钾离子转运体蛋白hbrsar1及其在调控植物对钾转运中的应用
技术领域：
：1.本发明涉及生物
技术领域：
：中钾离子转运体蛋白hbrsar1及其在调控植物对钾转运中的应用。
背景技术：
：：2.植物的抗逆性一直以来是现代农业发展的瓶颈问题，应用特殊抗逆种质资源挖掘独特抗逆机理，对改善环境、提高土地的利用率和作物的产量具有异同寻常的意义。盐生的野大麦(hordeumbrevisubulatum(trin.)link)是禾本科大麦属的多年生盐生植物，适应性强，尤其能够在含盐量0.6-1.0％的重度盐碱地上生长良好，表现出非常强的耐盐特性。盐生野大麦不仅是优良牧草，更是改良盐碱地的先锋植物，同时作为大麦、小麦的野生近缘种，能够为改良农作物的抗逆性提供优良基因库，具有极广的推广应用和研究价值。盐生野大麦的研究多局限于形态、解剖及生理特性方面的研究，对其独特的耐盐调控分子机制知之甚少。研究中发现盐生野大麦的耐盐特性主要依赖于其在盐胁迫下保持较高的钾钠比，维持离子平衡。钾是植物细胞中最丰富的阳离子，占细胞干重的10％，除了作为酶的辅助因子，调节渗透势，带动细胞延伸生长等基本功能外，钾对提高植物的抗逆性具有重要的作用，但具体机制知之甚少[1]。[0003]植物种子萌发后，根系便连续快速地扩大生长和延伸，以便吸收更多的营养物质，根系的发达程度直接决定植物地上部分的生长，同时根系是最先感知土壤环境变化并做出反应的器官，包括主根、侧根和不定根[2]。植物所有根系的宏观、空间排列统称为根系结构rsa(rootsystemarchitecture)，高等植物的rsa主要通过维持根尖分生组织的胚胎后发育，生成根分支所必需的新原基以及在表皮细胞层上形成根毛[3]。在生物和非生物胁迫下，根系结构的可塑性和多样性会直接决定植物的生长状态[4]。盐胁迫导致植物根系生长迟缓，表现为根的长度减小(主根和侧根)，侧根的数目减少，改变了根系构型，同时根毛的形成受阻及根的向性发生改变[5-7]。根系的减少大大降低了根的吸收面积，造成植物营养物质的匮乏，延缓了植株的生长。矿质营养对植物的结构、信号传导、物质代谢等方面具有基础性的作用，是植物生长必不可少的营养物质。这些矿质营养物质几乎全部来自于根系从土壤的吸收，同时可塑性强的根系会对土壤中矿质元素的条件和环境的改变即时地做出反应[8]。多种矿质元素对根系构型有重要的影响，包括氮、磷、钾、硫、镁、铁、钙、锌、硼等。以拟南芥为例，硫、镁、铁和氮的缺乏导致侧根密度的减少，而钙、锌、硼和磷的缺乏促进侧根的生长，但多数矿质元素的作用机制仍然未知[38]。[0004]植物中的钾离子含量很高，当细胞无法维持细胞质中100mm的钾离子浓度时，相关生理功能受到抑制。因此含高浓度钾的植物常常被称为具有“保险机制”，在逆境胁迫时，存活率明显高于其他植物[9]。盐胁迫下，大量钠离子会造成钾离子的流失，植物因无法获得足够的钾离子，许多生理功能受到限制，阻碍植物生长。在水稻和拟南芥中已报道多个钾离子吸收转运体的突变体会表现出对盐敏感的表型[10-13]。近几年，盐胁迫下的钠钾平衡及调控是研究植物耐盐的一个重要方面，并在钠离子的外排和钾离子的高效吸收方面取得了一系列优秀的研究成果，然而钾离子是通过什么机制提高植物耐盐性的鲜有报道。[0005]钾与根系的生长发育有密切的关系，但调控机制仍然未知。拟南芥在钾匮乏的条件下抑制侧根发育，而在钾充足时能够有效提高侧根的数量和长度。目前，钾如何调控根系发育还知之甚少。拟南芥钾离子转运体trh1的突变体表现出破坏根毛生长的表型，同时研究发现trh1的缺失造成生长素的分布发生紊乱[14]。水稻中的oshak5调控植株的分蘖数，侧根和根毛的长度[15]。这些研究成果肯定了钾的信号通路与侧根发生发育的信号通路是有交叉的，但最核心和关键的调控机制仍迄待挖掘和解析。技术实现要素：[0006]本发明所要解决的技术问题是如何提高植物在逆境下，尤其是盐胁迫下，对钾的吸收利用。[0007]为了解决以上技术问题，本发明提供了一种蛋白质，名称为hbrsar1，是如下a1)、a2)或a3)的蛋白质：[0008]a1)氨基酸序列是序列表中序列2的蛋白质；[0009]a2)将a1)的蛋白质经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与a1)所示的蛋白质具有90％以上的同一性且具有提高钾离子转运活性的蛋白质；[0010]a3)在a1)或a2)的n末端或/和c末端连接蛋白质标签得到的融合蛋白质。[0011]上述蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。[0012]上述蛋白质中，所述蛋白质标签(protein-tag)是指利用dna体外重组技术，与目的蛋白质一起融合表达的一种多肽或者蛋白质，以便于目的蛋白质的表达、检测、示踪和/或纯化。所述蛋白质标签可为flag标签、his标签、mbp标签、ha标签、myc标签、gst标签、gfp标签、gus标签和/或sumo标签等。[0013]上述蛋白质中，同一性是指氨基酸序列的同一性。可使用国际互联网上的同源性检索站点测定氨基酸序列的同一性，如ncbi主页网站的blast网页。例如，可在高级blast2.1中，通过使用blastp作为程序，将expect值设置为10，将所有filter设置为off，使用blosum62作为matrix，将gapexistencecost，perresiduegapcost和lambdaratio分别设置为11，1和0.85(缺省值)并进行检索一对氨基酸序列的同一性进行计算，然后即可获得同一性的值(％)。[0014]上述蛋白质中，所述90％以上的同一性可为至少91％、92％、95％、96％、98％、99％或100％的同一性。[0015]与hbrsar1相关的生物材料也属于本发明的保护范围。[0016]本发明所提供的与蛋白质hbrsar1相关的生物材料，为下述b1)至b5)中的任一种：[0017]b1)编码hbrsar1的核酸分子；[0018]b2)含有b1)所述核酸分子的表达盒；[0019]b3)含有b1)所述核酸分子的重组载体、或含有b1)所述表达盒的重组载体；[0020]b4)含有b1)所述核酸分子的重组微生物、或含有b2)所述表达盒的重组微生物、或含有b3)所述重组载体的重组微生物；[0021]b5)含有b1)所述核酸分子的转基因植物细胞系、或含有b2)所述表达盒的转基因植物细胞系、或含有b3)所述重组载体的转基因植物细胞系。[0022]其中，所述核酸分子可以是dna，如cdna、基因组dna或重组dna；所述核酸分子也可以是rna，如mrna或hnrna等。[0023]上述生物材料中，b1)所述核酸分子为如下b1)或b2)所示的基因：[0024]b1)编码链的编码序列是序列表中序列1的cdna分子或dna分子；[0025]b2)编码链的核苷酸是序列表中序列1的cdna分子或dna分子。[0026]其中，序列表中的序列1由2319个核苷酸组成，编码序列表中的序列2所示的蛋白质。[0027]上述生物材料中，b2)所述的含有所述核酸分子的表达盒(hbrsar1基因表达盒)，是指能够在宿主细胞中表达hbrsar1的核酸分子，该核酸分子不但可包括启动hbrsar1基因转录的启动子，还可包括终止hbrsar1转录的终止子。[0028]进一步，所述表达盒还可包括增强子序列。可用于本发明的启动子包括但不限于：组成型启动子，组织、器官和发育特异的启动子，和诱导型启动子。启动子的例子包括但不限于：hbrsar2启动子，花椰菜花叶病毒的组成型启动子35s；来自西红柿的创伤诱导型启动子，亮氨酸氨基肽酶("lap",chao等人(1999)plantphysiology120:979-992)；来自烟草的化学诱导型启动子，发病机理相关1(pr1)(由水杨酸和bth(苯并噻二唑-7-硫代羟酸s-甲酯)诱导)；西红柿蛋白质酶抑制剂ii启动子(pin2)或lap启动子(均可用茉莉酮酸曱酯诱导)；热休克启动子(美国专利5，187，267)；四环素诱导型启动子(美国专利5,057,422)；种子特异性启动子，如谷子种子特异性启动子pf128(cn101063139b(中国专利200710099169.7))，种子贮存蛋白质特异的启动子(例如，菜豆球蛋白质、napin,oleosin和大豆betaconglycin的启动子(beachy等人(1985)emboj.4:3047-3053))。它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用。此处引用的所有参考文献均全文引用。合适的转录终止子包括但不限于：农杆菌胭脂碱合成酶终止子(nos终止子)、花椰菜花叶病毒camv35s终止子、tml终止子、豌豆rbcse9终止子和胭脂氨酸和章鱼氨酸合酶终止子(参见，例如：odell等人(i985)nature313:810；rosenberg等人(1987)gene,56:125；guerineau等人(1991)mol.gen.genet,262:141；proudfoot(1991)cell,64:671；sanfacon等人genesdev.,5:141；mogen等人(1990)plantcell,2:1261；munroe等人(1990)gene,91:151；ballad等人(1989)nucleicacidsres.17:7891；joshi等人(1987)nucleicacidres.,15:9627)。[0029]可用现有的植物表达载体构建含有所述hbrsar1基因表达盒的重组表达载体。所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。如pgreen0229-35s::gr、psoup、pahc25、pwmb123、pbin438、pcambia1302、pcambia2301、pcambia1301、pcambia1300、pcambia1381、pbi121、pcambia1391-xa或pcambia1391-xb(cambia公司)等。所述植物表达载体还可包含外源基因的3’端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mrna加工或基因表达的dna片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mrna前体的3’端，如农杆菌冠瘿瘤诱导(ti)质粒基因(如胭脂碱合成酶基因nos)、植物基因(如大豆贮存蛋白质基因)3’端转录的非翻译区均具有类似功能。使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是atg起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(gus基因、萤光素酶基因等)、抗生素的标记基因(如赋予对卡那霉素和相关抗生素抗性的nptii基因，赋予对除草剂膦丝菌素抗性的bar基因，赋予对抗生素潮霉素抗性的hph基因，和赋予对methatrexate抗性的dhfr基因，赋予对草甘磷抗性的epsps基因)或是抗化学试剂标记基因等(如抗除莠剂基因)、提供代谢甘露糖能力的甘露糖-6-磷酸异构酶基因。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。[0030]上述生物材料中，所述重组微生物具体可为酵母，细菌，藻和真菌。[0031]上述的蛋白质、或上述生物材料在如下w1-w4中的任一种应用也属于本发明的保护范围：[0032]w1)在调控植物的钾离子转运效率中的应用；[0033]w2)在调控植物耐逆性中的应用；[0034]w3)在调控植物耐盐能力中的应用；[0035]w4)在调控植物耐贫瘠能力中的应用。[0036]上述应用中，所述植物可为单子叶植物或双子叶植物。所述双子叶植物可为十字花科植物，如拟南芥；所述单子叶植物可为禾本科植物，如二穗短柄草。[0037]上述应用中，所述植物耐逆性具体可为对非生物胁迫的耐逆性，如对盐和/或干旱和/或营养贫瘠的耐逆性。[0038]上述应用中，所述对盐胁迫的耐逆性(耐盐能力)可体现为促进植物根生长，具体为促进植物主根增长和/或促进植物侧根数量增多和/或促进植物侧根增长和/或促进植物根毛数量增多和/或促进植物促进植物根毛增长。[0039]为了解决上述技术问题，本发明还提供了植物试剂，其作用为提高植物钾离子转运效率。[0040]本发明所提供的植物试剂含有所述的蛋白质或/和所述的蛋白质相关的生物材料。[0041]上述植物试剂的活性成分可为所述的蛋白质或/和所述的蛋白质相关的生物材料，上述植物试剂的活性成分还可含有其他生物成分或/和非生物成分，上述植物试剂的其他活性成分本领域技术人员可根据植物体钾离子转运效率的提升效果确定。[0042]为了解决上述技术问题，本发明还提供了一种产生体钾离子转运效率高的植物的方法。[0043]本发明所提供的产生体钾离子转运效率高的植物的方法，包括将编码所述蛋白质的基因导入目的植物中，得到体钾离子转运效率高的植物；所述体钾离子转运效率高的植物的体钾离子转运效率高于所述目的植物的体钾离子转运效率。[0044]所述目的植物可为不含编码所述蛋白质的核酸分子的单子叶植物或双子叶植物。所述双子叶植物可为十字花科植物，如拟南芥；所述单子叶植物可为禾本科植物，如二穗短柄草。[0045]上述方法中，其中所述的核酸分子可先进行如下修饰，再导入目的植物中，以达到更好的表达效果：[0046]1)修饰邻近起始甲硫氨酸的基因序列，以使翻译有效起始；例如，利用在植物中已知的有效的序列进行修饰；[0047]2)与各种植物表达的启动子连接，以利于其在植物中的表达；所述启动子可包括组成型、诱导型、时序调节、发育调节、化学调节、组织优选和组织特异性启动子；启动子的选择将随着表达时间和空间需要而变化，而且也取决于靶物种；例如组织或器官的特异性表达启动子，根据需要受体在发育的什么时期而定；尽管证明了来源于双子叶植物的许多启动子在单子叶植物中是可起作用的，反之亦然，但是理想地，选择双子叶植物启动子用于双子叶植物中的表达，单子叶植物的启动子用于单子叶植物中的表达；[0048]3)与适合的转录终止子连接，也可以提高本发明基因的表达效率；例如来源于camv的tml，来源于rbcs的e9；任何已知在植物中起作用的可得到的终止子都可以与本发明基因进行连接；[0049]4)引入增强子序列，如内含子序列(例如来源于adhl和bronzel)和病毒前导序列(例如来源于tmv,mcmv和amv)。[0050]所述的核酸分子可通过使用ti质粒，植物病毒栽体，直接dna转化，微注射，电穿孔等常规生物技术方法导入植物细胞(weissbach,1998，methodforplantmolecularbiologyviii,academypress,newyork,pp.411-463；geisersonandcorey,1998,plantmolecularbiology(2ndedition)。[0051]上述方法中，所述体钾离子转运效率高的植物可为转基因植物，也可为通过杂交等常规育种技术获得的植物。[0052]上述方法中，所述转基因植物理解为不仅包含第一代到第二代转基因植物，也包括其子代。对于转基因植物，可以在该物种中繁殖该基因，也可用常规育种技术将该基因转移进入相同物种的其它品种，特别包括商业品种中。所述转基因植物包括种子、愈伤组织、完整植株和细胞。[0053]本发明从盐生野大麦中分离、鉴定高效钾离子转运体hbrsar1，利用酵母体系、拟南芥和二穗短柄草的转基因体系、细胞分子生物学体系验证hbrsar1介导盐胁迫下钾的高效吸收，促进盐胁迫下的根系发育。这些研究不仅让我们明确盐生植物演化形成了抗逆新机制，更是为钾与生长素存在信号交叉协同调控根的生长发育这个悬而未决的问题提供了研究的突破口，为理解钾的根系调控机制新机制奠定了基础。有望应用于植物抗逆育种，尤其是耐盐育种中。附图说明[0054]图1为实施例1中hbrsar1的跨膜区域分析结果图。[0055]图2为实施例1中hbrsar1的细胞定位和组织定位图。图2为hbrsar1-gfp在细胞原生质体中的定位分析(bar＝20μm)，gfp为对照。[0056]图3为实施例1中渗透胁迫下hbrsar1转基因植株的侧根表型。其中，每张照片从左至右依次为拟南芥col-0野生型、转基因株系np:hbrsar1-l1、转基因株系np:hbrsar1-l2、拟南芥35s:rsar1突变体。[0057]图4实施例1中营养胁迫下hbrsar1转基因植株的侧根表型。其中，col-0为拟南芥col-0野生型，np:hbrsar1-l1为np:hbrsar1转基因植株np:hbrsar1-l1，l2为np:hbrsar1转基因植株np:hbrsar1-l2。[0058]图5为实施例1中在正常条件下、75mmnacl和125mmnacl条件下的拟南芥col-0野生型和自身启动子启动的hbrsar1的三个转基因株系生长3周之后的表型。其中，每张照片从左至右依次为拟南芥col-0野生型、np:hbrsar1-l1、np:hbrsar1-l2、np:hbrsar1-l3。[0059]图6为实施例1中盐胁迫下hbrsar1转基因植株的侧根表型。其中，图6的a的左图为正常条件下生长15的照片，中间图为盐胁迫下生长15天的照片，右图为盐胁迫下生长30天的照片，每张照片从左至右依次为拟南芥col-0野生型、转基因株系np:hbrsar1-l1、转基因株系np:hbrsar1-l2、拟南芥35s:rsar1突变体。图6的b为对图6的a中的中间图进行的数据统计，从左至右依次为主根长度、侧根数量和侧根长度。图中所示数据为平均值±标准差，重复数为3，以one-wayanova分析各组与拟南芥col-0野生型间的显著性差异，*代表显著性分析结果为p＜0.05，**代表显著性分析结果为p《0.01，***代表显著性分析结果为p《0.001。[0060]图7为实施例1中hbrasr1转基因植株在盐胁迫下的根毛表型。图7的a为野生型、np:hbrsar1转基因植株的两个系(np:rsar1-l1，np:rsar1-l2)和35s:hbrsar1在正常条件和盐处理(75mmnacl和100mmnacl)时的根毛表型。图7的b.为对图7的a中的根毛数目和长度的数据统计图。图中所示数据为平均值±标准差，重复数为3，以one-wayanova分析各组与拟南芥col-0野生型间的显著性差异，**代表显著性分析结果为p《0.01，***代表显著性分析结果为p《0.001。[0061]图8为实施例1中hbrsar1转基因植株根毛钾离子流动的测定结果图。图8的a为拟南芥col-0野生型的测定结果，重复数为3；图8的b为np:hbrsar1转基因植株np:rsar1-l1的测定结果，重复数为3；图8的c为np:hbrsar1转基因植株np:rsar1-l2的测定结果，重复数为3；图8的d为对钾离子流数据的三次测试共9组数据进行统计的柱状图。图8的e为进行非损伤测试时的测试照片。[0062]图9为实施例1中二穗短柄草hbrsar1转基因植株的表型分析。图9的a为野生型和hbrsar1转基因植株在正常条件和75mmnacl处理下的生长10天的表型，每张照片从左至右依次为野生型bd-21、转基因株系np:hbrsar1-l1、转基因株系np:hbrsar1-l2(每5颗苗为一组)。图9的b为对图9的a中野生型和hbrsar1转基因单颗植株根的展开图。图9的c为对a中野生型和转基因植株进行根的数量的测定的结果图。图9的d为对图9的a中单颗植株的鲜重统计条形图。图9的e为对图9的a中的植株的钾离子含量的测定结果图。图中所示数据为平均值±标准差，重复数为5，以one-wayanova分析各组与野生型bd-21间的显著性差异，*代表显著性分析结果为p＜0.05，**代表显著性分析结果为p《0.01，***代表显著性分析结果为p《0.001。[0063]图10为实施例1中二穗短柄草中hbrsar1转基因植株盐胁迫下根毛的表型分析(bar＝0.5mm)。[0064]图11为实施例1中hbrsar1在酵母cy162中的功能验证结果。图11的a为空载体p424和hbrsar1质粒p424-hbrsar1转运菌株进行不同梯度稀释，在不同浓度钾的ap-t培养基上的生长情况照片，图中每张照片从左至右菌株的稀释梯度依次为100、10-1、10-2、10-3。图11的b为利用非损伤对图11的a中在不同钾培养基生长的菌株进行iaa流动的测定结果图。具体实施方式[0065]下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本
技术领域：
：普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。[0066]下述实施例中，如无特殊说明，序列表中各核苷酸序列的第1位均为相应dna/rna的5′末端核苷酸，末位均为相应dna/rna的3′末端核苷酸。[0067]下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均为常规生化试剂，可从商业途径得到。[0068]1、菌株与载体[0069]下述实施例中的酵母突变株cy162为钾离子转运缺陷型酵母突变体，记载于非专利文献“juliea.anderson,etal.,functionalexpressionofaprobablearabidopsisthalianapotassiumchannelinsaccharomycescerevisiae,1992,proc.natl.acad.sci.usa,vol.89pp.3736-3740.”。公众可从北京市农林科学院获得，以重复本技术实验，不可作为其它用途使用。[0070]下述实施例中的用于酵母转化的载体p424，记载于非专利文献“mumbergd,müllerr,funkm.regulatablepromotersofsaccharomycescerevisiae:comparisonoftranscriptionalactivityandtheiruseforheterologousexpression.nucleicacidsres.22:5767-5768.”。公众可从北京市农林科学院获得，以重复本技术实验，不可作为其它用途使用。[0071]2、植物品系[0072]下述实施例中的野大麦(hordeumbrevisubulatum)记载于非专利文献“haiwenzhangetal.,emergingcrosstalkbetweentwosignalingpathwayscoordinatesk andna homeostasisinthehalophytehordeumbrevisubulatum，2020，journalofexperimentalbotany,vol.71,no.14pp.4345-4358.”。公众可从北京市农林科学院获得，以重复本技术实验，不可作为其它用途使用。[0073]下述实施例中的拟南芥col-0野生型记载于非专利文献“hoetal.,chl1functionasanitratesensorinplants,2009，cell：1184-1194”。公众可从北京市农林科学院获得，以重复本技术实验，不可作为其它用途使用。[0074]下述实施例中的拟南芥35s:hbrsar1转基因植株为拟南芥col-0野生型为基础得到的增强根系钾离子吸收及根系生长发育的植株，为北京市农林科学院通过拟南芥转基因获得，记载于非专利文献“cloughetal.,floraldip:asimplifiedmethodforagrobacterium-mediatedtransformationofarabidopsisthaliana,1998,plantj,735-743”公众可从北京市农林科学院获得，以重复本技术实验，不可作为其它用途使用。[0075]下述实施例中的二穗短柄草bd-21记载于非专利文献“hoetal.,chl1functionasanitratesensorinplants,2009，cell：1184-1194”。公众可从北京市农林科学院获得，以重复本技术实验，不可作为其它用途使用。[0076]3、试剂[0077]下述实施案例中，hoagland’s营养液为将kno3、ca(no3)2、mgso4.7h2o、和kh2po4溶于水定容于1l，使得hoagland’s营养液中kno3的浓度为0.51g/l、ca(no3)2的浓度为0.82g/l、mgso4.7h2o的浓度为0.49g/l、kh2po4的浓度为0.136g/l；再加入lmlfeedta溶液；然后加入lmla-z溶液，得到的营养液。所述feedta溶液为将7.45gna2edta、5.57gfeso4.7h2o溶解于200ml蒸馏水中，加热，不断搅拌至na2edta溶液与feso4溶液混合，定容至1l得到的溶液。所述a-z溶液为将h3bo3、cuso4·5h2o、znso4·7h2o、mgcl2·6h2o、hmoo·4h2o溶于水，使得a-z溶液中h3bo3的浓度为2.80mg/l，cuso4·5h2o的浓度为0.08mg/l，znso4·7h2o的浓度为0.22mg/l，mgcl2·6h2o的浓度为81mg/l，hmoo·4h2o的浓度为0.09mg/l，得到的溶液。[0078]下述实施案例中的hoagland’s固体培养基为向hoagland’s营养液中添加固定剂琼脂得到的固体培养基。[0079]下述实施案例中，1/2hoagland’s培养液由溶质和溶剂组成，溶质的种类同hoagland’s营养液，浓度为hoagland’s培养液中溶质的1/2，溶剂为蒸馏水。[0080]下述实施案例中，cim诱导培养基为将ms盐、蔗糖、pvp、cuso4、2,4-d和凝胶溶于水，使得在cim诱导培养基中ms盐的浓度为4.43g/l，蔗糖的浓度为30g/l，pvp的浓度为2g/l，cuso4的浓度为0.6mg/l，2,4-d的浓度为2.5mg/l，凝胶的浓度为3.5g/l，以koh溶液调ph为5.8，121℃、15min高压蒸汽灭菌，得到的培养基。[0081]下述实施例中的定量试验，如无特殊说明，均设置三次重复实验，结果取平均值，*表示显著性分析结果为p＜0.05。[0082]实施例1[0083]材料与方法：[0084]野大麦材料培养：盐生牧草野大麦采自内蒙古盐渍化草原(2006年8月，北京市农林科学院采自于内蒙古呼和浩特郊区，联系方式：北京市海淀区曙光花园中路9号北京市农林科学院李瑞芬15811108560)。[0085]在室温条件下野大麦种子用去离子水浸泡12h后，放入到4℃冰箱中过夜。用灭菌的去离子水冲洗3遍，放于湿润纱布的培养皿中，25℃萌芽。经过4～5天待其大部分发芽之后，转到灭过菌的盛有1/2hoagland’s培养液的玻璃瓶中(玻璃瓶用不透光的纸包住)，在温度22-23℃，光照强度1000-3000μmolm-2s-1，光照时间12h/天的条件下生长，待长到两叶一心时，在1/2hoagland’s培养液中加入350mmnacl进行盐胁迫，设置不加入nacl的1/2hoagland’s培养液作为对照处理。处理后30分钟、1小时、6小时和24小时，在要求的处理时间点取材，用铝薄纸包好标明，立即投入液氮中固定，-80℃保存备用。[0086]野大麦rna提取：取上述350mmo/lnacl胁迫30min后的野大麦幼苗和未进行盐处理的对照幼苗的根为材料，根据trizol(invitrogen，usa)试剂盒说明，提取经盐处理野大麦根及对照材料的总rna，dnasei消化总rna中残留的dna，酚/氯仿/异戊醇混合液(25:24:1)抽提总rna，分光光度计测定od260和od280，根据od260值计算rna的产量；根据od260/od280值判断rna的质量。根据takara公司primescripttmrtmastermix(perfectrealtime)kit说明，将mrna反转录为双链cdna。[0087]对野大麦进行全长转录组测序及转录组基因表达分析：从获得的转录组数据中，分析获得多个潜在的钾离子转运体，并通过全长转录组获得相关基因的全长cdna序列。根据序列信息，设计获得hbrsar1基因全长的引物hbrsar1-f和hbrsar1-r：[0088]hbrsar1-f：5’‑atggttgttgtttcgcagggccag-3’；[0089]hbrsar1-r：5’‑ctaaacgtagtagatcatgccgac-3’。[0090]以野大麦盐根的cdna为模板，以引物hbrsar1-f和hbrsar1-r扩增获得2.3kb的基因全长。在http://www.ch.embnet.org/software/tmpred_form.html网站上利用tmpred软件对hbrsar1进行跨膜域和疏水性分析。[0091]hbrsar1的克隆与序列分析：利用对野大麦进行全长转录组的测序，并通过分析表达信息，获得一个表达量较高的重要钾离子转运体hbrsar1，并根据测序序列设计引物，利用pcr从野大麦根中提取rna进行hbrsar1的cds序列扩增，获得hbrsar1的cds序列(如序列表中序列1所示)。hbrsar1的cds全长2319bp，编码氨基酸序列是序列表中序列2的蛋白质hbrsar。将hbrsar1的氨基酸序列(序列表中序列2)输入网站http://www.cbs.dtu.dk/services/tmhmm/，利用tmhmm软件对蛋白的跨膜区进行预测，结果显示hbrsar1由13个跨膜区组成，在其c端有一段长的氨基酸序列尾巴(见图1)。[0092]hbrsar1的亚细胞定位：以带gfp基因的植物表达载体pcambia1302(cambia公司，货号hg-vzc0325)为出发载体，用hbrsar1的cds序列(如序列表中序列1)替换pcambia1302载体的限制性核酸内切酶ncoi和spei识别位点间的片段(包括ncoi的识别位点和spei识别位点在内的小片段)，保持pcambia1302的其它序列不变，得到表达gfp标记的hbrsar1的重组表达载体，命名为pcambia1302-hbrsar1-gfp。[0093]提取拟南芥col-0野生型叶片的原生质体，将pcambia1302-hbrsar1-gfp质粒转入原生质体中，倒置于confocal显微镜载物台上，20倍物镜下观察原生质体中的绿色荧光，确定hbrsar1的细胞定位。[0094]利用gfp荧光显示的结果见图2的a图，表明hbrsar1主要定位在细胞膜上。[0095]拟南芥中hbrsar1的转基因植株及表型观察：以植物表达载体pcambia1300(cambia公司，货号hg-vzc0323)为出发载体，用核苷酸序列是序列表中序列1的hbrsar1的cds序列基因及其自有启动子(名为hbhak2启动子，记载于申请号为201610015458.3的专利中)的dna分子替换pcambia1300载体的限制性核酸内切酶ecori和hidiii酶识别位点间的片段(包括ecori的识别位点和hidiii识别位点在内的小片段)，保持pcambia1300载体的其它序列不变，得到hbrsar1自身启动子启动的hbrsar1的重组表达载体，命名为pcambia1300-prohbrsar1-hbrsar1。[0096]将构建好的pcambia1300-prohbrsar1-hbrsar1质粒转入农杆菌gv3101中，选择生长了6-8周且健壮的拟南芥col-0野生型植株，侵染拟南芥的开花部位，收集转基因t0代种子在潮霉素抗性板上进行筛选，获得阳性苗即为hbrsar1的转基因植株，共得到10株阳性苗，其中三株分别命名为np:hbrsar1-l1，np:rsar1-l2，np:rsar1-l3，分别收获t1代种子用于表型观察。[0097]将拟南芥转基因植株种植在不同逆境处理的培养基上，对植株的抗逆性进行观察，具体如下：[0098]渗透势试验[0099]以hbrsar1的拟南芥转基因植株np:hbrsar1-l1，np:rsar1-l2为材料，以拟南芥col-0野生型和拟南芥35s:rsar1突变体为对照。[0100]正常条件对照(1/2ms)：以1/2ms固体培养基(生长20天。[0101]200mm甘露醇处理(200mmmannitol)：以1/2ms 200mm甘露醇固体培养基生长20天。1/2ms 200mm甘露醇培养基是向1/2ms中添加甘露醇至甘露醇的含量为200mm得到的液体，然后加入琼脂高温灭菌获得固体培养基。[0102]300mm甘露醇处理(300mmmannitol)：以添加1/2ms 300mm甘露醇固体培养基生长20天。1/2ms 300mm甘露醇培养基是向1/2ms中添加甘露醇至甘露醇的含量为300mm得到的液体，然后加入琼脂高温灭菌获得固体培养基。[0103]结果见图3，可以观察到，高渗透势(甘露醇处理)胁迫下，hbrsar1能够有效通过促进根系的生长，提高了植株的抗逆性。[0104]营养匮乏试验[0105]以hbrsar1的拟南芥转基因植株np:hbrsar1-l1，np:rsar1-l2为材料，以拟南芥col-0野生型为对照。[0106]正常条件对照：以1/2ms固体培养基(由溶质和溶剂组成，溶剂为水，溶质及其浓度为：0.5mmcaso4，0.5mmmgcl2，1μmkh2po4，2.5mmmes(ph＝5.8)，50μmnafeedta，50μmh3bo3，12μmmncl2，1μmcucl2，1μmzncl2，0.03μmnh4moo4，0.5％蔗糖，10mmkno3)生长14天。[0107]无糖处理(nosucrose)：以不含蔗糖的1/2ms固体培养基(由溶质和溶剂组成，溶剂为水，溶质及其浓度为：0.5mmcaso4，0.5mmmgcl2，1μmkh2po4，2.5mmmes(ph＝5.8)，50μmnafeedta，50μmh3bo3，12μmmncl2，1μmcucl2，1μmzncl2，0.03μmnh4moo4，10mmkno3)生长14天。[0108]低氮处理(lowno3-):以no3-含量为1mm的氮营养匮乏的固体培养基(由溶质和溶剂组成，溶剂为水，溶质及其浓度为：0.5mmcaso4，0.5mmmgcl2，1μmkh2po4，2.5mmmes(ph＝5.8)，50μmnafeedta，50μmh3bo3，12μmmncl2，1μmcucl2，1μmzncl2，0.03μmnh4moo4，0.5％蔗糖，1mmkno3)，生长14天。[0109]低氮无糖处理(lowno3-nosucrose):以no3-含量为1mm且不含蔗糖的氮营养匮乏固体培养基(由溶质和溶剂组成，溶剂为水，溶质及其浓度为：0.5mmcaso4，0.5mmmgcl2，1μmkh2po4，2.5mmmes(ph＝5.8)，50μmnafeedta，50μmh3bo3，12μmmncl2，1μmcucl2，1μmzncl2，0.03μmnh4moo4，1mmkno3)生长14天。[0110]结果见图4，营养匮乏(低氮、低糖等)胁迫下，hbrsar1能够有效通过促进根系的生长，提高了植株的抗逆性。[0111]盐处理试验一[0112]以hbrsar1的拟南芥转基因植株np:hbrsar1-l1，np:rsar1-l2，np:rsar1-l3为材料，以拟南芥col-0野生型为对照。[0113]正常条件(对照)：以1/2ms固体培养基生长3周。[0114]75mmnacl处理：以1/2ms 75mmnacl的固体培养基生长3周。1/2ms 75mmnacl的固体培养基是以1/2ms为基础培养基，向该基础培养基中添加nacl至nacl的含量为75mm得到的培养基。[0115]125mmnacl处理：以1/2ms 125mmnacl的固体培养基生长3周。1/2ms 125mmnacl的固体培养基是以1/2ms为基础培养基，向该基础培养基中添加nacl至nacl的含量为125mm得到的培养基。[0116]结果见图5，表明hbrsar1的转基因植株明显提高了拟南芥的耐盐性，尤其在高盐(125mmnacl)条件下，hbrsar1转基因植株(np:hbrsar1-l1、np:rsar1-l2和np:rsar1-l3)仍能保持生长。[0117]盐处理试验二[0118]以hbrsar1的拟南芥转基因植株np:hbrsar1-l1，np:rsar1-l2为材料，以拟南芥col-0野生型和拟南芥35s:rsar1突变体为对照。[0119]正常条件(对照)：以1/2ms固体培养基生长30天。[0120]100mmnacl处理：以1/2ms 100mmnacl的固体培养基生长30天。1/2ms 100mmnacl的固体培养基是以1/2ms为基础培养基，向该基础培养基中添加nacl至nacl的含量为100mm得到的培养基。[0121]于生长15天时对100mmnacl处理的植株及对照的植株进行拍照，并统计主根长度、侧根数量和侧根长度；于生长30天时再次拍照。[0122]结果见图6，可以观察到，在高盐(100mmnacl)胁迫下，hbrsar1能够有效通过促进根系的生长，提高了植株的抗逆性。[0123]盐处理试验三[0124]以hbrsar1的拟南芥转基因植株np:hbrsar1-l1，np:rsar1-l2为材料，以拟南芥col-0野生型和拟南芥35s:rsar1突变体为对照。[0125]正常条件(对照)：以1/2ms固体培养基生长5天。[0126]75mmnacl处理：以1/2ms 75mmnacl的固体培养基生长5天。1/2ms 75mmnacl的固体培养基是以1/2ms为基础培养基，向该基础培养基中添加nacl至nacl的含量为75mm得到的培养基。[0127]100mmnacl处理：以1/2ms 100mmnacl的固体培养基生长5天。1/2ms 100mmnacl的固体培养基是以1/2ms为基础培养基，向该基础培养基中添加nacl至nacl的含量为100mm得到的培养基。[0128]对hbrsar1的转基因植株进行根毛表型的观察，结果见图7，可以看出：在盐胁迫下，拟南芥col-0野生型的根毛生长明显受到抑制，hbrsar1能够增加盐胁迫下根毛的生长，包括数量和长度(图7的a)，图7的b是对数量和长度的统计。从以上所有数据可以看出，hbrsar1促进盐胁迫下侧根和根毛的生长发育，增加了植物根系的生物量，同时也促进了地上部分的生长，提高了植物的耐盐性。[0129]hbrsar1对盐胁迫下拟南芥根钾吸收的影响：以hbrsar1的转基因植株np:hbrsar1-l1，np:rsar1-l2为材料，以拟南芥col-0野生型为对照。通过非损伤技术(nmt)对拟南芥hbrsar1转基因植株和野生型进行钾离子流动的测定，取ms板上生长了5天的植株进行正常条件下的测定，再将它们在100mmnacl(1/2ms 100mmnacl的营养液)中处理1小时后进行钾离子流(参考文献“lir,zhangj,wug,wangh,cheny,weij.hbcipk2,anovelcbl-interactingproteinkinasefromhalophytehordeumbrevisubulatum,conferssaltandosmoticstresstolerance.plantcellenviron.35:1582-600.”)的测定。[0130]实验结果见图8，表明在正常条件下，拟南芥col-0野生型和hbrsar1转基因植株(np:hbrsar1-l1，np:rsar1-l2)钾离子流动都在0附近，但在盐处理时，拟南芥col-0野生型表现为钾的外流，而转基因植株则表现为钾的内流。因此，hbrsar1促进了拟南芥植株盐胁迫下根系对钾的吸收，提高了盐胁迫下钾的利用。[0131]二穗短柄草中hbrsar1的转基因植株及表型观察：禾本科单子叶模式植物二穗短柄草bd-21的成熟胚剥去内外稃后，置于cim诱导培养基上，诱导3-4周，出愈后，取鲜黄色胚性愈伤置于新的cim诱导培养基上活化愈伤1-2周后，进行农杆菌转化。将转有pcambia1300-prohbrsar1-hbrsar1质粒的农杆菌gv3101侵染诱导好的愈伤组织，将愈伤组织块转移至含有150mg/l特美汀和30mg/l潮霉素的cim培养基，在22℃黑暗中孵育2周，进行进一步筛选。将再生出的二穗短柄草幼苗移至含有150mg/l特美汀和30mg/l潮霉素的生根培养基中进行生根，生根后的幼苗移至不含抗性的生根培养基中继续生长，将阳性苗移到土中进行生长，共得到6株阳性苗，其中两株分别命名为np:hbrsar1-l1，np:rsar1-l2，分别收获t1代种子用于表型观察。[0132]盐处理试验一[0133]以hbrsar1的二穗短柄草转基因植株np:hbrsar1-l1，np:rsar1-l2为材料，以二穗短柄草bd-21野生型为对照。[0134]正常条件(对照)：以hoagland’s营养液水培生长14天。[0135]75mmnacl处理：将在正常条件下生长了7天的植株移到75mmnacl处理条件下(hoagland’s 75mmnacl的营养液水培)继续生长7天。hoagland’s 75mmnacl的营养液是以hoagland’s营养液为基础营养液，向该基础营养液中添加nacl至nacl的含量为75mm得到的营养液。[0136]每处理每组苗为5棵。[0137]在正常条件下，野生型bd-21和hbrsar1转基因植株(np:hbrsar1-l1，np:rsar1-l2)生长类似，但在75mmnacl处理7天后，转基因植株根系生长发达，包括根的数量明显多于野生型(见图9的a、图9的b、图9的c)。在盐胁迫下，hbrsar1转基因植株的鲜重也明显高于野生型(见图9的d)，同时，对相应植株进行钾离子浓度的检测，发现盐胁迫下hbrsar1的转入有效提高了植株对钾离子的吸收，提高了植株钾离子的含量(见图9的e)。[0138]盐处理试验二[0139]以hbrsar1的二穗短柄草转基因植株np:hbrsar1-l1，np:rsar1-l2为材料，以二穗短柄草bd-21野生型为对照。[0140]正常条件(对照)：以hoagland’s固体培养基生长7天。[0141]150mmnacl处理：以hoagland’s 150mmnacl的固体培养基生长7天。[0142]hoagland’s 150mmnacl的固体培养基是以hoagland’s固体培养基为基础培养基，向该基础培养基中添加nacl至nacl的含量为150mm得到的培养基。[0143]在正常条件下，野生型bd-21和hbrsar1转基因植株(np:hbrsar1-l1，np:rsar1-l2)的根毛生长类似，但在150mmnacl处理条件下，转基因植株根毛生长发达，包括数量和根毛长度(见图10)。[0144]以上结果表明将hbrsar1转入禾本科单子叶模式植物二穗短柄草bd-21中，转基因植株表现出与拟南芥相似的表型。[0145]酵母功能互补及iaa流动分析：以用于酵母转化的载体p424为出发载体，用hbrsar1的cds序列替换p424载体的限制性核酸内切酶hindiii和ecori识别位点间的片段(包括hindiii的识别位点和ecori识别位点在内的小片段)，保持p424载体的其它序列不变，得到用于酵母转化的hbrsar1的重组表达载体，命名为p424-hbrsar1。[0146]按照标准酵母转化方法，将p424-hbrsar1转入钾离子转运缺陷型酵母cy162中，在trp氨基酸缺陷型酵母培养基上筛选阳性克隆。每个含有目标基因质粒的阳性转化子平板中均挑取3个1mm大小的单克隆，转接到新的相应的氨基酸缺陷型酵母培养基上，30℃恒温培养箱中倒置培养2天左右。挑取适量活化好的每个菌落溶到一定体积的ddh2o中，混匀，调菌液浓度一致，按10倍关系进行梯度稀释三次，即100、10-1、10-2、10-3。按每个菌斑8μl菌液量，依次吸取各稀释度的菌液点在含不同钾离子浓度(0mm、1mm、3mm、5mm、10mm)的相应氨基酸缺陷型ap-trp培养基上；晾干菌液，于30℃恒温培养箱倒置培养3～5天，观察酵母菌斑生长情况。设置转p424载体的酵母株系作为阴性对照。利用非损伤仪器设备对生长的菌斑进行iaa生长流的测定，确定hbrsar1对iaa流动的改变和调控。[0147]实验结果如图11所示：在5mm和10mm钾的条件下，较空载体转运菌株，hbrsar1的转化菌株在第三个稀释梯度(10-2)和第四个稀释梯度(10-3)生长较好(图11的a)，进一步证明了hbrsar1对钾离子的转运功能。在非损伤的测试中(图11的b)，可以看到hbrsar1能够改变iaa的流动性，表型了介导了iaa的外流，尤其在低浓度钾(1mm和5mm钾)时更为突出。[0148]这些结果说明本发明在盐生植物野大麦盐胁迫下的转录组分析时筛选出的钾离子转运体新基因hbrsar1主要在根中表达，尤其在根毛、侧根发生点等组织强烈表达，并能够被高盐诱导。hbrsar1定位在细胞膜上，在酵母突变株cy162和拟南芥的转基因植株中表现出强的钾吸收能力，同时促进多种胁迫下植物根系的生长发育，包括根毛的伸长和侧根的生长。通过转基因，hbrsar1在禾本科植物而穗短柄草中表现出同样的促进根系生长发育的现象，同时能够有效提高植物在盐胁迫下对钾的吸收。利用细胞生物学、分子生物学等技术手段发现hbrsar1是通过植物激素iaa的信号通路调控植物根系构型的。[0149]以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本技术欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本技术中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。[0150]参考文献[0151][1]almeidadm,oliveiramm,saibonjm.(2017)regulationofna andk homeostasisinplants:towardsimprovedsaltstresstoleranceincropplants.genet.mol.biol.40:326–345.[0152][2]atkinsonja,rasmussena,trainir,vossu,sturrockc,mooneysj.(2014)branchingoutinroots:uncoveringform,function,andregulation.plantphysiol.166:538-550.[0153][3]osmontks,siboutr,hardtkecs.(2007)hiddenbranches:developmentsinrootsystemarchitecture.annurevplantbiol.58:93-113.[0154][4]duy,scheresb.(2018)lateralrootformationandthemultiplerolesofauxin.jexpbot.69:155-167.[0155][5]pottersg,pasternaktp,guisezy,palmekj,jansenma.(2007)stress-inducedmorphogenicresponses:growingoutoftrouble？trendsplantsci.12:98-105.[0156][6]julkowskamm,hoefsloothc,mols,feronr,deboergj,haringma,testerinkc.(2014)capturingarabidopsisrootarchitecturedynamicswithroot-fitrevealsdiversityinresponsestosalinity.plantphysiol.166:1387-402.[0157][7]sunf,zhangw,huh,lib,wangy,zhaoy,lik,lium,lix.(2008)saltmodulatesgravitysignalingpathwaytoregulategrowthdirectionofprimaryrootsinarabidopsis.plantphysiol.146:178-88.[0158][8]motteh,vannestes,beeckmant.(2019)molecularandenvironmentalregulationofrootdevelopment.annurevplantbiol.70:465-488.[0159][9]benitob,haror,amtmanna,cuinta,dreyeri.(2014)thetwinsk andna inplants.j.plantphysiol.171:723-31.[0160][10]alemanf,nieves-cordonesm,martinezv,rubiof.(2009)differentialregulationofthehak5genesencodingthehigh-affinityk transportersofthellungiellahalophilaandarabidopsisthaliana.environ.exp.bot.65:263–269.[0161][11]cheng,huq,luol,yangt,zhangs,huy,etal.(2015)ricepotassiumtransporteroshak1isessentialformaintainingpotassium-mediatedgrowthandfunctionsinsalttoleranceoverlowandhighpotassiumconcentrationranges.plantcellenviron.38:2747–2765.[0162][12]oomenrjfj,benitob,sentenach,rodríguez-navarroa,talónm,vérya-a,etal.(2012)hkt2；2/1,ak -permeabletransporteridentifiedinasalt-tolerantricecultivarthroughsurveysof[0163]naturalgeneticpolymorphism.plantj71:750–62.[0164][13]sheny,shenl,shenz,jingw,geh,zhaoj,etal.(2015)thepotassiumtransporteroshak21functionsinthemaintenanceofionhomeostasisandtolerancetosaltstressinrice.plantcellenviron.38:2766–2779.[0165][14]rigass,ditengoufa,ljungk,darasg,tietzo,palmek,hatzopoulosp.(2013)rootgravitropismandroothairdevelopmentconstitutecoupleddevelopmentalresponsesregulatedbyauxinhomeostasisinthearabidopsisrootapex.newphytol.197:1130-1141.[0166][15]yangt,fengh,zhangs,xiaoh,huq,etal.(2020)thepotassiumtransporteroshak5altersricearchitectureviaatp-dependenttransmembraneauxinfluxes.plantcommun.1:100052.[0167][16]lir,zhangj,wug,wangh,cheny,weij.hbcipk2,anovelcbl-interactingproteinkinasefromhalophytehordeumbrevisubulatum,conferssaltandosmoticstresstolerance.plantcellenviron.35:1582-600.[0168][17]mumbergd,müllerr,funkm.regulatablepromotersofsaccharomycescerevisiae:comparisonoftranscriptionalactivityandtheiruseforheterologousexpression.nucleicacidsres.22:5767-5768.当前第1页12当前第1页12
技术领域：
：1.本发明涉及生物
技术领域：
：中钾离子转运体蛋白hbrsar1及其在调控植物对钾转运中的应用。
背景技术：
：：2.植物的抗逆性一直以来是现代农业发展的瓶颈问题，应用特殊抗逆种质资源挖掘独特抗逆机理，对改善环境、提高土地的利用率和作物的产量具有异同寻常的意义。盐生的野大麦(hordeumbrevisubulatum(trin.)link)是禾本科大麦属的多年生盐生植物，适应性强，尤其能够在含盐量0.6-1.0％的重度盐碱地上生长良好，表现出非常强的耐盐特性。盐生野大麦不仅是优良牧草，更是改良盐碱地的先锋植物，同时作为大麦、小麦的野生近缘种，能够为改良农作物的抗逆性提供优良基因库，具有极广的推广应用和研究价值。盐生野大麦的研究多局限于形态、解剖及生理特性方面的研究，对其独特的耐盐调控分子机制知之甚少。研究中发现盐生野大麦的耐盐特性主要依赖于其在盐胁迫下保持较高的钾钠比，维持离子平衡。钾是植物细胞中最丰富的阳离子，占细胞干重的10％，除了作为酶的辅助因子，调节渗透势，带动细胞延伸生长等基本功能外，钾对提高植物的抗逆性具有重要的作用，但具体机制知之甚少[1]。[0003]植物种子萌发后，根系便连续快速地扩大生长和延伸，以便吸收更多的营养物质，根系的发达程度直接决定植物地上部分的生长，同时根系是最先感知土壤环境变化并做出反应的器官，包括主根、侧根和不定根[2]。植物所有根系的宏观、空间排列统称为根系结构rsa(rootsystemarchitecture)，高等植物的rsa主要通过维持根尖分生组织的胚胎后发育，生成根分支所必需的新原基以及在表皮细胞层上形成根毛[3]。在生物和非生物胁迫下，根系结构的可塑性和多样性会直接决定植物的生长状态[4]。盐胁迫导致植物根系生长迟缓，表现为根的长度减小(主根和侧根)，侧根的数目减少，改变了根系构型，同时根毛的形成受阻及根的向性发生改变[5-7]。根系的减少大大降低了根的吸收面积，造成植物营养物质的匮乏，延缓了植株的生长。矿质营养对植物的结构、信号传导、物质代谢等方面具有基础性的作用，是植物生长必不可少的营养物质。这些矿质营养物质几乎全部来自于根系从土壤的吸收，同时可塑性强的根系会对土壤中矿质元素的条件和环境的改变即时地做出反应[8]。多种矿质元素对根系构型有重要的影响，包括氮、磷、钾、硫、镁、铁、钙、锌、硼等。以拟南芥为例，硫、镁、铁和氮的缺乏导致侧根密度的减少，而钙、锌、硼和磷的缺乏促进侧根的生长，但多数矿质元素的作用机制仍然未知[38]。[0004]植物中的钾离子含量很高，当细胞无法维持细胞质中100mm的钾离子浓度时，相关生理功能受到抑制。因此含高浓度钾的植物常常被称为具有“保险机制”，在逆境胁迫时，存活率明显高于其他植物[9]。盐胁迫下，大量钠离子会造成钾离子的流失，植物因无法获得足够的钾离子，许多生理功能受到限制，阻碍植物生长。在水稻和拟南芥中已报道多个钾离子吸收转运体的突变体会表现出对盐敏感的表型[10-13]。近几年，盐胁迫下的钠钾平衡及调控是研究植物耐盐的一个重要方面，并在钠离子的外排和钾离子的高效吸收方面取得了一系列优秀的研究成果，然而钾离子是通过什么机制提高植物耐盐性的鲜有报道。[0005]钾与根系的生长发育有密切的关系，但调控机制仍然未知。拟南芥在钾匮乏的条件下抑制侧根发育，而在钾充足时能够有效提高侧根的数量和长度。目前，钾如何调控根系发育还知之甚少。拟南芥钾离子转运体trh1的突变体表现出破坏根毛生长的表型，同时研究发现trh1的缺失造成生长素的分布发生紊乱[14]。水稻中的oshak5调控植株的分蘖数，侧根和根毛的长度[15]。这些研究成果肯定了钾的信号通路与侧根发生发育的信号通路是有交叉的，但最核心和关键的调控机制仍迄待挖掘和解析。技术实现要素：[0006]本发明所要解决的技术问题是如何提高植物在逆境下，尤其是盐胁迫下，对钾的吸收利用。[0007]为了解决以上技术问题，本发明提供了一种蛋白质，名称为hbrsar1，是如下a1)、a2)或a3)的蛋白质：[0008]a1)氨基酸序列是序列表中序列2的蛋白质；[0009]a2)将a1)的蛋白质经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与a1)所示的蛋白质具有90％以上的同一性且具有提高钾离子转运活性的蛋白质；[0010]a3)在a1)或a2)的n末端或/和c末端连接蛋白质标签得到的融合蛋白质。[0011]上述蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。[0012]上述蛋白质中，所述蛋白质标签(protein-tag)是指利用dna体外重组技术，与目的蛋白质一起融合表达的一种多肽或者蛋白质，以便于目的蛋白质的表达、检测、示踪和/或纯化。所述蛋白质标签可为flag标签、his标签、mbp标签、ha标签、myc标签、gst标签、gfp标签、gus标签和/或sumo标签等。[0013]上述蛋白质中，同一性是指氨基酸序列的同一性。可使用国际互联网上的同源性检索站点测定氨基酸序列的同一性，如ncbi主页网站的blast网页。例如，可在高级blast2.1中，通过使用blastp作为程序，将expect值设置为10，将所有filter设置为off，使用blosum62作为matrix，将gapexistencecost，perresiduegapcost和lambdaratio分别设置为11，1和0.85(缺省值)并进行检索一对氨基酸序列的同一性进行计算，然后即可获得同一性的值(％)。[0014]上述蛋白质中，所述90％以上的同一性可为至少91％、92％、95％、96％、98％、99％或100％的同一性。[0015]与hbrsar1相关的生物材料也属于本发明的保护范围。[0016]本发明所提供的与蛋白质hbrsar1相关的生物材料，为下述b1)至b5)中的任一种：[0017]b1)编码hbrsar1的核酸分子；[0018]b2)含有b1)所述核酸分子的表达盒；[0019]b3)含有b1)所述核酸分子的重组载体、或含有b1)所述表达盒的重组载体；[0020]b4)含有b1)所述核酸分子的重组微生物、或含有b2)所述表达盒的重组微生物、或含有b3)所述重组载体的重组微生物；[0021]b5)含有b1)所述核酸分子的转基因植物细胞系、或含有b2)所述表达盒的转基因植物细胞系、或含有b3)所述重组载体的转基因植物细胞系。[0022]其中，所述核酸分子可以是dna，如cdna、基因组dna或重组dna；所述核酸分子也可以是rna，如mrna或hnrna等。[0023]上述生物材料中，b1)所述核酸分子为如下b1)或b2)所示的基因：[0024]b1)编码链的编码序列是序列表中序列1的cdna分子或dna分子；[0025]b2)编码链的核苷酸是序列表中序列1的cdna分子或dna分子。[0026]其中，序列表中的序列1由2319个核苷酸组成，编码序列表中的序列2所示的蛋白质。[0027]上述生物材料中，b2)所述的含有所述核酸分子的表达盒(hbrsar1基因表达盒)，是指能够在宿主细胞中表达hbrsar1的核酸分子，该核酸分子不但可包括启动hbrsar1基因转录的启动子，还可包括终止hbrsar1转录的终止子。[0028]进一步，所述表达盒还可包括增强子序列。可用于本发明的启动子包括但不限于：组成型启动子，组织、器官和发育特异的启动子，和诱导型启动子。启动子的例子包括但不限于：hbrsar2启动子，花椰菜花叶病毒的组成型启动子35s；来自西红柿的创伤诱导型启动子，亮氨酸氨基肽酶("lap",chao等人(1999)plantphysiology120:979-992)；来自烟草的化学诱导型启动子，发病机理相关1(pr1)(由水杨酸和bth(苯并噻二唑-7-硫代羟酸s-甲酯)诱导)；西红柿蛋白质酶抑制剂ii启动子(pin2)或lap启动子(均可用茉莉酮酸曱酯诱导)；热休克启动子(美国专利5，187，267)；四环素诱导型启动子(美国专利5,057,422)；种子特异性启动子，如谷子种子特异性启动子pf128(cn101063139b(中国专利200710099169.7))，种子贮存蛋白质特异的启动子(例如，菜豆球蛋白质、napin,oleosin和大豆betaconglycin的启动子(beachy等人(1985)emboj.4:3047-3053))。它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用。此处引用的所有参考文献均全文引用。合适的转录终止子包括但不限于：农杆菌胭脂碱合成酶终止子(nos终止子)、花椰菜花叶病毒camv35s终止子、tml终止子、豌豆rbcse9终止子和胭脂氨酸和章鱼氨酸合酶终止子(参见，例如：odell等人(i985)nature313:810；rosenberg等人(1987)gene,56:125；guerineau等人(1991)mol.gen.genet,262:141；proudfoot(1991)cell,64:671；sanfacon等人genesdev.,5:141；mogen等人(1990)plantcell,2:1261；munroe等人(1990)gene,91:151；ballad等人(1989)nucleicacidsres.17:7891；joshi等人(1987)nucleicacidres.,15:9627)。[0029]可用现有的植物表达载体构建含有所述hbrsar1基因表达盒的重组表达载体。所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。如pgreen0229-35s::gr、psoup、pahc25、pwmb123、pbin438、pcambia1302、pcambia2301、pcambia1301、pcambia1300、pcambia1381、pbi121、pcambia1391-xa或pcambia1391-xb(cambia公司)等。所述植物表达载体还可包含外源基因的3’端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mrna加工或基因表达的dna片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mrna前体的3’端，如农杆菌冠瘿瘤诱导(ti)质粒基因(如胭脂碱合成酶基因nos)、植物基因(如大豆贮存蛋白质基因)3’端转录的非翻译区均具有类似功能。使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是atg起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(gus基因、萤光素酶基因等)、抗生素的标记基因(如赋予对卡那霉素和相关抗生素抗性的nptii基因，赋予对除草剂膦丝菌素抗性的bar基因，赋予对抗生素潮霉素抗性的hph基因，和赋予对methatrexate抗性的dhfr基因，赋予对草甘磷抗性的epsps基因)或是抗化学试剂标记基因等(如抗除莠剂基因)、提供代谢甘露糖能力的甘露糖-6-磷酸异构酶基因。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。[0030]上述生物材料中，所述重组微生物具体可为酵母，细菌，藻和真菌。[0031]上述的蛋白质、或上述生物材料在如下w1-w4中的任一种应用也属于本发明的保护范围：[0032]w1)在调控植物的钾离子转运效率中的应用；[0033]w2)在调控植物耐逆性中的应用；[0034]w3)在调控植物耐盐能力中的应用；[0035]w4)在调控植物耐贫瘠能力中的应用。[0036]上述应用中，所述植物可为单子叶植物或双子叶植物。所述双子叶植物可为十字花科植物，如拟南芥；所述单子叶植物可为禾本科植物，如二穗短柄草。[0037]上述应用中，所述植物耐逆性具体可为对非生物胁迫的耐逆性，如对盐和/或干旱和/或营养贫瘠的耐逆性。[0038]上述应用中，所述对盐胁迫的耐逆性(耐盐能力)可体现为促进植物根生长，具体为促进植物主根增长和/或促进植物侧根数量增多和/或促进植物侧根增长和/或促进植物根毛数量增多和/或促进植物促进植物根毛增长。[0039]为了解决上述技术问题，本发明还提供了植物试剂，其作用为提高植物钾离子转运效率。[0040]本发明所提供的植物试剂含有所述的蛋白质或/和所述的蛋白质相关的生物材料。[0041]上述植物试剂的活性成分可为所述的蛋白质或/和所述的蛋白质相关的生物材料，上述植物试剂的活性成分还可含有其他生物成分或/和非生物成分，上述植物试剂的其他活性成分本领域技术人员可根据植物体钾离子转运效率的提升效果确定。[0042]为了解决上述技术问题，本发明还提供了一种产生体钾离子转运效率高的植物的方法。[0043]本发明所提供的产生体钾离子转运效率高的植物的方法，包括将编码所述蛋白质的基因导入目的植物中，得到体钾离子转运效率高的植物；所述体钾离子转运效率高的植物的体钾离子转运效率高于所述目的植物的体钾离子转运效率。[0044]所述目的植物可为不含编码所述蛋白质的核酸分子的单子叶植物或双子叶植物。所述双子叶植物可为十字花科植物，如拟南芥；所述单子叶植物可为禾本科植物，如二穗短柄草。[0045]上述方法中，其中所述的核酸分子可先进行如下修饰，再导入目的植物中，以达到更好的表达效果：[0046]1)修饰邻近起始甲硫氨酸的基因序列，以使翻译有效起始；例如，利用在植物中已知的有效的序列进行修饰；[0047]2)与各种植物表达的启动子连接，以利于其在植物中的表达；所述启动子可包括组成型、诱导型、时序调节、发育调节、化学调节、组织优选和组织特异性启动子；启动子的选择将随着表达时间和空间需要而变化，而且也取决于靶物种；例如组织或器官的特异性表达启动子，根据需要受体在发育的什么时期而定；尽管证明了来源于双子叶植物的许多启动子在单子叶植物中是可起作用的，反之亦然，但是理想地，选择双子叶植物启动子用于双子叶植物中的表达，单子叶植物的启动子用于单子叶植物中的表达；[0048]3)与适合的转录终止子连接，也可以提高本发明基因的表达效率；例如来源于camv的tml，来源于rbcs的e9；任何已知在植物中起作用的可得到的终止子都可以与本发明基因进行连接；[0049]4)引入增强子序列，如内含子序列(例如来源于adhl和bronzel)和病毒前导序列(例如来源于tmv,mcmv和amv)。[0050]所述的核酸分子可通过使用ti质粒，植物病毒栽体，直接dna转化，微注射，电穿孔等常规生物技术方法导入植物细胞(weissbach,1998，methodforplantmolecularbiologyviii,academypress,newyork,pp.411-463；geisersonandcorey,1998,plantmolecularbiology(2ndedition)。[0051]上述方法中，所述体钾离子转运效率高的植物可为转基因植物，也可为通过杂交等常规育种技术获得的植物。[0052]上述方法中，所述转基因植物理解为不仅包含第一代到第二代转基因植物，也包括其子代。对于转基因植物，可以在该物种中繁殖该基因，也可用常规育种技术将该基因转移进入相同物种的其它品种，特别包括商业品种中。所述转基因植物包括种子、愈伤组织、完整植株和细胞。[0053]本发明从盐生野大麦中分离、鉴定高效钾离子转运体hbrsar1，利用酵母体系、拟南芥和二穗短柄草的转基因体系、细胞分子生物学体系验证hbrsar1介导盐胁迫下钾的高效吸收，促进盐胁迫下的根系发育。这些研究不仅让我们明确盐生植物演化形成了抗逆新机制，更是为钾与生长素存在信号交叉协同调控根的生长发育这个悬而未决的问题提供了研究的突破口，为理解钾的根系调控机制新机制奠定了基础。有望应用于植物抗逆育种，尤其是耐盐育种中。附图说明[0054]图1为实施例1中hbrsar1的跨膜区域分析结果图。[0055]图2为实施例1中hbrsar1的细胞定位和组织定位图。图2为hbrsar1-gfp在细胞原生质体中的定位分析(bar＝20μm)，gfp为对照。[0056]图3为实施例1中渗透胁迫下hbrsar1转基因植株的侧根表型。其中，每张照片从左至右依次为拟南芥col-0野生型、转基因株系np:hbrsar1-l1、转基因株系np:hbrsar1-l2、拟南芥35s:rsar1突变体。[0057]图4实施例1中营养胁迫下hbrsar1转基因植株的侧根表型。其中，col-0为拟南芥col-0野生型，np:hbrsar1-l1为np:hbrsar1转基因植株np:hbrsar1-l1，l2为np:hbrsar1转基因植株np:hbrsar1-l2。[0058]图5为实施例1中在正常条件下、75mmnacl和125mmnacl条件下的拟南芥col-0野生型和自身启动子启动的hbrsar1的三个转基因株系生长3周之后的表型。其中，每张照片从左至右依次为拟南芥col-0野生型、np:hbrsar1-l1、np:hbrsar1-l2、np:hbrsar1-l3。[0059]图6为实施例1中盐胁迫下hbrsar1转基因植株的侧根表型。其中，图6的a的左图为正常条件下生长15的照片，中间图为盐胁迫下生长15天的照片，右图为盐胁迫下生长30天的照片，每张照片从左至右依次为拟南芥col-0野生型、转基因株系np:hbrsar1-l1、转基因株系np:hbrsar1-l2、拟南芥35s:rsar1突变体。图6的b为对图6的a中的中间图进行的数据统计，从左至右依次为主根长度、侧根数量和侧根长度。图中所示数据为平均值±标准差，重复数为3，以one-wayanova分析各组与拟南芥col-0野生型间的显著性差异，*代表显著性分析结果为p＜0.05，**代表显著性分析结果为p《0.01，***代表显著性分析结果为p《0.001。[0060]图7为实施例1中hbrasr1转基因植株在盐胁迫下的根毛表型。图7的a为野生型、np:hbrsar1转基因植株的两个系(np:rsar1-l1，np:rsar1-l2)和35s:hbrsar1在正常条件和盐处理(75mmnacl和100mmnacl)时的根毛表型。图7的b.为对图7的a中的根毛数目和长度的数据统计图。图中所示数据为平均值±标准差，重复数为3，以one-wayanova分析各组与拟南芥col-0野生型间的显著性差异，**代表显著性分析结果为p《0.01，***代表显著性分析结果为p《0.001。[0061]图8为实施例1中hbrsar1转基因植株根毛钾离子流动的测定结果图。图8的a为拟南芥col-0野生型的测定结果，重复数为3；图8的b为np:hbrsar1转基因植株np:rsar1-l1的测定结果，重复数为3；图8的c为np:hbrsar1转基因植株np:rsar1-l2的测定结果，重复数为3；图8的d为对钾离子流数据的三次测试共9组数据进行统计的柱状图。图8的e为进行非损伤测试时的测试照片。[0062]图9为实施例1中二穗短柄草hbrsar1转基因植株的表型分析。图9的a为野生型和hbrsar1转基因植株在正常条件和75mmnacl处理下的生长10天的表型，每张照片从左至右依次为野生型bd-21、转基因株系np:hbrsar1-l1、转基因株系np:hbrsar1-l2(每5颗苗为一组)。图9的b为对图9的a中野生型和hbrsar1转基因单颗植株根的展开图。图9的c为对a中野生型和转基因植株进行根的数量的测定的结果图。图9的d为对图9的a中单颗植株的鲜重统计条形图。图9的e为对图9的a中的植株的钾离子含量的测定结果图。图中所示数据为平均值±标准差，重复数为5，以one-wayanova分析各组与野生型bd-21间的显著性差异，*代表显著性分析结果为p＜0.05，**代表显著性分析结果为p《0.01，***代表显著性分析结果为p《0.001。[0063]图10为实施例1中二穗短柄草中hbrsar1转基因植株盐胁迫下根毛的表型分析(bar＝0.5mm)。[0064]图11为实施例1中hbrsar1在酵母cy162中的功能验证结果。图11的a为空载体p424和hbrsar1质粒p424-hbrsar1转运菌株进行不同梯度稀释，在不同浓度钾的ap-t培养基上的生长情况照片，图中每张照片从左至右菌株的稀释梯度依次为100、10-1、10-2、10-3。图11的b为利用非损伤对图11的a中在不同钾培养基生长的菌株进行iaa流动的测定结果图。具体实施方式[0065]下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本
技术领域：
：普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。[0066]下述实施例中，如无特殊说明，序列表中各核苷酸序列的第1位均为相应dna/rna的5′末端核苷酸，末位均为相应dna/rna的3′末端核苷酸。[0067]下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均为常规生化试剂，可从商业途径得到。[0068]1、菌株与载体[0069]下述实施例中的酵母突变株cy162为钾离子转运缺陷型酵母突变体，记载于非专利文献“juliea.anderson,etal.,functionalexpressionofaprobablearabidopsisthalianapotassiumchannelinsaccharomycescerevisiae,1992,proc.natl.acad.sci.usa,vol.89pp.3736-3740.”。公众可从北京市农林科学院获得，以重复本技术实验，不可作为其它用途使用。[0070]下述实施例中的用于酵母转化的载体p424，记载于非专利文献“mumbergd,müllerr,funkm.regulatablepromotersofsaccharomycescerevisiae:comparisonoftranscriptionalactivityandtheiruseforheterologousexpression.nucleicacidsres.22:5767-5768.”。公众可从北京市农林科学院获得，以重复本技术实验，不可作为其它用途使用。[0071]2、植物品系[0072]下述实施例中的野大麦(hordeumbrevisubulatum)记载于非专利文献“haiwenzhangetal.,emergingcrosstalkbetweentwosignalingpathwayscoordinatesk andna homeostasisinthehalophytehordeumbrevisubulatum，2020，journalofexperimentalbotany,vol.71,no.14pp.4345-4358.”。公众可从北京市农林科学院获得，以重复本技术实验，不可作为其它用途使用。[0073]下述实施例中的拟南芥col-0野生型记载于非专利文献“hoetal.,chl1functionasanitratesensorinplants,2009，cell：1184-1194”。公众可从北京市农林科学院获得，以重复本技术实验，不可作为其它用途使用。[0074]下述实施例中的拟南芥35s:hbrsar1转基因植株为拟南芥col-0野生型为基础得到的增强根系钾离子吸收及根系生长发育的植株，为北京市农林科学院通过拟南芥转基因获得，记载于非专利文献“cloughetal.,floraldip:asimplifiedmethodforagrobacterium-mediatedtransformationofarabidopsisthaliana,1998,plantj,735-743”公众可从北京市农林科学院获得，以重复本技术实验，不可作为其它用途使用。[0075]下述实施例中的二穗短柄草bd-21记载于非专利文献“hoetal.,chl1functionasanitratesensorinplants,2009，cell：1184-1194”。公众可从北京市农林科学院获得，以重复本技术实验，不可作为其它用途使用。[0076]3、试剂[0077]下述实施案例中，hoagland’s营养液为将kno3、ca(no3)2、mgso4.7h2o、和kh2po4溶于水定容于1l，使得hoagland’s营养液中kno3的浓度为0.51g/l、ca(no3)2的浓度为0.82g/l、mgso4.7h2o的浓度为0.49g/l、kh2po4的浓度为0.136g/l；再加入lmlfeedta溶液；然后加入lmla-z溶液，得到的营养液。所述feedta溶液为将7.45gna2edta、5.57gfeso4.7h2o溶解于200ml蒸馏水中，加热，不断搅拌至na2edta溶液与feso4溶液混合，定容至1l得到的溶液。所述a-z溶液为将h3bo3、cuso4·5h2o、znso4·7h2o、mgcl2·6h2o、hmoo·4h2o溶于水，使得a-z溶液中h3bo3的浓度为2.80mg/l，cuso4·5h2o的浓度为0.08mg/l，znso4·7h2o的浓度为0.22mg/l，mgcl2·6h2o的浓度为81mg/l，hmoo·4h2o的浓度为0.09mg/l，得到的溶液。[0078]下述实施案例中的hoagland’s固体培养基为向hoagland’s营养液中添加固定剂琼脂得到的固体培养基。[0079]下述实施案例中，1/2hoagland’s培养液由溶质和溶剂组成，溶质的种类同hoagland’s营养液，浓度为hoagland’s培养液中溶质的1/2，溶剂为蒸馏水。[0080]下述实施案例中，cim诱导培养基为将ms盐、蔗糖、pvp、cuso4、2,4-d和凝胶溶于水，使得在cim诱导培养基中ms盐的浓度为4.43g/l，蔗糖的浓度为30g/l，pvp的浓度为2g/l，cuso4的浓度为0.6mg/l，2,4-d的浓度为2.5mg/l，凝胶的浓度为3.5g/l，以koh溶液调ph为5.8，121℃、15min高压蒸汽灭菌，得到的培养基。[0081]下述实施例中的定量试验，如无特殊说明，均设置三次重复实验，结果取平均值，*表示显著性分析结果为p＜0.05。[0082]实施例1[0083]材料与方法：[0084]野大麦材料培养：盐生牧草野大麦采自内蒙古盐渍化草原(2006年8月，北京市农林科学院采自于内蒙古呼和浩特郊区，联系方式：北京市海淀区曙光花园中路9号北京市农林科学院李瑞芬15811108560)。[0085]在室温条件下野大麦种子用去离子水浸泡12h后，放入到4℃冰箱中过夜。用灭菌的去离子水冲洗3遍，放于湿润纱布的培养皿中，25℃萌芽。经过4～5天待其大部分发芽之后，转到灭过菌的盛有1/2hoagland’s培养液的玻璃瓶中(玻璃瓶用不透光的纸包住)，在温度22-23℃，光照强度1000-3000μmolm-2s-1，光照时间12h/天的条件下生长，待长到两叶一心时，在1/2hoagland’s培养液中加入350mmnacl进行盐胁迫，设置不加入nacl的1/2hoagland’s培养液作为对照处理。处理后30分钟、1小时、6小时和24小时，在要求的处理时间点取材，用铝薄纸包好标明，立即投入液氮中固定，-80℃保存备用。[0086]野大麦rna提取：取上述350mmo/lnacl胁迫30min后的野大麦幼苗和未进行盐处理的对照幼苗的根为材料，根据trizol(invitrogen，usa)试剂盒说明，提取经盐处理野大麦根及对照材料的总rna，dnasei消化总rna中残留的dna，酚/氯仿/异戊醇混合液(25:24:1)抽提总rna，分光光度计测定od260和od280，根据od260值计算rna的产量；根据od260/od280值判断rna的质量。根据takara公司primescripttmrtmastermix(perfectrealtime)kit说明，将mrna反转录为双链cdna。[0087]对野大麦进行全长转录组测序及转录组基因表达分析：从获得的转录组数据中，分析获得多个潜在的钾离子转运体，并通过全长转录组获得相关基因的全长cdna序列。根据序列信息，设计获得hbrsar1基因全长的引物hbrsar1-f和hbrsar1-r：[0088]hbrsar1-f：5’‑atggttgttgtttcgcagggccag-3’；[0089]hbrsar1-r：5’‑ctaaacgtagtagatcatgccgac-3’。[0090]以野大麦盐根的cdna为模板，以引物hbrsar1-f和hbrsar1-r扩增获得2.3kb的基因全长。在http://www.ch.embnet.org/software/tmpred_form.html网站上利用tmpred软件对hbrsar1进行跨膜域和疏水性分析。[0091]hbrsar1的克隆与序列分析：利用对野大麦进行全长转录组的测序，并通过分析表达信息，获得一个表达量较高的重要钾离子转运体hbrsar1，并根据测序序列设计引物，利用pcr从野大麦根中提取rna进行hbrsar1的cds序列扩增，获得hbrsar1的cds序列(如序列表中序列1所示)。hbrsar1的cds全长2319bp，编码氨基酸序列是序列表中序列2的蛋白质hbrsar。将hbrsar1的氨基酸序列(序列表中序列2)输入网站http://www.cbs.dtu.dk/services/tmhmm/，利用tmhmm软件对蛋白的跨膜区进行预测，结果显示hbrsar1由13个跨膜区组成，在其c端有一段长的氨基酸序列尾巴(见图1)。[0092]hbrsar1的亚细胞定位：以带gfp基因的植物表达载体pcambia1302(cambia公司，货号hg-vzc0325)为出发载体，用hbrsar1的cds序列(如序列表中序列1)替换pcambia1302载体的限制性核酸内切酶ncoi和spei识别位点间的片段(包括ncoi的识别位点和spei识别位点在内的小片段)，保持pcambia1302的其它序列不变，得到表达gfp标记的hbrsar1的重组表达载体，命名为pcambia1302-hbrsar1-gfp。[0093]提取拟南芥col-0野生型叶片的原生质体，将pcambia1302-hbrsar1-gfp质粒转入原生质体中，倒置于confocal显微镜载物台上，20倍物镜下观察原生质体中的绿色荧光，确定hbrsar1的细胞定位。[0094]利用gfp荧光显示的结果见图2的a图，表明hbrsar1主要定位在细胞膜上。[0095]拟南芥中hbrsar1的转基因植株及表型观察：以植物表达载体pcambia1300(cambia公司，货号hg-vzc0323)为出发载体，用核苷酸序列是序列表中序列1的hbrsar1的cds序列基因及其自有启动子(名为hbhak2启动子，记载于申请号为201610015458.3的专利中)的dna分子替换pcambia1300载体的限制性核酸内切酶ecori和hidiii酶识别位点间的片段(包括ecori的识别位点和hidiii识别位点在内的小片段)，保持pcambia1300载体的其它序列不变，得到hbrsar1自身启动子启动的hbrsar1的重组表达载体，命名为pcambia1300-prohbrsar1-hbrsar1。[0096]将构建好的pcambia1300-prohbrsar1-hbrsar1质粒转入农杆菌gv3101中，选择生长了6-8周且健壮的拟南芥col-0野生型植株，侵染拟南芥的开花部位，收集转基因t0代种子在潮霉素抗性板上进行筛选，获得阳性苗即为hbrsar1的转基因植株，共得到10株阳性苗，其中三株分别命名为np:hbrsar1-l1，np:rsar1-l2，np:rsar1-l3，分别收获t1代种子用于表型观察。[0097]将拟南芥转基因植株种植在不同逆境处理的培养基上，对植株的抗逆性进行观察，具体如下：[0098]渗透势试验[0099]以hbrsar1的拟南芥转基因植株np:hbrsar1-l1，np:rsar1-l2为材料，以拟南芥col-0野生型和拟南芥35s:rsar1突变体为对照。[0100]正常条件对照(1/2ms)：以1/2ms固体培养基(生长20天。[0101]200mm甘露醇处理(200mmmannitol)：以1/2ms 200mm甘露醇固体培养基生长20天。1/2ms 200mm甘露醇培养基是向1/2ms中添加甘露醇至甘露醇的含量为200mm得到的液体，然后加入琼脂高温灭菌获得固体培养基。[0102]300mm甘露醇处理(300mmmannitol)：以添加1/2ms 300mm甘露醇固体培养基生长20天。1/2ms 300mm甘露醇培养基是向1/2ms中添加甘露醇至甘露醇的含量为300mm得到的液体，然后加入琼脂高温灭菌获得固体培养基。[0103]结果见图3，可以观察到，高渗透势(甘露醇处理)胁迫下，hbrsar1能够有效通过促进根系的生长，提高了植株的抗逆性。[0104]营养匮乏试验[0105]以hbrsar1的拟南芥转基因植株np:hbrsar1-l1，np:rsar1-l2为材料，以拟南芥col-0野生型为对照。[0106]正常条件对照：以1/2ms固体培养基(由溶质和溶剂组成，溶剂为水，溶质及其浓度为：0.5mmcaso4，0.5mmmgcl2，1μmkh2po4，2.5mmmes(ph＝5.8)，50μmnafeedta，50μmh3bo3，12μmmncl2，1μmcucl2，1μmzncl2，0.03μmnh4moo4，0.5％蔗糖，10mmkno3)生长14天。[0107]无糖处理(nosucrose)：以不含蔗糖的1/2ms固体培养基(由溶质和溶剂组成，溶剂为水，溶质及其浓度为：0.5mmcaso4，0.5mmmgcl2，1μmkh2po4，2.5mmmes(ph＝5.8)，50μmnafeedta，50μmh3bo3，12μmmncl2，1μmcucl2，1μmzncl2，0.03μmnh4moo4，10mmkno3)生长14天。[0108]低氮处理(lowno3-):以no3-含量为1mm的氮营养匮乏的固体培养基(由溶质和溶剂组成，溶剂为水，溶质及其浓度为：0.5mmcaso4，0.5mmmgcl2，1μmkh2po4，2.5mmmes(ph＝5.8)，50μmnafeedta，50μmh3bo3，12μmmncl2，1μmcucl2，1μmzncl2，0.03μmnh4moo4，0.5％蔗糖，1mmkno3)，生长14天。[0109]低氮无糖处理(lowno3-nosucrose):以no3-含量为1mm且不含蔗糖的氮营养匮乏固体培养基(由溶质和溶剂组成，溶剂为水，溶质及其浓度为：0.5mmcaso4，0.5mmmgcl2，1μmkh2po4，2.5mmmes(ph＝5.8)，50μmnafeedta，50μmh3bo3，12μmmncl2，1μmcucl2，1μmzncl2，0.03μmnh4moo4，1mmkno3)生长14天。[0110]结果见图4，营养匮乏(低氮、低糖等)胁迫下，hbrsar1能够有效通过促进根系的生长，提高了植株的抗逆性。[0111]盐处理试验一[0112]以hbrsar1的拟南芥转基因植株np:hbrsar1-l1，np:rsar1-l2，np:rsar1-l3为材料，以拟南芥col-0野生型为对照。[0113]正常条件(对照)：以1/2ms固体培养基生长3周。[0114]75mmnacl处理：以1/2ms 75mmnacl的固体培养基生长3周。1/2ms 75mmnacl的固体培养基是以1/2ms为基础培养基，向该基础培养基中添加nacl至nacl的含量为75mm得到的培养基。[0115]125mmnacl处理：以1/2ms 125mmnacl的固体培养基生长3周。1/2ms 125mmnacl的固体培养基是以1/2ms为基础培养基，向该基础培养基中添加nacl至nacl的含量为125mm得到的培养基。[0116]结果见图5，表明hbrsar1的转基因植株明显提高了拟南芥的耐盐性，尤其在高盐(125mmnacl)条件下，hbrsar1转基因植株(np:hbrsar1-l1、np:rsar1-l2和np:rsar1-l3)仍能保持生长。[0117]盐处理试验二[0118]以hbrsar1的拟南芥转基因植株np:hbrsar1-l1，np:rsar1-l2为材料，以拟南芥col-0野生型和拟南芥35s:rsar1突变体为对照。[0119]正常条件(对照)：以1/2ms固体培养基生长30天。[0120]100mmnacl处理：以1/2ms 100mmnacl的固体培养基生长30天。1/2ms 100mmnacl的固体培养基是以1/2ms为基础培养基，向该基础培养基中添加nacl至nacl的含量为100mm得到的培养基。[0121]于生长15天时对100mmnacl处理的植株及对照的植株进行拍照，并统计主根长度、侧根数量和侧根长度；于生长30天时再次拍照。[0122]结果见图6，可以观察到，在高盐(100mmnacl)胁迫下，hbrsar1能够有效通过促进根系的生长，提高了植株的抗逆性。[0123]盐处理试验三[0124]以hbrsar1的拟南芥转基因植株np:hbrsar1-l1，np:rsar1-l2为材料，以拟南芥col-0野生型和拟南芥35s:rsar1突变体为对照。[0125]正常条件(对照)：以1/2ms固体培养基生长5天。[0126]75mmnacl处理：以1/2ms 75mmnacl的固体培养基生长5天。1/2ms 75mmnacl的固体培养基是以1/2ms为基础培养基，向该基础培养基中添加nacl至nacl的含量为75mm得到的培养基。[0127]100mmnacl处理：以1/2ms 100mmnacl的固体培养基生长5天。1/2ms 100mmnacl的固体培养基是以1/2ms为基础培养基，向该基础培养基中添加nacl至nacl的含量为100mm得到的培养基。[0128]对hbrsar1的转基因植株进行根毛表型的观察，结果见图7，可以看出：在盐胁迫下，拟南芥col-0野生型的根毛生长明显受到抑制，hbrsar1能够增加盐胁迫下根毛的生长，包括数量和长度(图7的a)，图7的b是对数量和长度的统计。从以上所有数据可以看出，hbrsar1促进盐胁迫下侧根和根毛的生长发育，增加了植物根系的生物量，同时也促进了地上部分的生长，提高了植物的耐盐性。[0129]hbrsar1对盐胁迫下拟南芥根钾吸收的影响：以hbrsar1的转基因植株np:hbrsar1-l1，np:rsar1-l2为材料，以拟南芥col-0野生型为对照。通过非损伤技术(nmt)对拟南芥hbrsar1转基因植株和野生型进行钾离子流动的测定，取ms板上生长了5天的植株进行正常条件下的测定，再将它们在100mmnacl(1/2ms 100mmnacl的营养液)中处理1小时后进行钾离子流(参考文献“lir,zhangj,wug,wangh,cheny,weij.hbcipk2,anovelcbl-interactingproteinkinasefromhalophytehordeumbrevisubulatum,conferssaltandosmoticstresstolerance.plantcellenviron.35:1582-600.”)的测定。[0130]实验结果见图8，表明在正常条件下，拟南芥col-0野生型和hbrsar1转基因植株(np:hbrsar1-l1，np:rsar1-l2)钾离子流动都在0附近，但在盐处理时，拟南芥col-0野生型表现为钾的外流，而转基因植株则表现为钾的内流。因此，hbrsar1促进了拟南芥植株盐胁迫下根系对钾的吸收，提高了盐胁迫下钾的利用。[0131]二穗短柄草中hbrsar1的转基因植株及表型观察：禾本科单子叶模式植物二穗短柄草bd-21的成熟胚剥去内外稃后，置于cim诱导培养基上，诱导3-4周，出愈后，取鲜黄色胚性愈伤置于新的cim诱导培养基上活化愈伤1-2周后，进行农杆菌转化。将转有pcambia1300-prohbrsar1-hbrsar1质粒的农杆菌gv3101侵染诱导好的愈伤组织，将愈伤组织块转移至含有150mg/l特美汀和30mg/l潮霉素的cim培养基，在22℃黑暗中孵育2周，进行进一步筛选。将再生出的二穗短柄草幼苗移至含有150mg/l特美汀和30mg/l潮霉素的生根培养基中进行生根，生根后的幼苗移至不含抗性的生根培养基中继续生长，将阳性苗移到土中进行生长，共得到6株阳性苗，其中两株分别命名为np:hbrsar1-l1，np:rsar1-l2，分别收获t1代种子用于表型观察。[0132]盐处理试验一[0133]以hbrsar1的二穗短柄草转基因植株np:hbrsar1-l1，np:rsar1-l2为材料，以二穗短柄草bd-21野生型为对照。[0134]正常条件(对照)：以hoagland’s营养液水培生长14天。[0135]75mmnacl处理：将在正常条件下生长了7天的植株移到75mmnacl处理条件下(hoagland’s 75mmnacl的营养液水培)继续生长7天。hoagland’s 75mmnacl的营养液是以hoagland’s营养液为基础营养液，向该基础营养液中添加nacl至nacl的含量为75mm得到的营养液。[0136]每处理每组苗为5棵。[0137]在正常条件下，野生型bd-21和hbrsar1转基因植株(np:hbrsar1-l1，np:rsar1-l2)生长类似，但在75mmnacl处理7天后，转基因植株根系生长发达，包括根的数量明显多于野生型(见图9的a、图9的b、图9的c)。在盐胁迫下，hbrsar1转基因植株的鲜重也明显高于野生型(见图9的d)，同时，对相应植株进行钾离子浓度的检测，发现盐胁迫下hbrsar1的转入有效提高了植株对钾离子的吸收，提高了植株钾离子的含量(见图9的e)。[0138]盐处理试验二[0139]以hbrsar1的二穗短柄草转基因植株np:hbrsar1-l1，np:rsar1-l2为材料，以二穗短柄草bd-21野生型为对照。[0140]正常条件(对照)：以hoagland’s固体培养基生长7天。[0141]150mmnacl处理：以hoagland’s 150mmnacl的固体培养基生长7天。[0142]hoagland’s 150mmnacl的固体培养基是以hoagland’s固体培养基为基础培养基，向该基础培养基中添加nacl至nacl的含量为150mm得到的培养基。[0143]在正常条件下，野生型bd-21和hbrsar1转基因植株(np:hbrsar1-l1，np:rsar1-l2)的根毛生长类似，但在150mmnacl处理条件下，转基因植株根毛生长发达，包括数量和根毛长度(见图10)。[0144]以上结果表明将hbrsar1转入禾本科单子叶模式植物二穗短柄草bd-21中，转基因植株表现出与拟南芥相似的表型。[0145]酵母功能互补及iaa流动分析：以用于酵母转化的载体p424为出发载体，用hbrsar1的cds序列替换p424载体的限制性核酸内切酶hindiii和ecori识别位点间的片段(包括hindiii的识别位点和ecori识别位点在内的小片段)，保持p424载体的其它序列不变，得到用于酵母转化的hbrsar1的重组表达载体，命名为p424-hbrsar1。[0146]按照标准酵母转化方法，将p424-hbrsar1转入钾离子转运缺陷型酵母cy162中，在trp氨基酸缺陷型酵母培养基上筛选阳性克隆。每个含有目标基因质粒的阳性转化子平板中均挑取3个1mm大小的单克隆，转接到新的相应的氨基酸缺陷型酵母培养基上，30℃恒温培养箱中倒置培养2天左右。挑取适量活化好的每个菌落溶到一定体积的ddh2o中，混匀，调菌液浓度一致，按10倍关系进行梯度稀释三次，即100、10-1、10-2、10-3。按每个菌斑8μl菌液量，依次吸取各稀释度的菌液点在含不同钾离子浓度(0mm、1mm、3mm、5mm、10mm)的相应氨基酸缺陷型ap-trp培养基上；晾干菌液，于30℃恒温培养箱倒置培养3～5天，观察酵母菌斑生长情况。设置转p424载体的酵母株系作为阴性对照。利用非损伤仪器设备对生长的菌斑进行iaa生长流的测定，确定hbrsar1对iaa流动的改变和调控。[0147]实验结果如图11所示：在5mm和10mm钾的条件下，较空载体转运菌株，hbrsar1的转化菌株在第三个稀释梯度(10-2)和第四个稀释梯度(10-3)生长较好(图11的a)，进一步证明了hbrsar1对钾离子的转运功能。在非损伤的测试中(图11的b)，可以看到hbrsar1能够改变iaa的流动性，表型了介导了iaa的外流，尤其在低浓度钾(1mm和5mm钾)时更为突出。[0148]这些结果说明本发明在盐生植物野大麦盐胁迫下的转录组分析时筛选出的钾离子转运体新基因hbrsar1主要在根中表达，尤其在根毛、侧根发生点等组织强烈表达，并能够被高盐诱导。hbrsar1定位在细胞膜上，在酵母突变株cy162和拟南芥的转基因植株中表现出强的钾吸收能力，同时促进多种胁迫下植物根系的生长发育，包括根毛的伸长和侧根的生长。通过转基因，hbrsar1在禾本科植物而穗短柄草中表现出同样的促进根系生长发育的现象，同时能够有效提高植物在盐胁迫下对钾的吸收。利用细胞生物学、分子生物学等技术手段发现hbrsar1是通过植物激素iaa的信号通路调控植物根系构型的。[0149]以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本技术欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本技术中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。[0150]参考文献[0151][1]almeidadm,oliveiramm,saibonjm.(2017)regulationofna andk homeostasisinplants:towardsimprovedsaltstresstoleranceincropplants.genet.mol.biol.40:326–345.[0152][2]atkinsonja,rasmussena,trainir,vossu,sturrockc,mooneysj.(2014)branchingoutinroots:uncoveringform,function,andregulation.plantphysiol.166:538-550.[0153][3]osmontks,siboutr,hardtkecs.(2007)hiddenbranches:developmentsinrootsystemarchitecture.annurevplantbiol.58:93-113.[0154][4]duy,scheresb.(2018)lateralrootformationandthemultiplerolesofauxin.jexpbot.69:155-167.[0155][5]pottersg,pasternaktp,guisezy,palmekj,jansenma.(2007)stress-inducedmorphogenicresponses:growingoutoftrouble？trendsplantsci.12:98-105.[0156][6]julkowskamm,hoefsloothc,mols,feronr,deboergj,haringma,testerinkc.(2014)capturingarabidopsisrootarchitecturedynamicswithroot-fitrevealsdiversityinresponsestosalinity.plantphysiol.166:1387-402.[0157][7]sunf,zhangw,huh,lib,wangy,zhaoy,lik,lium,lix.(2008)saltmodulatesgravitysignalingpathwaytoregulategrowthdirectionofprimaryrootsinarabidopsis.plantphysiol.146:178-88.[0158][8]motteh,vannestes,beeckmant.(2019)molecularandenvironmentalregulationofrootdevelopment.annurevplantbiol.70:465-488.[0159][9]benitob,haror,amtmanna,cuinta,dreyeri.(2014)thetwinsk andna inplants.j.plantphysiol.171:723-31.[0160][10]alemanf,nieves-cordonesm,martinezv,rubiof.(2009)differentialregulationofthehak5genesencodingthehigh-affinityk transportersofthellungiellahalophilaandarabidopsisthaliana.environ.exp.bot.65:263–269.[0161][11]cheng,huq,luol,yangt,zhangs,huy,etal.(2015)ricepotassiumtransporteroshak1isessentialformaintainingpotassium-mediatedgrowthandfunctionsinsalttoleranceoverlowandhighpotassiumconcentrationranges.plantcellenviron.38:2747–2765.[0162][12]oomenrjfj,benitob,sentenach,rodríguez-navarroa,talónm,vérya-a,etal.(2012)hkt2；2/1,ak -permeabletransporteridentifiedinasalt-tolerantricecultivarthroughsurveysof[0163]naturalgeneticpolymorphism.plantj71:750–62.[0164][13]sheny,shenl,shenz,jingw,geh,zhaoj,etal.(2015)thepotassiumtransporteroshak21functionsinthemaintenanceofionhomeostasisandtolerancetosaltstressinrice.plantcellenviron.38:2766–2779.[0165][14]rigass,ditengoufa,ljungk,darasg,tietzo,palmek,hatzopoulosp.(2013)rootgravitropismandroothairdevelopmentconstitutecoupleddevelopmentalresponsesregulatedbyauxinhomeostasisinthearabidopsisrootapex.newphytol.197:1130-1141.[0166][15]yangt,fengh,zhangs,xiaoh,huq,etal.(2020)thepotassiumtransporteroshak5altersricearchitectureviaatp-dependenttransmembraneauxinfluxes.plantcommun.1:100052.[0167][16]lir,zhangj,wug,wangh,cheny,weij.hbcipk2,anovelcbl-interactingproteinkinasefromhalophytehordeumbrevisubulatum,conferssaltandosmoticstresstolerance.plantcellenviron.35:1582-600.[0168][17]mumbergd,müllerr,funkm.regulatablepromotersofsaccharomycescerevisiae:comparisonoftranscriptionalactivityandtheiruseforheterologousexpression.nucleicacidsres.22:5767-5768.当前第1页12当前第1页12
再多了解一些
本文用于企业家、创业者技术爱好者查询，结果仅供参考。
