一种靶向真菌β-碳酸酐酶的抑制剂及其制备方法和应用与流程

技术特征：
1.一种靶向真菌β-碳酸酐酶的抑制剂的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：s101：将待筛选抗真菌化合物及对照药物分别用dmso溶解后配置成浓度为6mg/ml～7mg/ml的母液，在-85℃～-75℃温度下保存；s102：将所述对照药物配置成母液，在-85℃～-75℃温度下保存；s103：分别取上述母液，将每一种母液分别加入rpmi 1640培养液，充分振荡混匀，稀释为640μg/ml中间浓度；s104：将50μl待筛选抗真菌化合物和浓度为6.4mg/ml阳性药母液加入到含450μlrpmi 1640培养液的1ml深孔板中混匀；氟康唑母液取160μl，加入含340μl rpmi 1640培养液的1ml深孔板中混匀，各药物得浓度为640μg/ml测试液；10级倍比稀释，得到640～1.25μg/ml 10个浓度的测试液；s105：取上述各测试液640～1.25μg/ml 10个浓度的测试液各20μl，分别分装于96孔板各排2～11号孔内制成药敏板；s106：将受试菌株分别制备成浓度介于1
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103～5
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103cfu/ml的酵母菌菌悬液和浓度介于2
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103～1
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104cfu/ml丝状真菌菌悬液；s107：取药敏板中依次加入上述于每排1号孔加rpmi 1640培养液200μl，作空白对照；12号孔加待测菌株200μl，作阴性对照；药敏板每排2～11号孔分别加菌液180μl，充分混匀，使各孔的最终药物浓度分别为64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25和0.125μg/ml，各孔中dmso含量均低于1％；12号孔不含药物，作阴性对照；药敏板h排为氟康唑和质控菌株近平滑念珠菌atcc22019；s108：针对所述待筛选抗真菌化合物的适宜温度范围对所述待筛选抗真菌化合物进行培养；s109：通过培养结果确定最低抑菌浓度，选择得到靶向真菌β-碳酸酐酶的抑制剂。2.根据权利要求1所述的靶向真菌β-碳酸酐酶的抑制剂的制备方法，其特征在于，在所述步骤s106中，所述受试菌株选自白假丝酵母菌y0109、白假丝酵母菌sc5314、近平滑假丝酵母菌atcc 22019、光滑假丝酵母菌537、新生隐球菌32609、石膏状小孢子菌cmccfmza、红色毛癣菌cmccftla和烟曲霉菌07544中的至少一种。3.根据权利要求1所述的靶向真菌β-碳酸酐酶的抑制剂的制备方法，其特征在于，在所述步骤s101中，所述真菌培养基至少选自rpmi 1640培养液、yepd培养液、沙堡葡萄糖琼脂培养基和马铃薯葡萄糖琼脂培养基中的一种。4.根据权利要求2所述的靶向真菌β-碳酸酐酶的抑制剂的制备方法，其特征在于，在所述步骤s108中，白假丝酵母菌、光滑假丝酵母菌或近平滑假丝酵母菌在35℃静置培养24h；和/或，新隐球菌35℃静置培养72h；和/或，红色毛癣菌30℃静置培养4-7天；和/或，石膏状小孢子菌30℃静置培养4-7天；和/或，烟曲霉菌35℃静置培养24h。5.根据权利要求1所述的靶向真菌β-碳酸酐酶的抑制剂的制备方法，其特征在于，所述抗真菌化合物为甲基-5-({5-硝基-1,3-噻唑-2-基}磺酰基)-1,3,4-噻二唑-2-基氨基甲酸叔丁酯，所述对照药物至少选自氟康唑、伊曲康唑、伏立康唑、酮康唑和特比萘芬中的一种。
6.根据权利要求5所述的靶向真菌β-碳酸酐酶的抑制剂的制备方法，其特征在于，在所述步骤s 102中，配置浓度为2mg/ml的氟康唑注射液，浓度为6.4mg/ml伊曲康唑、6.4mg/ml伏立康唑、6.4mg/ml酮康唑、6.4mg/ml特比萘芬、1280μg/ml氟康唑母液。7.根据权利要求1所述的靶向真菌β-碳酸酐酶的抑制剂的制备方法，其特征在于，在所述步骤s 102中，所述酵母菌悬液的制备方法包括如下步骤：将所述受试菌株于sda平皿上活化2次后将活化菌株划线接种于sda平皿，35℃培养24h，挑取直径大于1mm的菌落5个，将其溶解于灭菌三蒸水中，于振荡器上震荡15sec制备成菌悬液，再用血细胞计数板将菌悬液浓度用rpmi 1640培养液调整至1
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106～5
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106cfu/ml，再将上述已经配置好的菌悬液用rpmi 1640培养液稀释1000倍，使其浓度介于1
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103～5
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103cfu/ml之间。8.根据权利要求1所述的靶向真菌β-碳酸酐酶的抑制剂的制备方法，其特征在于，在所述步骤s 102中，所述丝状真菌悬液的制备方法包括如下步骤：将所述受试菌株于pda平皿上活化7d，以诱导分生孢子以及孢囊孢子的形成；在孵育7d的菌落上加入含有0.01ml吐温20的0.85％盐水1ml，制备菌悬液；菌悬液静置3～5min后，取上层均质液体；用血细胞计数板将菌悬液浓度用rpmi1640培养液调整至2
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106～1
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107cfu/ml；将上述已经配置好的菌悬液用rpmi1640培养液稀释1000倍，使其浓度介于2
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103～1
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104cfu/ml之间。9.权利要求1-8任一项所述的方法制备得到的靶向真菌β-碳酸酐酶的抑制剂。10.权利要求1-8任一项所述的方法在筛选抑制剂中的应用。

技术总结
本发明提出了一种靶向真菌β-碳酸酐酶的抑制剂及其制备方法和应用，包括如下步骤：将待筛选抗真菌化合物及对照药物配置成母液；将对照药物配置成母液；上述母液分别加入RPMI1640培养液，充分振荡混匀，稀释；将待筛选抗真菌化合物和母液加入到含RPMI的深孔板中混匀；制备药敏板；将受试菌株分别制备成酵母菌悬液和丝状真菌悬液；针对待筛选抗真菌化合物的适宜温度范围在药敏板中对待筛选抗真菌化合物进行培养；通过培养结果确定最低抑菌浓度，选择得到靶向真菌β-碳酸酐酶的抑制剂。本发明的靶向真菌β-碳酸酐酶的抑制剂的制备方法，可以有效筛选出具有较强抑制真菌活性的药物。物。物。


技术研发人员：王景峰 王尚 谌志强 邱志刚 李超 赵辰 薛斌 李辰宇 张曦 杨晓波
受保护的技术使用者：军事科学院军事医学研究院环境医学与作业医学研究所
技术研发日：2021.11.09
技术公布日：2022/1/14