DAPK可变剪切转录本在间充质干细胞成骨向分化中的应用的制作方法

沉默dapk
‑
x1、dapk
‑
x2则可促进成骨分化，一方面为dapk在抑制间充质干细胞成骨向 分化过程中提供了应用依据，为有针对性的运用小分子化合物抑制靶蛋白活性，在克服异位 成骨的治疗方面提供了全新的理论和实验依据；另一方面也为dapk在以间充质干细胞为基 础的骨组织工程技术的临床转化应用方面提供了新的思路。
12.本发明提供了一种促进间充质干细胞成骨向分化的方法，即通过敲减dapk
‑
x1和/或 dapk
‑
x2来促进间充质干细胞成骨向分化。该方法可以应用于骨组织再生的治疗方面。
13.优选地，上述的一种促进间充质干细胞成骨向分化的方法，具体为通过sirna沉默间充 质干细胞中的dapk
‑
x1和/或dapk
‑
x2的方式来促进间充质干细胞成骨向分化。
14.进一步地，所述sirna为dapk si2，所述dapk si2的核苷酸序列如seq id no.3所示。
15.本发明提供了一种抑制间充质干细胞成骨向分化的方法，即通过过表达dapk
‑
x1和/或 dapk
‑
x2来抑制间充质干细胞成骨向分化。该方法可以应用于克服异位成骨的问题。
16.优选地，上述的一种抑制间充质干细胞成骨向分化的方法，具体为通过向间充质干细胞 转染过表达dapk
‑
x1质粒和/或过表达dapk
‑
x2质粒的方式来抑制间充质干细胞成骨向分 化。
17.本发明提供了一种间充质干细胞成骨向分化增强剂，该增强剂包括dapk si2，所述dapksi2的核苷酸序列如seq id no.3所示。
18.本发明提供了一种间充质干细胞成骨向分化抑制剂，该抑制剂包括过表达dapk
‑
x1质 粒和/或过表达dapk
‑
x2质粒。
19.与现有技术相比，本发明的有益效果是：
20.本发明经研究发现了两个与调控成骨向分化密切相关的基因，即dapk可变剪切转录本 dapk
‑
x1和dapk
‑
x2。并且发现，dapk
‑
x1和/或dapk
‑
x2的过表达能够抑制间充质干细 胞成骨向分化，沉默，dapk
‑
x1和/或dapk
‑
x2则可促进间充质干细胞成骨向分化，从而揭 示了dapk
‑
x1、dapk
‑
x2对间充质干细胞成骨向分化的调控作用，说明dapk
‑
x1、dapk
‑
x2 可以用于抑制或促进间充质干细胞成骨向分化，从而克服异位成骨或诱导骨组织再生；一方 面为研发小分子化学工具调控干细胞成骨定向分化提供了全新的作用靶点，另一方面为以干 细胞为基础的骨组织工程技术的临床转化应用奠定了坚实的基础。
附图说明
21.图1为5’和3’race的pcr产物的电泳图；
22.图2为dapk、dapk
‑
x1和dapk
‑
x2核苷酸长度示意图；
23.图3为人骨髓间充质干细胞成骨向分化过程中dapk
‑
x1、dapk
‑
x2的表达量变化图；
24.图4为过表达dapk
‑
x1、dapk
‑
x2分子对人骨髓间充质干细胞成骨向分化的影响图 (prk5为空载体，是阴性对照)；
25.图5为敲减dapk
‑
x1、dapk
‑
x2基因对人骨髓间充质干细胞成骨向分化的影响图。
具体实施方式
26.下面对本发明的具体实施方式作进一步说明。在此需要说明的是，对于这些实施方式的 说明用于帮助理解本发明，但并不构成对本发明的限定。此外，下面所描述的本发
明各个实施方式中所涉及的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
27.下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为可通过常规的商业途径购买得到。
28.实施例中涉及的中英文缩写如下：
29.alpalkalinephosphatase，碱性磷酸酶；
30.bcabicinchoninincacid，二辛可宁酸；
31.dapkdeath
‑
associatedproteinkinase，死亡相关蛋白激酶；
32.depcdiethypyrocarbonate，焦碳酸二乙酯；
33.gapdhglyceraldehyde
‑3‑
phosphatedehydrogenase，甘油醛
‑3‑
磷酸脱氢酶；
34.bmp2bonemorphogeneticprotein2，骨形态发生蛋白2；
35.ocnosteocalcin，骨钙素；
36.qrt
‑
pcrquantitativereversetranscriptionpcr，逆转录定量聚合酶链式反应；
37.runx2runt
‑
relatedtranscriptionfactor2runt，相关转录因子2；
38.cpccetylpyridinechloridemonohydrate，氯化十六烷基吡啶一水。
39.实施例1dapk可变剪切转录本dapk
‑
x1、dapk
‑
x2的鉴定和测序
40.1、细胞培养
41.人骨髓间充质干细胞来源于健康志愿者，已获得中山大学附属第八医院伦理委员会的审核批准。所用增殖培养基为低糖dmem(购自gibco)添加10％胎牛血清(购自四季青公司)。将培养至p3代的msc(培养方法见发表文献：pengw,liy,huangl.effectsandsafetyofallogenicmesenchymalstemcellintravenousinfusioninactiveankylosingspondylitispatientswhofailednsaids:a20
‑
weekclinicaltrial.[j].celltransplantation,2014,23(10):1293
‑
303.)接种于培养皿中，利用增殖培养基在37℃、5％co2下进行培养，每3天半量换液1次，倒置显微镜下观察细胞生长至80％汇合状态时，使用0.25％胰蛋白酶消化传代，传代后的p3
‑
p5代msc用于相关实验。
[0042]
2、rna提取：
[0043]
(1)将人骨髓间充质干细胞(上述传代后的p3
‑
p5代msc)接种至六孔板中，利用增殖培养基培养，当细胞达到90％融合状态时，加入1mltrizol收集细胞，然后转移至1.5ml离心管中，室温放置5min；再加入200μl氯仿，混匀后将离心管置于低温高速离心机中，12000rpm离心15min，取上清400μl；
[0044]
(2)往上清中加入等体积异丙醇，混匀后放置10min；将离心管置于低温高速离心机中，12000rpm离心10min，小心去除上清；
[0045]
(3)将1ml75％乙醇加入到沉淀中，颠倒混匀后，将离心管置于低温高速离心机中，12000rpm、4℃离心5min；小心去除上清，静置至乙醇完全蒸发；
[0046]
(4)加入depc水溶解沉淀，测定rna纯度和浓度。选取a260/280比值在1.9
‑
2.1之间，且浓度大于100ng/ul的rna样品进行后续的实验。
[0047]
3、cdna末端快速扩增(race)实验：参考已发表文献(tang,s.；xie,z.；wang,p.；li,j.；wang,s.；liu,w.；li,m.；wu,x.；su,h.；cen,s.etal.lncrna
‑
ogpromotestheosteogenicdifferentiationofbonemarrow
‑
derivedmesenchymalstemcells
undertheregulationofhnrnpk.stemcells2019,37,270
‑
283.)，具体配置体系如下：
[0048]
(1)逆转录反应参照反转录试剂盒race5’/3’kit，购自clontech,mountainview,ca。
[0049]
逆转录反应体系为：5
×
first
‑
strandbuffer4μl；dtt(100mm)0.5ul；dntps(20mm)1.0ul；rnaseinhibitor(40u/ul)0.5ul；smartscribereversetranscriptase(100u)2.0ul；5
’‑
cdsprimera/3
’‑
cdsprimera1ul；rna1ul。其中在5
’‑
rcae反应体系中，还需要向每个反应体系加入1ulsmarteriiaoligonucleotide(补齐至12ul)。随后在pcr仪上42℃孵育90min；加热至70℃持续10min，得到cdna.
[0050]
(2)溶解稀释cdna：逆转录反应后，使用tricine
‑
edtabuffer溶解得到的单链cdna合成产物，溶解后得到的cdna产物储存于
‑
20℃，最多保存3个月。经上述步骤得到的cdna量足够进行多次race实验。
[0051]
3、race
‑
pcrcdna扩增；
[0052]
(1)配制race
‑
pcr所需的反应体系(5
’‑
race和3
’‑
race同样适用)：pcr
‑
gradeh2o3.1ul；2
×
seqampbuffer5ul；seqampdnapolymerase0.2ul；5’/3
’‑
racecdna0.5ul；10
×
upm1ul；5’/3’racegsp(10um)0.2ul。
[0053]
其中，5’racegsp的序列为：
[0054]5’‑3’
:gattacgccaagcttaccacccgcactgctcggccgatga；
[0055]3’
racegsp的序列为：
[0056]5’‑3’
:ggccactcgggatccgggaaaacca；
[0057]
轻轻用枪头混匀上述反应体系。
[0058]
(2)pcr1(gspt
m
＞70℃)的反应程序为：
[0059]
5cycles：
[0060]
94℃30sec；72℃3min；
[0061]
5cycles：
[0062]
94℃30sec；70℃30sec；72℃3min；
[0063]
20cycles(polya)or25cycles(totalrna)：
[0064]
94℃30sec；68℃30sec；72℃3min。
[0065]
(3)pcr2(gsp60℃＜t
m
＜70℃)的反应程序为：
[0066]
20cycles(polya)or25cycles(totalrna)：
[0067]
94℃30sec；68℃30sec；72℃3min。
[0068]
上述步骤可以对长度在3kbp以内的dna片段进行克隆，若dna片段过长则增加延伸时间；
[0069]
(4)dna电泳检验：
[0070]
取上述步骤获得的pcr终产物5ul用1.2％琼脂糖凝胶进行dna电泳检验race实验结果。
[0071]
图1为本实施案例中5’和3’race的pcr产物的电泳图。其中，图1a为5
‘
race实验得到5
‘
racegsp上游存在三种不同5’端序列的cdna分子，根据后续测序结果可知从上到下分别为dapk/dapk
‑
x1/dapk
‑
x2的5’race结果；图1b为3
‘
race结果只存在一种cdna分子。
[0072]
(5)电泳，切胶：
[0073]
切割目标条带，提取回收目标dna(图1a中的三个条带，图1b中的一个条带)；详 细步骤见dna胶回收试剂盒，购自擎科生物(tsingke)，货号：tsp601
‑
200；
[0074]
(6)构建载体及转染：
[0075]
1)混合以下溶液构建质粒载体，相关试剂购自clontech,mountain view,ca：
[0076]
lineareized prace vector 1ul；gel
‑
purified race product(步骤(5)的胶回收产物)7ul； in
‑
fusion hd master mix 2ul。
[0077]
将上述混合体系置于50℃孵育连接15min，然后置于冰上，得到连接产物mix。
[0078]
2)转染感受态细胞：
[0079]
①
细菌准备：将感受态细胞(购自吉凯基因，货号：232213)(e
·
coli)从
‑
80℃取出， 在冰上解冻；
[0080]
②
转染感受态细胞(以下都在超净台中操作)：立即将10ul上述的连接产物mix加入 到100ul感受态细胞(e
·
coli)中(或将5ul连接产物加入到50ul感受态细胞中，比例不能 超过1：10，否则影响转染效率)，置于冰上30min；
[0081]
③
热激活：将冰浴好的感受态细胞放入42℃水浴锅中，不要晃动，准确热激90s；水浴 后立即放入冰中，静置3min；
[0082]
④
缓冲水浴：向离心管中加入900ul不含抗生素的lb培养基或soc培养基，37℃水浴 静置10min；
[0083]
⑤
复苏培养：水浴后置于摇床培养箱中，37℃，150rpm振荡培养45min，使菌体复苏， 抗性基因表达。
[0084]
⑥
离心&涂板：复苏后2500g离心5min，吸弃900ul上清液，用剩下的液体将菌体重悬， 用无菌涂布棒在含有特定抗生素(氨苄青霉素)的固体lb培养基上将细菌涂布均匀，室温 正置10min。待液体被培养基吸干后，37℃倒置培养过夜，12
‑
16h后长出菌落。
[0085]
(7)单克隆抗体菌落培养和质粒提取：
[0086]
1)挑选菌落与培养：每个lb平板上挑取4个单克隆菌落，用小枪头刺挑后丢入盛有4mllb培养基(含特定抗生素如amp)的15ml离心管中；离心管稍拧开管盖以利于空气流通， 然后用胶带固定管盖，置于摇床机中，37℃，180rpm摇床培养过夜。
[0087]
2)提取质粒，使用快速质粒小提试剂盒(购自艾基生物，k110
‑
s)。
[0088]
3)送测序：
[0089]
吸取100ng质粒或10
‑
15ul质粒，连同引物(5’race gsp和3’race gsp)一起送 艾基生物科技有限公司进行测序。测序结果显示，3’race只检测出一种dapk的3’端核 苷酸序列，即正常的dapk末端序列。然而，5’race中检测出3种5’端不同的dapk相 关核苷酸序列，分别为正常的dapk以及5’缩短了的两个变异体(未见报道)的dapk， 具体长度见图2示例。并将上述两个可变剪切体分别定义为dapk
‑
x1和dapk
‑
x2，其核苷 酸序列分别如下：
[0090]
dapk
‑
x1：
[0091]
atggagaaattcaagaagtttgcagcccggaaaaaatggaaacaatccgttcgct tgatatcactgtgccaaagattatccaggtcattcctgtccagaagtaacatgagtgtt gccagaagcgatgatactctggatgaggaagactcctttgtgatgaaagccatcatcc atgccatcaacgatgacaatgtcccaggcctgcagcaccttctgggctcattatccaac tatgatgttaaccaacccaacaagcacgggacacctccattactcattgctgctggctg tgggaatattcaaatactacagttgctcattaaaagaggctcgagaatcgatgtccag gataagggcgggtccaat
gccgtctactgggctgctcggcatggccacgtcgatacct tgaaatttctcagtgagaacaaatgccctttggatgtgaaagacaagtctggagagat ggccctccacgtggcagctcgctatggccatgctgacgtggctcagttactgtgcagct tcggctcaaatcccaatatccaggacaaggaagaagaaacccccctgcactgtgctgc ttggcacggctattactctgtggccaaagccctttgtgaagccggctgtaacgtgaaca tcaagaaccgagaaggagagacgcccctcctgacagcctctgccaggggctaccacga catcgtggagtgtctggccgaacatggagccgaccttaatgcttgcgacaaggacgga cacattgcccttcatctggctgtaagacggtgtcagatggaggtaatcaagactctcct cagccaagggtgtttcgtcgattatcaagacaggcacggcaatactcccctccatgtg gcatgtaaagatggcaacatgcctatcgtggtggccctctgtgaagcaaactgcaatt tggacatctccaacaagtatgggcgaacgcctctgcaccttgcggccaacaacggaat cctagacgtggtccggtatctctgtctgatgggagccagcgttgaggcgctgaccacg gacggaaagacggcagaagatcttgctagatcggaacagcacgagcacgtagcaggt ctccttgcaagacttcgaaaggatacgcaccgaggactcttcatccagcagctccgac ccacacagaacctgcagccaagaattaagctcaagctgtttggccactcgggatccgg gaaaaccacccttgtagaatctctcaagtgtgggctgctgaggagctttttcagaagg cgtcggcccagactgtcttccaccaactccagcaggttcccaccttcacccctggcttc taagcccacagtctcagtgagcatcaacaacctgtacccaggctgcgagaacgtgagt gtgaggagccgcagcatgatgttcgagccgggtcttaccaaagggatgctggaggtgt ttgtggccccgacccaccacccgcactgctcggccgatgaccagtccaccaaggccat cgacatccagaacgcttatttgaatggagttggcgatttcagcgtgtgggagttctctg gaaatcctgtgtatttctgctgttatgactattttgctgcaaatgatcccacgtcaatcc atgttgttgtctttagtctagaagagccctatgagatccagctgaaccaagtgattttc tggctcagtttcctgaagtcccttgtcccagttgaagaacccatagccttcggtggcaa gctgaagaacccactccaagttgtcctggtggccacccacgctgacatcatgaatgttc ctcgaccggctggaggcgagtttggatatgacaaagacacatcgttgctgaaagagat taggaacaggtttggaaatgatcttcacatttcaaataagctgtttgttctggatgctg gggcttctgggtcaaaggacatgaaggtacttcgaaatcatctgcaagaaatacgaag ccagattgtttcggtctgtcctcccatgactcacctgtgtgagaaaatcatctccacgc tgccttcctggaggaagctcaatggacccaaccagctgatgtcgctgcagcagtttgt gtacgacgtgcaggaccagctgaaccccctggccagcgaggaggacctcaggcgcatt gctcagcagctccacagcacaggcgagatcaacatcatgcaaagtgaaacagttcagg acgtgctgctcctggacccccgctggctctgcacaaacgtcctggggaagttgctgtcc gtggagaccccacgggcgctgcaccactaccggggccgctacaccgtggaggacatcc agcgcctggtgcccgacagcgacgtggaggagctgctgcagatcctcgatgccatgga catctgcgcccgggacctgagcagcgggaccatggtggacgtcccagccctgatcaag acagacaacctgcaccgctcctgggctgatgaggaggacgaggtgatggtgtatggtg gcgtgcgcatcgtgcccgtggaacacctcacccccttcccatgtggcatctttcacaag gtccaggtgaacctgtgccggtggatccaccagcaaagcacagagggcgacgcggac atccgcctgtgggtgaatggctgcaagctggccaaccgtggggccgagctgctggtgc tgctggtcaaccacggccagggcattgaggtccaggtccgcggcctggagacggagaa gatcaagtgctgcctgctgctggactcggtgtgcagcaccattgagaacgtcatggcc accacgctgccagggctcctgaccgtgaagcattacctgagcccccagcagctgcggg agcaccatgagcccgtcatgatctaccagccacgggacttcttccgggcacagactct gaaggaaacctcactgaccaacaccatgggggggtacaaggaaagcttcagcagcat catgtgcttcgggtgtcacgacgtctactcacaggccagcctcggcatggacatccatg catcagacctgaacctcctcactcggaggaaactgagtcgcctgctggacccgcccga ccccctggggaaggactggtgccttctcgccatgaacttaggcctccctgacctcgtgg caaagtacaacaccagtaacggggctcccaaggatttcctccccagccccctccacgc cctgctgcgggaatggaccacctaccctgagagcacagtgggcaccctcatgtccaaa ctgagggagctgggtcgccg
ggatgccgcagactttttgctgaaggcatcctctgtgtt caaaatcaacctggatggcaatggccaggaggcctatgcctcgagctgcaacagcggc acctcttacaattccattagctctgttgtatcccggtga。
[0092]
dapk
‑
x2：
[0093]
atggaggtaatcaagactctcctcagccaagggtgtttcgtcgattatcaagaca ggcacggcaatactcccctccatgtggcatgtaaagatggcaacatgcctatcgtggt ggccctctgtgaagcaaactgcaatttggacatctccaacaagtatgggcgaacgcct ctgcaccttgcggccaacaacggaatcctagacgtggtccggtatctctgtctgatggg agccagcgttgaggcgctgaccacggacggaaagacggcagaagatcttgctagatc ggaacagcacgagcacgtagcaggtctccttgcaagacttcgaaaggatacgcaccga ggactcttcatccagcagctccgacccacacagaacctgcagccaagaattaagctca agctgtttggccactcgggatccgggaaaaccacccttgtagaatctctcaagtgtgg gctgctgaggagctttttcagaaggcgtcggcccagactgtcttccaccaactccagca ggttcccaccttcacccctggcttctaagcccacagtctcagtgagcatcaacaacctg tacccaggctgcgagaacgtgagtgtgaggagccgcagcatgatgttcgagccgggtc ttaccaaagggatgctggaggtgtttgtggccccgacccaccacccgcactgctcggc cgatgaccagtccaccaaggccatcgacatccagaacgcttatttgaatggagttggc gatttcagcgtgtgggagttctctggaaatcctgtgtatttctgctgttatgactatttt gctgcaaatgatcccacgtcaatccatgttgttgtctttagtctagaagagccctatga gatccagctgaaccaagtgattttctggctcagtttcctgaagtcccttgtcccagttg aagaacccatagccttcggtggcaagctgaagaacccactccaagttgtcctggtggc cacccacgctgacatcatgaatgttcctcgaccggctggaggcgagtttggatatgac aaagacacatcgttgctgaaagagattaggaacaggtttggaaatgatcttcacattt caaataagctgtttgttctggatgctggggcttctgggtcaaaggacatgaaggtactt cgaaatcatctgcaagaaatacgaagccagattgtttcggtctgtcctcccatgactca cctgtgtgagaaaatcatctccacgctgccttcctggaggaagctcaatggacccaac cagctgatgtcgctgcagcagtttgtgtacgacgtgcaggaccagctgaaccccctgg ccagcgaggaggacctcaggcgcattgctcagcagctccacagcacaggcgagatca acatcatgcaaagtgaaacagttcaggacgtgctgctcctggacccccgctggctctg cacaaacgtcctggggaagttgctgtccgtggagaccccacgggcgctgcaccactac cggggccgctacaccgtggaggacatccagcgcctggtgcccgacagcgacgtggag gagctgctgcagatcctcgatgccatggacatctgcgcccgggacctgagcagcggga ccatggtggacgtcccagccctgatcaagacagacaacctgcaccgctcctgggctga tgaggaggacgaggtgatggtgtatggtggcgtgcgcatcgtgcccgtggaacacctc acccccttcccatgtggcatctttcacaaggtccaggtgaacctgtgccggtggatcca ccagcaaagcacagagggcgacgcggacatccgcctgtgggtgaatggctgcaagct ggccaaccgtggggccgagctgctggtgctgctggtcaaccacggccagggcattgag gtccaggtccgcggcctggagacggagaagatcaagtgctgcctgctgctggactcgg tgtgcagcaccattgagaacgtcatggccaccacgctgccagggctcctgaccgtgaa gcattacctgagcccccagcagctgcgggagcaccatgagcccgtcatgatctaccag ccacgggacttcttccgggcacagactctgaaggaaacctcactgaccaacaccatgg gggggtacaaggaaagcttcagcagcatcatgtgcttcgggtgtcacgacgtctactc acaggccagcctcggcatggacatccatgcatcagacctgaacctcctcactcggagg aaactgagtcgcctgctggacccgcccgaccccctggggaaggactggtgccttctcg ccatgaacttaggcctccctgacctcgtggcaaagtacaacaccagtaacggggctcc caaggatttcctccccagccccctccacgccctgctgcgggaatggaccacctaccctg agagcacagtgggcaccctcatgtccaaactgagggagctgggtcgccgggatgccgc agactttttgctgaaggcatcctctgtgttcaaaatcaacctggatggcaatggccagg aggcctatgcctcgagctgcaacagcggcacctcttacaattccattagctctgttgta tcccggtga。
[0094]
如图2所示，dapk
‑
x1和dapk
‑
x2的核苷酸序列总长度分别为3417bp和2625bp，与 dapk的4293bp长度相比，分别在5’端减少了876bp和1668bp，其余序列与dapk(在ncbi 的基因id为1416)一致。
[0095]
实施例2人骨髓间充质干细胞成骨向分化过程中dapk
‑
x1、dapk
‑
x2的表达量变化
[0096]
(1)细胞培养和成骨向分化诱导：
[0097]
1)细胞培养见实施例1。
[0098]
2)将人骨髓间充质干细胞接种至六孔板中，37℃、5％co2条件下培养，加入成骨分化 培养基，成骨向分化培养基包括增殖培养基，0.2mm维生素c，10mmβ
‑
磷酸甘油钠和100 nm地塞米松。每2天半量换液1次。分别在第0天，3天，7天和14天(每组设置3个重 复)收集蛋白。
[0099]
(2)蛋白质印记实验：
[0100]
1)收集上述成骨向分化诱导不同天数的细胞蛋白，每孔加入80ul ripa裂解液(购自北 京康为世纪生物科技有限公司)，细胞充分裂解后，使用细胞刮刀将细胞刮下，并将细胞收 集至离心管中；
[0101]
2)冰上放置30min，使细胞完全裂解；
[0102]
3)4℃，12000g离心20分钟，吸取上清，使用bca法检测蛋白浓度(用于后续实验的 蛋白浓度不低于0.5ug/ul)，99℃煮5min，即得到蛋白样品；
[0103]
4)配置10％sds
‑
page胶，每孔加入10ug等量蛋白样品；
[0104]
5)100v恒压电泳，待电泳条带完全跑出浓缩胶时，将电压调整至120v，直至溴酚蓝完 全跑出分离胶；
[0105]
6)按照海绵—滤纸—分离胶—膜—滤纸—海绵的顺序放置转膜夹，250ma电转1.5h；
[0106]
7)电转结束后，将pvdf膜取出置于5％的脱脂奶粉中，摇床封闭1h；
[0107]
8)按照蛋白大小，将dapk、bmp2、smad1/5/8、runx2和gapdh(gapdh为内参， bmp2/smad1/5/8和runx2为成骨强弱标记物，上调表示骨化能力增强)蛋白分子量相对应 的条带剪下，孵育相应的一抗，4℃摇床封闭过夜；
[0108]
9)使用tbst洗膜3次，每次10min，孵育二抗，室温摇床孵育60min；
[0109]
10)使用tbst洗膜3次，每次10min，洗好后，进行曝光，得到的结果如图3所示。
[0110]
(3)实验结果
[0111]
图3显示了人骨髓间充质干细胞在成骨培养0天，7天，14天后dapk、dapk
‑
x1、 dapk
‑
x2蛋白分子的表达量上升。
[0112]
实施例3过表达dapk
‑
x1、dapk
‑
x2对人骨髓间充质干细胞成骨向分化的影响
[0113]
(1)质粒表达
[0114]
过表达质粒载体prk5购自addgene，过表达dapk、dapk
‑
x1、dapk
‑
x2的质粒由和 元生物技术有限公司构建完成。在人骨髓间充质干细胞生长至70％
‑
80％汇合状态时，将质粒 用lipofectamine 3000 transfection kit(包含p3000和lipo 3000，购自英潍捷基)按照说明书 方法转入间充质干细胞中，24小时后更换为成骨向分化培养基，分化7天和14天后收集rna 和蛋白质，14天后进行茜素红染色。
[0115]
(2)茜素红染色步骤：
[0116]
1)弃去培养基，用pbs洗涤3次，每孔加入4％多聚甲醛，室温固定30min；
[0117]
2)弃去多聚甲醛，用pbs洗涤3次；
[0118]
3)每孔加入1ml适量茜素红(购自索莱宝，g8550)染色液，染色15分钟；
[0119]
4)用pbs洗涤3次，进行拍照；
[0120]
5)加入1ml10％cpc(购自上海生工，a600106
‑
0100)溶液，摇床1小时，通过分光 光度计进行茜素红相对定量检测。
[0121]
(3)按照实施例2中的方法进行蛋白提取/蛋白质印记。
[0122]
(4)rna提取，逆转录及qpcr检测：
[0123]
1)对步骤(1)中过表达相应质粒后的msc进行成骨向诱导后加入1ml trizol(购自 invitrogen)收集细胞，转移至1.5ml离心管中，室温放置5min；加200μl氯仿，混匀后将 离心管置于低温高速离心机中，12000rpm离心15min，取上清400μl；
[0124]
2)将上清加入到等体积的异丙醇中后混匀，并放置10min；将离心管置于低温高速离心 机中，12000rpm离心10min，小心去除上清；
[0125]
3)将1ml 75％乙醇加入到沉淀中，颠倒混匀后，将离心管置于低温高速离心机中，4℃ 下12000rpm离心5min；小心去除上清，静置至乙醇完全蒸发；
[0126]
4)加入depc水溶解沉淀，测定rna纯度，选取a260/280为1.9
‑
2.1，且浓度不低于 100ng/ul的rna样品进行后续的实验。
[0127]
5)逆转录反应
[0128]
逆转录反应参照反转录试剂盒primescript rt reagent kit(takara,tokyo,japan)。
[0129]
逆转录的反应体系为：5
×
prime script rt master mix 2μl；rna模板0.5μg；rnase free 水至10μl。
[0130]
逆转录的反应条件为：37℃15min；85℃5s；4℃冷却。
[0131]
6)实时荧光定量pcr：
[0132]
实时荧光定量pcr按照power sybr green pcrmaster mix试剂盒进行扩增，反应条件 为：95℃120s；95℃30s，60℃45s，35个循环。
[0133]
按照2
‑
δδct方法处理实时定量pcr的数据，计算bmp2、runx2、alp、ocn基因 (bmp2、runx2、alp、ocn为成骨强弱的指标，上述指标上调表示成骨能力增强)的转 录水平，实验结果如图4所示。在扩增过程中引物序列如下：
[0134]
bmp2：
[0135]
f：5
’‑‑3’
acccgctgtcttctagcgt；
[0136]
r：5
’‑‑3’
tttcaggccgaacatgctgag。
[0137]
runx2：
[0138]
f：5
’‑‑3’
tggttactgtcatggcgggta；
[0139]
r：5
’‑‑3’
tctcagatcgttgaaccttgcta。
[0140]
alp：
[0141]
f：5
’‑‑3’
accaccacgagagtgaacca；
[0142]
r：5
’‑‑3’
cgttgtctgagtaccagtccc。
[0143]
ocn：
其成骨相关蛋白和rna表达量改变不明显。
[0170]
综上所述可知，dapk
‑
x1、dapk
‑
x2在间充质干细胞成骨向分化过程中表达量逐渐升 高；dapk
‑
x1、dapk
‑
x2的过表达可抑制间充质干细胞成骨向分化，反之则促进成骨分化。 可见，dapk
‑
x1、dapk
‑
x2的过表达能够抑制间充质干细胞成骨向分化能力，为促进间充 质干细胞小分子靶点的应用和以间充质干细胞为基础的骨组织工程技术的临床转化应用提供 了新的思路。
[0171]
以上对本发明的实施方式作了详细说明，但本发明不限于所描述的实施方式。对于本领 域的技术人员而言，在不脱离本发明原理和精神的情况下，对这些实施方式进行多种变化、 修改、替换和变型，仍落入本发明的保护范围内。