真核重组蛋白在试剂盒中的应用、试剂盒及其应用的制作方法

1.本发明涉及血清4型禽腺病毒检测领域，具体地，涉及一种重组蛋白在制备用于检测血清4型禽腺病毒fiber蛋白抗体的试剂盒中的应用以及试剂盒。


背景技术：

2.禽腺病毒(fowl adenovirus，fadv)属于腺病毒科禽腺病毒属，分为5个种(a-e)、12个血清型(1-7，8a，8b，9-11)。近年爆发的由高致病性血清4型禽腺病毒(fadv-4)感染引起的肝炎-心包积液综合征给国内外养鸡业造成了巨大经济损失，然目前缺乏商品化的检测fadv-4特异性抗体的血清学诊断技术。
3.fiber蛋白不仅含腺病毒重要抗原表位决定簇，且在介导病毒与受体结合、诱导机体产生中和抗体方面具有重要作用。fadv-4病毒粒子表面存在两种fiber蛋白：fiber-1和fiber-2。目前虽有研究利用原核表达的fiber-2重组蛋白作为标靶建立的fadv-4的抗体elisa检测方法，但是其检测准确率有限、效率低下，无法满足日常检测需要。
4.值得注意是，与原核表达系统不同，通过真核表达系统获得的重组蛋白与自然状态下的病毒蛋白在结构和修饰上更为接近，故动物体内产生的抗fiber-1和fiber-2蛋白的抗体与真核表达的蛋白的反应性与亲和性均高于原核表达蛋白。
5.目前尚无研究利用真核表达的fiber-1和fiber-2蛋白作为包被抗原的检测方法。


技术实现要素：

6.针对目前利用原核表达的fiber-2重组蛋白作为标靶建立的fadv-4的抗体elisa检测方法检测准确率有限、效率低下的问题，本发明提供了一种真核重组fiber-1蛋白和/或真核重组fiber-2蛋白在制备用于检测fiber蛋白抗体的试剂盒中的应用、试剂盒及其应用，以fadv-4的两个纤突蛋白fiber-1、fiber-2为检测靶点，利用昆虫细胞sf9表达的真核重组fiber-1、fiber-2蛋白创制了更高效、灵敏且特异的血清学检测方法，为fadv-4感染诊断和免疫监控提供技术支撑。
7.为了实现上述目的，本发明一方面提供一种真核重组fiber-1蛋白和/或真核重组fiber-2蛋白在制备用于检测fiber蛋白抗体的试剂盒中的应用，其特征在于，所述真核重组fiber-1蛋白和/或真核重组fiber-2蛋白由sf9昆虫表达系统表达获得。
8.与原核表达系统相比，本发明利用昆虫杆状病毒表达系统制备的重组fiber-1、fiber-2蛋白在sf9昆虫细胞中实现高效易溶性表达，表达产物具有易于纯化、纯度高且无内毒素等优势。另外，该系统表达外源蛋白时具有完备的翻译后加工修饰能力，故在昆虫细胞上表达的真核重组fiber-1、fiber-2蛋白具有天然构象。故本发明表达的真核重组蛋白与其他原核表达的蛋白相比，它们不仅能更好地模拟fadv-4天然免疫原，还与针对fiber-1、fiber-2的抗体具有更好的反应性和亲和力。
9.具体地，所述表达是将重组杆状病毒rbacmid-fadv-4-fiber-1、rbacmid-fadv-4-fiber-2分别感染sf9细胞，收集细胞经重悬、破碎、离心、纯化后得到所述真核重组fiber-1
蛋白和所述真核重组fiber-2蛋白。
10.上述技术方案中，重组杆状病毒rbacmid-fadv-4-fiber-1的构建及鉴定参见申请公布号为cn111518777a(一种表达血清4型禽腺病毒纤突蛋白f1的重组杆状病毒的构建方法)的中国专利的实施例。重组杆状病毒rbacmid-fadv-4-fiber-2的构建及鉴定参见申请公布号为cn111534547a(一种表达血清4型禽腺病毒纤突蛋白f2的重组杆状病毒的构建方法)的中国专利的实施例。
11.具体地，所述感染时间为72～120h，所述破碎为40～50hz、间隔8～10s进行超声破碎，以便于后续纯化操作的进行。
12.具体地，所述真核重组fiber-1蛋白和/或真核重组fiber-2蛋白包被于所述酶标板上。
13.本发明第二方面提供一种用于检测血清4型禽腺病毒fiber蛋白抗体的试剂盒，该试剂盒包括包被有真核重组fiber-1蛋白和/或真核重组fiber-2蛋白的酶标板，所述真核重组fiber-1蛋白和/或真核重组fiber-2蛋白是将重组杆状病毒rbacmid-fadv-4-fiber-1载体、rbacmid-fadv-4-fiber-2载体分别感染sf9细胞，收集细胞经重悬、破碎、离心、纯化后得到。
14.进一步地，该试剂盒还包括阳性对照、阴性对照、hrp标记的兔抗鸡二抗免疫血清、样品稀释液、显色液及洗涤液。
15.具体地，所述阳性对照为抗血清4型禽腺病毒的鸡血清，所述阴性对照为spf鸡血清。
16.具体地，所述样品稀释液为含有0.05～0.1％tween-20的pbs，所述显色液为tmb显色液，所述洗涤液为含有0.05～0.1％tween-20的pbs。
17.本发明第三方面提供一种真核重组fiber-1蛋白和/或真核重组fiber-2蛋白、上述的试剂盒在检测血清4型禽腺病毒抗体的间接elisa方法中的应用，所述真核重组fiber-1蛋白和/或真核重组fiber-2蛋白由sf9昆虫表达系统表达获得。
18.通过上述技术方案，本发明实现了以下有益效果：
19.本发明将表达fiber-1、fiber-2重组蛋白的杆状病毒感染sf9细胞，并以镍柱亲和层析法纯化感染细胞裂解液上清中的fiber-1、fiber-2重组蛋白，将纯化的重组蛋白分别作为包被抗原组装检测fadv-4抗体的间接elisa试剂盒。检测结果显示，该检测fadv-4抗体的间接elisa试剂盒具有良好的fadv-4特异性、敏感性，能够特异地、有效地检测出感染fadv-4或免疫fadv-4疫苗的鸡群中抗fadv-4抗体，在fadv-4病毒流行病学调查中具有良好的应用价值，可用于fadv-4感染及免疫状况流行病学调查。
附图说明
20.图1是fiber-1纯化蛋白的sds-page(a)和western blot鉴定(b)结果；
21.图中泳道m：蛋白marker；泳道1：纯化后的fiber-1蛋白；
22.图2是fiber-2纯化蛋白的sds-page(a)和western blot鉴定(b)结果；
23.图中泳道m：蛋白marker；泳道1：纯化后的fiber-2蛋白；
24.图3是基于fiber-1(a)和fiber-2(b)蛋白的间接elisa试剂盒特异性检测结果；
25.图4是基于fiber-1和fiber-2蛋白的间接elisa试剂盒对免疫鸡群、攻毒鸡群血清
及spf鸡群的抗体水平检测结果。
具体实施方式
26.以下结合实施例对本发明的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。
27.实施例1检测血清4型禽腺病毒抗体的间接elisa试剂盒的制备
28.s1、构建杆状病毒表达载体：
29.参见中国专利cn111518777a(说明书第[0035]-[0052]段)的实施例构建及鉴定重组杆状病毒rbacmid-fadv-4-fiber-1(说明书第[0035]-[0052]段)，参见中国专利cn111534547a的实施例构建及鉴定重组杆状病毒rbacmid-fadv-4-fiber-2。
[0030]
s2、重组杆状病毒的表达及其产物的免疫反应性鉴定：
[0031]
将重组杆状病毒rbacmid-fadv-4-fiber-1、rbacmid-fadv-4-fiber-1感染sf9细胞，96h之后收集细胞用pbs重悬后40hz、间隔8s进行破碎，破碎完成后高速离心分离上清，再经his标签亲和层析柱纯化后得到重组fiber-1、fiber-2蛋白。
[0032]
利用sds-page分析蛋白纯化效果，可见纯化产物纯度较佳，无杂带产生，大小分别为50和70kda(参见图1和图2)。之后利用western-blot(蛋白质印迹法)分析纯化产物与阳性血清的反应性，结果表明，表达的fiber-1、fiber-2蛋白与阳性血清均有良好的反应性。
[0033]
s3、试剂盒的组装：
[0034]
该试剂盒成分包括包被有重组fiber-1蛋白或fiber-2蛋白的elisa酶标板，阳性阴性对照(阳性对照为抗血清4型禽腺病毒的鸡血清，阴性对照为spf鸡血清)，hrp标记的兔抗鸡二抗免疫血清(购买所得)，含有0.05％tween-20的pbst样品稀释液，显色液(tmb显色液)及含有0.05％tween-20的pbst洗涤液。
35.实施例2试剂盒性能测试
[0036]
1、检测血清4型禽腺病毒抗体的间接elisa试剂盒的特异性分析：
[0037]
相同条件下，对fadv-4阳性血清，ciav、aiv-h9、alv-j、ndv、ibv等禽源病毒以及禽腺病毒的其他血清型(fadv-1、fadv-2、fadv-3、fadv-5、fadv-6、fadv-7、fadv-8、fadv-9、fadv-11)的阳性血清以及spf鸡血清进行检测，结果如图3所示。从图3可以看出，该试剂盒只与fadv-4阳性血清反应，而与所检测的其它病毒阳性血清及spf血清均没有反应，说明本发明的试剂盒具有很好的特异性。
[0038]
2、检测血清4型禽腺病毒抗体的间接elisa试剂盒的灵敏度性分析：
[0039]
取4份抗fadv-4鸡阳性血清进行梯度稀释(1:400、1:800、1:1600、1:3200、1:6400、1:12800、1:25600、1:51200)后按优化好的方法进行elisa检测，同时将0.1moi fadv-4病毒感染lmh细胞，在96h后固定细胞，以ifa方法进行同步检测。比较两种方法的检测效果，评估elisa方法的灵敏度，结果如表1所示。从表1可以看出，本发明建立的elisa方法敏感性远高于ifa方法的敏感性(比ifa高8-16倍))，表明本发明制备的试剂盒的敏感性较好。
[0040]
表1基于fiber-1和fiber-2重组蛋白的间接elisa试剂盒灵敏度检测结果
[0041][0042]
注：*fiber-1-elisa和fiber-2-elisa(s/p≥0.1，fadv-4抗体阳性；s/p＜0.1，fadv-4抗体阴性)；ifa( 为fadv-4抗体阳性；－为fadv-4抗体阴性)
[0043]
3、临床样品检测效果：
[0044]
取感染fadv-4、免疫fadv-4灭活疫苗鸡群及spf鸡群各20份血清进行检测，结果如图4所示。从图4可以看出，感染fadv-4、免疫fadv-4灭活疫苗鸡群相应40份血清样品均为elisa阳性，而spf鸡群相应20份血清样品均为elisa阴性。以上检测结果证明，本发明基于fiber蛋白的检测血清4型禽腺病毒抗体的elisa试剂盒具有良好的应用前景。
[0045]
试剂盒检测血清4型禽腺病毒抗体的步骤及阳性判定标准如下：将阳性血清1：400稀释后，加入试剂盒的a1、a2孔，将阴性血清1：400稀释后加入a3、a4孔，剩下的的孔用于检测待检样品(1：400稀释)，37℃反应1h；pbst洗涤3遍后，加入工作浓度的hrp标记的兔抗鸡抗体，37℃反应1h；pbst洗涤3遍后，进行显色10min，之后加入终止液终止显色。读取od
450
吸光值。elisa方法采用s/p比值进行判定。公式为s/p＝(样品od
450
nm值-阴性对照od
450
nm平均值)/(阳性对照od
450
nm平均值-阴性对照od
450
nm平均值)。s/p比值大于临界值判为阳性，s/p比值小于或等于临界值判为阴性。
[0046]
由以上描述可以看出，本发明具有以下优点：本发明制备的试剂盒具有良好的fadv-4特异性、敏感性，能够特异地、有效地检测出感染fadv-4或免疫fadv-4疫苗的鸡群中抗fadv-4抗体，在fadv-4病毒流行病学调查中具有良好的应用价值，可用于fadv-4感染及免疫状况流行病学调查。
[0047]
以上结合实施例详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。
[0048]
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。
[0049]
此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。