固体粉末30.0mg备用。
[0087]
制备：将3的固体粉末(15.0mg)溶解在1.0ml的dmso中，每3分钟将150μl溶液加入
3.0ml超声波水中(功率10％)，然后将胶束溶液转移至截止分子量为3000在透析袋中透析12小时后，用450nm过滤器过滤得到3的纳米制剂并进行透射电子显微镜和动态光散射测试。
[0088]
(4)纳米制剂[pd2(se-peg-fa)2(dach)2](4)的合成及制备：
[0089]
合成：pd(dach)cl2(21.5mg，0.074mmol)和agno3(25.3mg，0.149mmol)在3.0ml去离子水中避光搅拌24h，离心除去agcl的白色沉淀。将得到的上清液用220nm滤膜过滤得到3.0ml[pd(dach)(h2o)2][no3]2水溶液，然后加入seh-mpeg-fa(4.0mg，0.002mmol)混合均匀，搅拌30h后溶液变为黄褐色。将溶液转移到截留分子量为1000的透析袋中24小时。透析液冷冻干燥，得到4的固体粉末5.0mg备用。
[0090]
制备：将4的2.0mg溶于1.0ml的dmso中，每2分钟加入60.0μl至3.0ml超声水(功率10％)，用截流分子量3000透析袋透析4小时，然后用450nm滤膜过滤，将胶束溶液冷冻干燥后备用。
[0091]
(5)罗丹明标记的纳米制剂[pd2(se-peg)2(pph3)4]-rhb(5)的合成：
[0092]
按照纳米制剂1的投料比并再加入seh-mpeg-rhb(0.15mg，0.000075mmol)，后处理与1相同，得5的红褐色蜡状物0.030g。通过紫外光谱测得其罗丹明掺杂率为6.7％。
[0093]
(6)罗丹明标记的纳米制剂[pd2(se-peg-fa)2(pph3)4]-rhb(6)的合成：
[0094]
按照纳米制剂2的投料比并再另外加入seh-mpeg-rhb(1.0mg，0.0005mmol)，后处理与2相同得到6的14.0mg固体产物。
[0095]
(7)罗丹明标记的纳米制剂[pd2(se-peg)2(dach)2]-rhb(7)的合成：
[0096]
按照纳米机制3的投料比并再另外加入seh-mpeg-rhb(3.0mg,0.0015mmol)，后处理与3相同，得到7固体粉末30.0mg备用。通过紫外光谱测得其罗丹明掺杂率为1.63％。
[0097]
(8)纳米制剂[pd2(se-peg-fa)2(dach)2]-rhb(8)的合成:
[0098]
按照纳米胶束4的投料比并再另外加入seh-mpeg-rhb(10.0mg,0.005mmol)，后处理与4相同，得到8固体粉末8.0mg备用。
[0099]
实施例3
[0100]
(1)纳米制剂[ni2(s-peg)2(pph3)4](1)的合成及制备：
[0101]
合成：将ni(pph3)2cl2(0.040g，0.06mmol)、sh-mpeg(0.12g，0.06mmol)悬浮于15.0ml甲苯中，83℃搅拌7天，反应完成后离心。收集甲苯上清液，旋干甲苯得到淡绿色沉淀。用乙醚洗涤沉淀45℃干燥得淡黄色油状物，随后风干得1的淡绿色蜡状物0.030g。
[0102]
制备：取1的淡绿色蜡状固体(0.010g，0.0025mmol)溶于1.0ml thf，每3分钟加入120μl至3.0ml超声水(功率10％)，用截留分子量3500的透析袋透析过夜，并用450nm过滤器过滤。将所得1的纳米溶液冷冻干燥以备用。
[0103]
(2)纳米制剂[ni2(s-peg-ha)2(pph3)4](2)的合成及制备：
[0104]
合成：将ni(pph3)2cl2(5.0mg，0.008mmol)、sh-mpeg-ha(8.0mg，0.004mmol)悬浮在含有10.0μl三乙胺的h2o:ch3cn(3：1)混合溶液中，搅拌三天。溶剂在室温下风干得到2的12.0mg固体产物。
[0105]
制备：将2的8.0mg固体溶解于3.0ml的dmso中，每3分钟加入100μl混合溶液至3.0ml搅拌水中(转速1400转)。将混合液转入截流分子量为3000得透析袋中透析过夜，用450nm过滤器过滤后得到2的纳米溶液冷冻干燥所得固体备用。
[0106]
(3)纳米制剂[ni2(s-peg)2(dach)2](3)的合成及制备：
[0107]
合成：ni(dach)cl2(20.5mg，0.08mmol)和agno3(27.0mg，0.16mmol)在3.0ml去离子水中避光搅拌24h，离心除去agcl的白色沉淀。将得到的上清液用220nm滤膜过滤得到3.0ml[ni(dach)(h2o)2][no3]2水溶液，然后加入sh-mpeg(50.0mg，0.025mmol)混合均匀，搅拌30h后溶液变为微绿色。将溶液转移到截留分子量为1000的透析袋中24小时。透析液冷冻干燥，得到3的固体粉末38.0mg备用。
[0108]
制备：将3的固体粉末(23.5mg)溶解在1.0ml的dmso中，每3分钟将100μl溶液加入3.0ml超声波水中(功率10％)，然后将胶束溶液转移至截止分子量为3000在透析袋中透析12小时后，用450nm过滤器过滤得到3的纳米制剂并进行透射电子显微镜和动态光散射测试。
[0109]
(4)纳米制剂[ni2(s-peg-ha)2(dach)2](4)的合成及制备：
[0110]
合成：ni(dach)cl2(20.5mg，0.08mmol)、agno3(27.0mg，0.16mmol)在3.0ml去离子水中避光搅拌24h，离心除去agcl的白色沉淀。将得到的上清液用220nm滤头过滤后得3.0ml[ni(dach)(h2o)2][no3]2水溶液，随后加入sh-mpeg-ha(5.0mg，0.0025mmol)混匀，搅拌30h后溶液变为黄色液体，透析(截留分子量：1000)24小时后冻干透析液，得到4的5.0mg固体粉末。
[0111]
制备：将4的2.0mg溶于1.0ml的dmso中，每2分钟加入50.0μl至3.0ml超声水(功率10％)，用截流分子量3000透析袋透析4小时，然后用450nm滤膜过滤，将胶束溶液冷冻干燥后备用。
[0112]
(5)罗丹明标记的纳米制剂[ni2(s-peg)2(pph3)4]-rhb(5)的合成：
[0113]
按照纳米制剂1的投料比并另外再加入sh-mpeg-rhb(0.15mg，0.000075mmol)，后处理与1相同，得到5的67.8mg红色蜡状固体，通过紫外光谱测得其罗丹明掺杂率为5.6％。
[0114]
(6)罗丹明标记的纳米制剂[ni2(s-peg-ha)2(pph3)4]-rhb(6)的合成：
[0115]
按照纳米制剂2的投料比并再外加入sh-mpeg-rhb(1.0mg，0.0005mmol)，后处理与2相同，得到6的10.0mg红色的粘性产物。
[0116]
(7)罗丹明标记的纳米制剂[ni2(s-peg)2(dach)2]-rhb(7)的合成：
[0117]
按照纳米胶束3的投料比并再外加入sh-mpeg-rhb(3.0mg,0.0015mmol)，后处理与3相同，得到7固体粉末38.0mg备用。通过紫外光谱测得其罗丹明掺杂率为1.73％。
[0118]
(8)纳米制剂[ni2(s-peg-ha)2(dach)2]-rhb(8)的合成:
[0119]
按照纳米胶束4的投料比并再外加入sh-mpeg-rhb(10.0mg,0.005mmol)，后处理与4相同，得到8固体粉末8.0mg备用。
[0120]
实施例4
[0121]
(1)纳米制剂[pt2(se-peg)2(pph3)4](1)的合成及制备：
[0122]
合成：将pt(pph3)2cl2(0.055g，0.071mmol)、seh-mpeg(0.16g，0.08mmol)悬浮于15.0ml甲苯中，83℃搅拌7天，反应完成后离心。收集甲苯上清液，旋干甲苯，产生褐色沉淀。60℃干燥得褐色油状物，随后风干得1的褐色蜡状物0.045g。
[0123]
制备：取1的褐色蜡状固体(0.010g，0.0025mmol)溶于1.0ml thf，每3分钟加入100μl至3.0ml超声水(功率10％)，用截留分子量3500的透析袋透析过夜，并用450nm过滤器过滤。将所得1的纳米溶液冷冻干燥以备用。
[0124]
(2)纳米制剂[pt2(se-peg-fa)2(pph3)4](2)的合成及制备：
[0125]
合成：将pt(pph3)2cl2(6.0mg，0.008mmol)、seh-mpeg-fa(10.0mg，0.005mmol)悬浮在含有10.0μl三乙胺的h2o:ch3cn(3：1)混合溶液中，搅拌三天。溶剂在室温下风干得到2的14.0mg固体产物。
[0126]
制备：将2的8.0mg固体溶解于3.0ml的dmso中，每3分钟加入100μl混合溶液至3.0ml搅拌水中(转速1400转)。将混合液转入截流分子量为3000得透析袋中透析过夜，用450nm过滤器过滤后得到2的纳米溶液冷冻干燥所得固体备用。
[0127]
(3)纳米制剂[pt2(se-peg)2(dach)2](3)的合成及制备：
[0128]
合成：pt(dach)cl2(25.3mg，0.067mmol)和agno3(21.5mg，0.13mmol)在3.0ml去离子水中避光搅拌24h，离心除去agcl的白色沉淀。将得到的上清液用220nm滤膜过滤得到3.0ml[pt(dach)(h2o)2][no3]2水溶液，然后加入seh-mpeg(50.0mg，0.025mmol)混合均匀，搅拌30h后溶液变为褐色。将溶液转移到截留分子量为1000的透析袋中24小时。透析液冷冻干燥，得到3的固体粉末38.0mg备用。
[0129]
制备：将3的固体粉末(23.5mg)溶解在1.0ml的dmso中，每3分钟将100μl溶液加入3.0ml超声波水中(功率10％)，然后将胶束溶液转移至截止分子量为3000在透析袋中透析12小时后，用450nm过滤器过滤得到3的纳米制剂并进行透射电子显微镜和动态光散射测试。
[0130]
(4)纳米制剂[pt2(se-peg-fa)2(dach)2](4)的合成及制备：
[0131]
合成：pt(dach)cl2(25.3mg，0.067mmol)、agno3(21.5mg，0.127mmol)在3.0ml去离子水中避光搅拌24h，离心除去agcl的白色沉淀。将得到的上清液用220nm滤头过滤后得3.0ml[pt(dach)(h2o)2][no3]2水溶液，随后加入seh-mpeg-fa(5.0mg，0.0025mmol)混匀，搅拌30h后溶液变为褐色液体，透析(截留分子量：1000)24小时后冻干透析液，得到4的5.0mg固体粉末。
[0132]
制备：将4的2.0mg溶于1.0ml的dmso中，每2分钟加入50.0μl至3.0ml超声水(功率10％)，用截流分子量3000透析袋透析4小时，然后用450nm滤膜过滤，将胶束溶液冷冻干燥后备用。
[0133]
(5)罗丹明标记的纳米制剂[pt2(se-peg)2(pph3)4]-rhb(5)的合成：
[0134]
按照纳米制剂1的投料比再外加入seh-mpeg-rhb(0.15mg，0.000075mmol)，后处理与1相同，得到5的67.8mg红色蜡状固体，通过紫外光谱测得其罗丹明掺杂率为4.3％。
[0135]
(6)罗丹明标记的纳米制剂[pt2(se-peg-fa)2(pph3)4]-rhb(6)的合成：
[0136]
按照纳米制剂2的投料比再加入seh-mpeg-rhb(1.0mg，0.0005mmol)，后处理与2相同，得到6的14.0mg红色的粘性产物。
[0137]
(7)罗丹明标记的纳米制剂[pt2(se-peg)2(dach)2]-rhb(7)的合成：
[0138]
按照纳米制剂3的投料比再另外加入seh-mpeg-rhb(3.0mg,0.0015mmol)，后处理与3相同，得到7固体粉末38.0mg备用。通过紫外光谱测得其罗丹明掺杂率为1.73％。
[0139]
(8)纳米制剂[pt2(se-peg-fa)2(dach)2]-rhb(8)的合成:
[0140]
按照纳米胶束4的投料比再另外加入seh-mpeg-rhb(10.0mg,0.005mmol)，后处理与4相同，得到8固体粉末8.0mg备用。
[0141]
表征
[0142]
对实施例1中纳米制剂1-4，通过投射电镜分析、1h核磁共振谱、x射线光电子能谱(eds)、紫外-可见吸收(uv-vis)和傅里叶变换红外(ft-ir)等确定了其组成。
[0143]
(1)对纳米制剂1-4进行透射电镜分析，如图8所示，四种纳米粒子均能形成规则的球型形貌，他们的粒径分别为35
±
7nm(图8(a))，309
±
61nm(图8(b))，60
±
15nm(图8(c))，67
±
18nm(图8(d))。这些颗粒的大小符合用于体外细胞毒性分析和增强的epr效应。
[0144]
(2)纳米制剂1和3的1h核磁共振分析数据如下：如图9-a所示，纳米制剂1在cdcl3中，在7.3-7.7ppm处出现苯环的峰，在3.37ppm处出现甲氧基聚乙二醇(mpeg-sh)上甲氧基的峰。同样地，如图9-b所示，纳米制剂3在dmso-d6核磁数据显示，在5.59ppm和5.01ppm处出现了环己二胺中的氨基的氢谱峰，这些结果表明这两种铂基纳米药物的成功合成。
[0145]
(3)四种纳米制剂药物的傅里叶变换红外(ft-ir)如下：在图10-a和图10-b中，四种纳米制剂在2868cm-1
处有聚乙二醇的-ch
2-对称伸缩振动，在1240cm-1
处有-c-o-c-的不对称伸缩振动，另外在有叶酸靶向的纳米制剂2(a)、4(b)中，在1606cm-1
处有叶酸上-nh的伸缩振动。这些结果表明四种铂基制剂已被成功合成。
[0146]
(4)用x-射线光电子能谱(eds)表征了四种铂类药物的元素种类及分布，如图11-a至图11-d所示，在纳米制剂1中含有pt、s、p、cl、c、o；纳米制剂2中含有pt、s、p、cl、n、c、o；在纳米制剂3和纳米制剂4中含有pt、s、n、cl、c、o。
[0147]
(5)用动态光散射仪测试了四种铂纳米药物的zeta电位，如下图12-a至图12-d所示，纳米制剂1的电位为-7.15mv；纳米制剂2的电位为-1.74mv；纳米制剂3的电位为-3.56mv；纳米制剂4的电位为0.0112mv，电位结果显示纳米药物接近零电位，有利于增强药物的细胞内循环时间和增强的透过与滞留(epr)效应，可以使纳米药物粒子在肿瘤部位积累增加，同时减少毒副作用。
[0148]
测试例
[0149]
免疫原性细胞死亡(icd)的细胞凋亡形式可以由化疗药物(例如蒽环类和奥沙利铂)和物理治疗(如电离辐射、光热治疗、光动力治疗)诱导。icd诱导免疫反应以激活t淋巴细胞来识别肿瘤特异性t细胞。最新证据表明，icd相关的化疗药物如奥沙利铂可以达到化学免疫治疗效果，延长癌症患者的生存期。icd诱导剂激活损伤(或危险)相关分子模式(damage-associated molecular patterns；damps)，主要包括crt暴露、atp释放和hmgb1释放。
[0150]
(1)、如图13-a和图13-b所示，依据crt暴露评估了四种具有rh-b标记的纳米制剂5-8对caco-2细胞和ct-26细胞的icd诱导免疫原性的潜力。对于caco-2细胞，如图13-a所示，由共聚焦显微可以观察到纳米制剂7和8对caco-2细胞的免疫荧光效果最明显，crt逐渐从细胞核外翻并暴露到细胞膜上，证明具有dach配体的纳米制剂可以刺激并激活较强的icd效果；而其他纳米制剂5、6免疫荧光主要在细胞核上，暴露在细胞膜上的荧光较弱，故纳米制剂5、6对caco-2细胞的icd效果差。对于ct-26细胞，如图13-b所示，纳米制剂5-8的免疫荧光始终聚集在细胞核上，没有观察到在细胞膜上的荧光转移，因此，纳米制剂5-8对ct-26细胞没有icd效果。总之，通过免疫荧光法可知具有dach配体的纳米制剂7(3)和8(4)对caco-2细胞具有优异的icd效果，可作为一种对caco-2细胞产生icd的潜在药物。
[0151]
(2)、为了进一步探究这些铂基纳米药物的抗肿瘤活性，将不同类别的铂基纳米药物配置成不同浓度梯度的pbs水溶液，分别加入贴壁细胞培育液中，在室温，5％co2孵育20h
后，再加入mtt溶液，继续培育4h后，再加入dmso充分溶解结晶的甲瓒(活细胞可以使mtt代谢为甲赞晶体)，用酶联免疫检测仪在570nm波长处测定其光吸收值，在一定细胞数量范围内，mtt结晶形成的量与活细胞数成正比，从而间接反应铂基药物的细胞毒性。本研究选用黑色素瘤为癌细胞仅研究了纳米制剂1和纳米制剂2两种铂基药物的细胞毒性，分析数据如下：从图14-a中看到纳米制剂1对黑色素瘤的毒性不显著，但从图14-b可以得出具有叶酸靶向的纳米制剂2有明显的毒性，当药物浓度在36.60μg/ml时，细胞存活率在50％左右。如图14-c所示，通过计算得2的半抑制浓度(ic
50
)值为40.59μg/ml。随后将罗丹明b作为荧光探针掺杂到纳米制剂1中，得到罗丹明掺杂量为7.3％的纳米制剂5。接着，运用纳米制剂5进行细胞吞噬实验如图15所示，随着吞噬时间得延长，细胞质内的荧光强度逐渐增加，因此，细胞吞噬实验表明该类铂基药物能进入细胞，并主要分布在细胞质中。
[0152]
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引申出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。