一种获得转基因或基因编辑植物体的方法与流程

1.本发明属于作物遗传育种、生物技术、植物基因工程领域，具体涉及一种利用非组织培养的方式获得转基因植物的方法。


背景技术：

2.甘薯是重要的粮食和经济作物，有较高的产量以及抗逆性，具有很好的遗传改良基础。然而，由于甘薯的雄性不育性高，自交或种间杂交不亲和，传统杂交存在困难。同时，甘薯是一种同源六倍体(2n＝6x＝96)作物，杂交后代分离性强，通过种子繁殖的后代优良性状难以保持。因此，通过基因工程育种技术对甘薯进行遗传改良是必然选着，然而在分子改良的过程中，遗传工具的递送是重要的一步，通常包括农杆菌介导的遗传转化或基因枪轰击递送遗传物质。然而无论采用哪种方式，都需要植物组织培养的过程使植物再生，获得能够稳定遗传的优良性状。
3.在甘薯遗传转化体系中，通常需要诱导胚性愈伤组织作为转化受体，通过农杆菌浸染愈伤、筛选、再生等一系列组织培养过程后获得稳定遗传的转化植株。然而这些方法的应用常限于那些具有适合培养和再生特性的品种，具有较强的基因型依赖性，许多优秀的商业品种缺乏愈伤诱导以及再生的特性，因此转化较为困难。因此，通过非组织培养的方式或原位转化的方式对植物进行遗传转化以及编辑工具的递送能够克服品种依赖性，再生困难等障碍，提高品种改良效率。
4.本发明利用携带外源dna的发根农杆菌浸染甘薯茎段，可以直接诱导其产生携带外源dna或基因编辑的毛状根，将带有毛状根的茎段种到基质中或水培等培养后，携带外援dna或基因编辑后的毛状根可以膨大发育成地瓜，将地瓜播种后长芽可以获得完整的转基因或基因编辑地瓜株系，本发明可以高效的将外源遗传物质或基因编辑工具递送进甘薯细胞，并获得能够稳定遗传的转基因或基因编辑甘薯，为甘薯的基因工程育种开辟了新的方式，也为其他作物的遗传转化或外援dna的递送方式提供了新的思路。


技术实现要素：

5.本发明提供了一种利用非组织培养的方式获得转基因植物和/或基因编辑植物的方法。
6.方法
7.本发明提供了一种利用非组织培养的方式获得转基因甘薯或基因编辑的甘薯的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
8.(1)使用携带目的基因的发根农杆菌侵染甘薯的任意部位；
9.(2)将步骤(1)得到的被侵染的甘薯的任意部位培养至产生携带目的基因的毛状根；
10.(3)将步骤(2)所述带有毛状根的甘薯的任意部位在基质中培养至所述携带目的基因的毛状根膨大发育成转基因甘薯或基因编辑的甘薯。
11.任选的，上述方法还包括将步骤(3)得到的转基因甘薯或基因编辑的甘薯繁殖成转基因甘薯植株或基因编辑的甘薯植株的步骤。
12.所述步骤(3)的在基质中培养为将毛状根栽入或埋入基质中进行培养
13.在一个实施方式中，所述方法在步骤(2)还包括筛选并去除不携带目的基因的毛状根的步骤。在一种实施方式中，所述筛选可以是依赖视觉的检测；例如，在转目的基因的同时转入荧光蛋白，不携带目的基因的毛状根不会产生荧光。在其他的实施方式中，所述筛选还可以是核酸检测的方法，检测根或植株的核酸中是否还有载体上的核酸序列。在其他的实施方式中，所述筛选可以是依赖免疫反应进行的检测，如利用western检测载体上蛋白的表达量；在其他的实施方式中，所述筛选可以是利用亚磷酸脱氢酶基因为筛选标记、亚磷酸盐为筛选剂的筛选方法，此方法在中国申请cn111979348a中有所记载。在一种实施方式中，所述发根农杆菌包括k599菌株、msu440菌株、c58c1菌株、ar a4菌株、ar.qual菌株、ar1193菌株，优选的所述发根农杆菌为k599菌株。
14.在一种实施方式中，所述目的基因通过载体导入发根农杆菌；所述载体包括基因表达载体或基因编辑载体；优选的，所述基因表达载体上含有目标基因的片段；所述基因编辑载体上含有基因编辑元件及靶向目标基因的grna；优选的，所述基因编辑载体上还含有表达调控元件；所述基因编辑元件包括cas效应蛋白，优选的，所述基因编辑元件还包括abe或cbe。
15.在一种实施方式中，所述甘薯还可以替换为其他用根进行繁殖的植物，优选的，所述用根进行繁殖的植物包括薯类、木本植物、参类或球根类植物；优选的，所述植物为甘薯、木薯、山药、党参、人参、丹参、果树、杨树、柳树、月季、圣诞红、竹蕉、菊花、马齿牡丹、松叶牡丹、黛粉叶、彩叶草、黄金葛、粗肋草、变叶木、蔷薇、茶花、杜鹃、天竺葵、龙吐珠、非洲凤仙花、日日春、大丽花、肾蕨。
16.在一种实施方式中，所述生成携带目的基因的毛状根为所述甘薯外植体被发根农杆菌侵染后产生毛状根。毛状根膨大发育为转基因的甘薯或基因编辑的甘薯，优选的，栽种所述转基因的甘薯或基因编辑的甘薯可以获得转基因甘薯植株或基因编辑的甘薯植株。
17.在一种实施方式中，所述甘薯的任意部位包括茎、叶，所述茎包括茎尖、茎段，所述叶包括叶盘、叶柄；优选的，所述甘薯的任意部位为茎段，更优选，带叶的茎段。
18.在一种实施方式中，所述基质包括适于植物栽培的固体基质或液体基质，优选的，所述基质包括蛭石、草炭、珍珠岩、岩棉、沙、聚氨酯、泥炭、稻壳炭、树皮等常见的固体基质，更优选的所述基质包括蛭石。在其他的实施方式中，所述固体基质还可以为土壤。
19.在一种实施方式中，所述筛选可以是对根进行的筛选，也可以是对根成长成的植株进行筛选。
20.应用
21.另一方面，本发明还提供了所述的方法制备得到的转基因植物或基因编辑植物作为生物反应器的应用；优选的，所述生物反应器可以制备的是蛋白质、脂类、糖类；优选的，抗菌肽，hiv中和抗体，pd-1抗体，pd-l1抗体，流感病毒疫苗，新冠病毒疫苗，异黄酮，大麻素等。一般定义：
22.除非另有定义，否则本文所用的技术和科学术语具有与所属领域的普通技术人员之一通常理解的相同的含义。
23.术语“载体”是包含允许载体整合入宿主细胞基因组或在细胞内不依赖于基因组而自主复制的元件。该载体可能包含保证自我复制的任何元件。其通常携带不是细胞中心代谢的一部分的基因，并且通常是双链dna的形式。载体的选择通常取决于载体与该载体待引入之宿主细胞的相容性。如果使用载体，则载体的选择取决于本领域技术人员众所周知的用于转化宿主细胞的方法。例如，可以使用质粒载体。术语“调控元件”又称“调节元件”，如本文中所使用的，旨在包括启动子、终止子序列、前导序列、多聚腺苷酸化序列、信号肽编码区、标记基因、增强子、核定位信号、内部核糖体进入位点(ires)、和其他表达控制元件(例如转录终止信号，如多聚腺苷酸化信号和多聚u序列)，其详细描述可参考戈德尔(goeddel)，《基因表达技术：酶学方法》(gene expression technology:methods in enzymology)185，学术出版社(academic press)，圣地亚哥(san diego)，加利福尼亚州(1990)。在某些情况下，调控元件包括指导一个核苷酸序列在许多类型的宿主细胞中的组成型表达的那些序列以及指导该核苷酸序列只在某些宿主细胞中表达的那些序列(例如，组织特异型调节序列)。组织特异型启动子可主要指导在感兴趣的期望组织中的表达，所述组织例如肌肉、神经元、骨、皮肤、血液、特定的器官(例如肝脏、胰腺)、或特殊的细胞类型(例如淋巴细胞)。在某些情况下，调控元件还可以时序依赖性方式(如以细胞周期依赖性或发育阶段依赖性方式)指导表达，该方式可以是或者可以不是组织或细胞类型特异性的。在某些情况下，术语“调控元件”涵盖的是增强子元件，如wpre；cmv增强子；在htlv-i的ltr中的r-u5’片段((mol.cell.biol.，第8(1)卷，第466-472页，1988)；sv40增强子；以及在兔β-珠蛋白的外显子2与3之间的内含子序列(proc.natl.acad.sci.usa.，第78(3)卷，第1527-31页，1981)。
24.如本文中所使用的，术语“启动子”具有本领域技术人员公知的含义，其是指一段位于基因的上游能启动下游基因表达的非编码核苷酸序列。组成型(constitutive)启动子是这样的核苷酸序列：当其与编码或者限定基因产物的多核苷酸可操作地相连时，在细胞的大多数或者所有生理条件下，其导致细胞中基因产物的产生。诱导型启动子是这样的核苷酸序列，当可操作地与编码或者限定基因产物的多核苷酸相连时，基本上只有当对应于所述启动子的诱导物在细胞中存在时，其导致所述基因产物在细胞内产生。组织特异性启动子是这样的核苷酸序列：当可操作地与编码或者限定基因产物的多核苷酸相连时，基本上只有当细胞是该启动子对应的组织类型的细胞时，其才导致在细胞中产生基因产物。
[0025]“核定位信号”或“核定位序列”(nls)是对蛋白质“加标签”以通过核转运导入细胞核的氨基酸序列，即，具有nls的蛋白质被转运至细胞核。典型地，nls包含暴露在蛋白质表面的带正电荷的lys或arg残基。示例性核定位序列包括但不限于来自以下的nls：sv40大t抗原，egl-13，c-myc以及tus蛋白。
[0026]
术语“基因编辑”技术包括crispr技术、talen技术、zfn技术。crispr技术是指成簇、规律间隔的短回文重复序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats)，其来自微生物的免疫系统。其中基因编辑工具包括guiderna、cas蛋白(如cas9、cpf1、cas12b等)。talen技术中所指的基因编辑工具是可以切割特定dna序列的限制酶，其包括一个tal效应子dna结合结构域和一个dna切割结构域。zfn技术中所指的基因编辑工具也是可以切割特定dna序列的限制酶，其包括一个锌指dna结合结构域与一个dna切割结构域。本领域技术人员熟知，将编码基因编辑工具的核苷酸及其他调控元件构建于适宜的载
体中，再转化细胞，可以实现对细胞内基因组的编辑，所述编辑的类型包括基因敲除、插入、碱基编辑。
[0027]
如本文所用，术语“基因编辑酶”，属于“基因编辑元件”，指适用于crispr(规律成簇间隔短回文重复序列clustered regularly interspaced short palindromic repeats)、talen(转录激活因子样效应物核酸酶技术transcription activator-like(tal)effector nucleases)、zfn(锌指核酸技术，zinc finger nuclease)等编辑工具的核酸酶。优选地，所述基因编辑酶为crispr酶，又名cas蛋白、cas效应蛋白，其种类包括但并不限于：cas9蛋白、cas12蛋白、cas13蛋白、cas14蛋白、csm1蛋白、fdk1蛋白。所述的cas蛋白是指蛋白家族，可以根据其来源不同而具有不同的结构，如来源于酿脓链球菌(streptococcus pyogenes)的spcas9、来源于葡萄球菌(staphylococcus aureus)的sacas9；还可以根据结构特征(如结构域)进行下位分类，如cas12家族包括cas12a(又名cpf1)、cas12b、cas12c、cas12i等。所述的cas蛋白可以具有双链或单链或无切割活性。本发明所述的cas蛋白可以是野生型或其突变体，所述的突变体的突变类型包括氨基酸的替换、取代或缺失，所述的突变体可以改变也可以不改变cas蛋白的酶切活性。优选地，本发明所述的cas蛋白只具有单链切割活性或无切割活性，其为野生型cas蛋白的一种突变体。优选地，本发明cas蛋白为具有单链切割活性的cas9、cas12、cas13或cas14。在一优选实施方式中，本发明的cas9蛋白包括spcas9n(d10a)、nspcas9ng、sacas9n、sccas9n、xcas9n，其中“n”表示nick，即只具有单链切割活性的cas蛋白。突变已知cas蛋白获得具有单链或无切割活性的cas蛋白为本领域的常规技术手段。本领域技术人员所知，现有技术中已报到的多种具有核酸切割活性的cas蛋白，该公知蛋白或其改造后的变体均可以实现本发明的功能，本文通过引用方式将其纳入保护范围。
[0028]
如本文中所使用的，术语“指导rna(guide rna)”、“成熟crrna”、“指导序列”可互换地使用并且具有本领域技术人员通常理解的含义。一般而言，指导rna可以包含同向重复序列(direct repeat)和引导序列，或者基本上由或由同向重复序列和引导序列(在内源性crispr系统背景下也称为间隔序列(spacer))组成。
[0029]
在某些情况下，引导序列是与靶序列具有足够互补性从而与所述靶序列杂交并引导crispr/cas复合物与所述靶序列的特异性结合的任何多核苷酸序列。在一个实施方式中，当最佳比对时，引导序列与其相应靶序列之间的互补程度为至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、或至少99％。确定最佳比对在本领域的普通技术人员的能力范围内。例如，存在公开和可商购的比对算法和程序，诸如但不限于clustalw、matlab中的史密斯-沃特曼算法(smith-waterman)、bowtie、geneious、biopython以及seqman。
[0030]“基因编辑元件”还包括胞嘧啶碱基编辑器(cbe)和腺嘌呤碱基编辑器(abe)，碱基编辑器能够在基因组中进行精确的碱基改变(如替换)，且不会造成dna双链断裂(dsb)。
[0031]
如本文所用，术语“腺嘌呤脱氨酶”指tada腺嘌呤脱氨酶，来源于大肠杆菌，原本作用于trna，能够对trna中的特定腺嘌呤进行脱氨反应。
[0032]
在本发明中，适用的tada既包含野生型的形式也包含其特定的突变形式tada7-10，也可包含野生型的形式和突变形式的组合。tada7-10能够以dna作为底物进行脱氨反应。
[0033]
在另一优选例中，本发明的腺嘌呤脱氨酶的编码序列是对密码子进行优化的，从而能够更高效地在植物中表达。
[0034]
如本文所用，术语“胞嘧啶脱氨酶”指胞嘧啶脱氨酶apobec，来源于大肠杆菌，原本作用于trna，能够对trna中的特定胞嘧啶进行脱氨反应。在本发明中，适用的胞嘧啶脱氨酶既包含野生型的形式也包含其特定的突变形式(如cbe2.0、cbe2.1、cbe2.2、cbe2.3、cbe2.4)，也可包含野生型的形式和突变形式的组合。突变形式的胞嘧啶脱氨酶能够以dna作为底物进行脱氨反应。
[0035]
在另一优选例中，本发明的胞嘧啶脱氨酶的编码序列是对密码子进行优化的，从而能够更高效地在植物中表达。
[0036]
术语“植物”应理解为能够进行光合作用的任何分化的多细胞生物，在包括处于任何成熟或发育阶段的作物植物，特别是单子叶或双子叶植物，蔬菜作物，包括洋蓟、球茎甘蓝、芝麻菜、韭葱、芦笋、莴苣(例如，结球莴苣、叶莴苣、长叶莴苣)、小白菜(bok choy)、黄肉芋、瓜类(例如，甜瓜、西瓜、克伦肖瓜(crenshaw)、白兰瓜、罗马甜瓜)、油菜作物(例如，球芽甘蓝、卷心菜、花椰菜、西兰花、羽衣甘蓝、无头甘蓝、大白菜、小白菜)、刺菜蓟、胡萝卜、洋白菜(napa)、秋葵、洋葱、芹菜、欧芹、鹰嘴豆、欧洲防风草、菊苣、胡椒、马铃薯、葫芦(例如，西葫芦、黄瓜、小西葫芦、倭瓜、南瓜)、萝卜、干球洋葱、芜菁甘蓝、紫茄子(也称为茄子)、婆罗门参、苣菜、青葱、苦苣、大蒜、菠菜、绿洋葱、倭瓜、绿叶菜类(greens)、甜菜(糖甜菜和饲料甜菜)、甘薯、唐莴苣、山葵、西红柿、芜菁、以及香辛料；水果和/或蔓生作物，如苹果、杏、樱桃、油桃、桃、梨、李子、西梅、樱桃、榅榅、杏仁、栗子、榛子、山核桃、开心果、胡桃、柑橘、蓝莓、博伊增莓(boysenberry)、小红莓、穗醋栗、罗甘莓、树莓、草莓、黑莓、葡萄、鳄梨、香蕉、猕猴桃、柿子、石榴、菠萝、热带水果、梨果、瓜、芒果、木瓜、以及荔枝；大田作物，如三叶草、苜蓿、月见草、白芒花、玉米/玉蜀黍(饲料玉米、甜玉米、爆米花)、啤酒花、荷荷芭、花生、稻、红花、小粒谷类作物(大麦、燕麦、黑麦、小麦等)、高粱、烟草、木棉、豆科植物(豆类、小扁豆、豌豆、大豆)、含油植物(油菜、芥菜、罂粟、橄榄、向日葵、椰子、蓖麻油植物、可可豆、落花生)、拟南芥属、纤维植物(棉花、亚麻、大麻、黄麻)、樟科(肉桂、莰酮)、或一种植物如咖啡、甘蔗、茶、以及天然橡胶植物；和/或花坛植物，如开花植物、仙人掌、肉质植物和/或观赏植物，以及树如森林(阔叶树和常绿树，如针叶树)、果树、观赏树、以及结坚果的树(nut-bearing tree)、以及灌木和其他苗木。
[0037]
术语“植物组织”或“植物部分”包括植物细胞、原生质体、植物组织培养物、植物愈伤组织、植物块以及植物胚、花粉、胚珠、种子、叶、茎、花、枝、幼苗、果实、核、穗、根、根尖、花药等。
[0038]
术语“植物细胞”应理解为来自或发现于植物的任何细胞，其能够形成例如：未分化组织如愈伤组织，分化组织如胚胎，植物的组成部分，植物或种子。
[0039]
术语“发根农杆菌”(ag.rhizogenes)是一种侵染性非常广泛的土壤细菌，能侵染几乎所有的双子叶植物和少数单子叶植物而诱发发根瘤。这是由其所携带的ri质粒(rootinducingplasmid)所引起的。ri质粒上含有负责发根瘤自主性生长和冠瘿碱合成的基因。在结构上，与ti质粒相似，它主要具有vir区、t-dna区及其内的冠瘿碱合成功能区等。包括k599菌株、ar a4、ar qual、msu440、c58c1、ar 1193、k599、atcc15834等。
[0040]
术语“生物反应器”是整株植物或悬浮植物细胞生产蛋白、糖类、脂类、次生代谢产
物药物的技术，具体的如疫苗、抗体、重要氨基酸、工农业用酶、特殊碳水化合物、次生代谢产物，如大麻素，异黄酮等。
附图说明
[0041]
图1.gfp表达载体示意图，
[0042]
图2.日光灯照射下的植株，
[0043]
图3.激发光源照射下的植株，
[0044]
图4.日光灯照射下的薯块，
[0045]
图5.激发光源照射下的薯块，
[0046]
图6.野生型植株，
[0047]
图7.转基因植株，
[0048]
图8.pcr验证的薯块，
[0049]
图9.敲除载体的示意图，
[0050]
图10.cbe载体的示意图，
[0051]
图11.abe载体的示意图。
[0052]
实施方式
[0053]
下面结合实施例对本发明做进一步的说明，以下所述，仅是对本发明的较佳实施例而已，并非对本发明做其他形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更为同等变化的等效实施例。凡是未脱离本发明方案内容，依据本发明的技术实质对以下实施例所做的任何简单修改或等同变化，均落在本发明的保护范围内。
[0054]
实施例1、利用发根农杆菌制备转基因甘薯
[0055]
步骤1：外植体的培养与筛选
[0056]
1.1选择大小一致的新鲜薯块若干块(约50-100g/块)，清水冲洗干净备用。
[0057]
1.2取10l蛭石在高温灭菌锅中灭菌(121℃，20min)，灭菌后盛于10*8*9的培养盒中并用200ml的去离子水浸湿备用。
[0058]
1.3将1.1中的薯块埋入1.2中的培养盒中在18-24℃的光照条件下培养15-25天，长出4-5cm具1-2叶的幼苗。
[0059]
步骤2：农杆菌侵染液与菌板的制备
[0060]
2.1构建gfp表达载体，载体成分如附图1所示。将构建好的质粒转化的到发根农杆菌k599中，筛选携带有gfp表达载体的菌株进行保存。
[0061]
2.2使用ty(strep/kanr)液体培养基将上述k599甘油菌液活化，转接后放入恒温摇床28
°
培育16小时。
[0062]
2.3在ty(strep/kanr)固体培养基上加200μl活化后的上述k599农杆菌液，涂布均匀，晾干。在28
°
恒温培养箱中倒置培养过夜。
[0063]
步骤3：侵染外植体
[0064]
3.1将1.3中的幼苗从培养盒中取出，用锋利的刀片在茎部切出60
°
切面。
[0065]
3.2将切面在菌板上涂抹至粘上步骤2得到的菌液，然后插入1.2中的蛭石1-1.5cm并稍稍压实插入部位的蛭石。
[0066]
3.3取3-5ml农杆菌侵染液沿茎部缓慢的滴入蛭石中，盖上培养盒盖注意保湿，每
个培养盒可培养4-5个外植体幼苗。
[0067]
步骤4：侵染后外植体的培养
[0068]
4.1将3.3中插入外植体的培养盒置于18-24℃、14h光照条件下培养两周可长根，图2为日光灯照射图，图3为激发光源照射图，由图3可以看出，部分毛状根发绿色荧光，说明表达了gfp表达载体。
[0069]
4.2将带有gfp荧光标记的根留下，把未标记的根用镊子轻轻拔下丢掉，再把外植体幼苗重新埋入培养盒中。
[0070]
4.3将草炭：蛭石：珍珠岩＝5：2：1按比例混匀使其成为栽培用基质，每5l基质兑清水4l并混匀，然后分别放入18cm*18cm的栽培盒中。
[0071]
4.4外植体在培养盒中培养四周后，可移栽于4.3中的栽培盒中继续培养。
[0072]
4.5移栽80-90天后，毛状根膨大为薯块，长出的薯块仍带有荧光，图4为日光灯照射图照射下的转基因薯块和野生型薯块，图5为激发光源照射下的转基因薯块和野生型薯块，可以明显看出，由毛状根膨大而来的薯块发出绿色荧光，是转基因的薯块。
[0073]
4.6将突变体薯块放入1.2中的培养盒中培养15-25天，长出4-5cm具1-2叶的幼苗，继续培养可以成长为成熟的植株。图6为野生型植株，图7为表达gfp的转基因植株。
[0074]
步骤5：薯块及突变体幼苗的pcr鉴定
[0075]
提取薯块或叶片中的dna，利用引物egfp-jc-f2：gtccatgccgagagtgatcc和egfp-jc-r2：ctcgtgaccaccctgacctapcr鉴定，pcr产物跑胶如图8所示。转基因植株(第1泳道)同阳性对照(gfp表达载体质粒，第3泳道)的pcr产物一致，野生型(第2泳道)和阴性对照(水，第4泳道)均无pcr产物。
[0076]
此实验结果说明，转基因植物中确实成功的转入了gfp表达载体，可以在非组织培养方式下快速制备转基因甘薯。
[0077]
实施例2利用发根农杆菌制备基因编辑甘薯
[0078]
针对不同基因，设计grna，构建编辑载体，编辑类型、靶基因名称及设计的grna序列如表1所示，其中敲除载体的示意图如图9所示，cbe载体的示意图如图10所示，abe载体的示意图如图11所示。
[0079]
表1.编辑类型、靶基因名称及设计的grna序列
[0080][0081][0082]
按照实施例1中步骤1-3的步骤进行外植体培养、农杆菌侵染和侵染后外植体的培养，在每个载体侵染的后的选取20根带荧光毛状根进行培养，待甘薯长成后测定其基因序列，发现后代中基因被编辑的甘薯。
[0083]
以上实验说明，利用本实验提供的方法，可以快速得到被基因编辑了的甘薯，载重此基因编辑的甘薯可以得到基因编辑的甘薯苗(甘薯植株)。