一种儿童过敏性相关的152个基因位点基因分型的检测方法与流程

1.本发明涉及基因分型技术领域技术领域，具体涉及一种儿童过敏性相关的 152个基因位点基因分型的检测方法。


背景技术：

2.过敏原是一种外来蛋白或半抗原，能够诱导特异性ige抗体产生并引发过 敏反应。大部分过敏原蛋白都可以被敏感个体识别并引发过敏反应。过敏原中 不是所有的蛋白都具有过敏原性，这与个体遗传易感性、过敏原的复杂性有关， 过敏原和ige的相互作用是过敏反应性疾病的发病基础。大多数的过敏原是由 蛋白质组成的，这些蛋白质样的过敏原具有与普通抗原相同的特性即刺激机体 产生免疫球蛋白。同时这些过敏原又因其特殊的生化和理化特性使敏感个体产 生过激的免疫反应，即过敏反应。大量的外源性因素，使得免疫系统通过改变 宿主防御机制识别这些蛋白。这些因素包括：遗传因素、工业污染物、吸烟、 病毒感染等。
3.过敏原的分类：一、气传过敏原：花粉、真菌、尘螨、动物性过敏原；二、 口服过敏原：食物和药物；三、注入性过敏原：大多是通过昆虫蜇咬引起的， 也可由于注射性药物引起。
4.儿童过敏症是指有特异体质的孩子，在接触过敏原以后所出现的一系列的 临床表现，其中最严重的就是过敏性休克。儿童过敏症的起病、表现和过程不 一，与遗传信息、过敏原强度、患儿的健康状态等相关。基因因素直接决定人 群是否具有过敏特应性，环境因素、生活方式则会影响过敏反应甚至过敏性疾 病的发生、症状的强弱等。目前，中国儿童过敏反应常见，且过敏性疾病患病 率呈现逐年上升的趋势。大量流行病学研究证实了婴儿或儿童早期出现的某种 过敏反应症状常预示未来其他过敏性疾病的发生：首先表现为婴儿湿疹或食物 过敏反应症状，继之发展为过敏性鼻炎及哮喘等。临床上，常见的过敏原检测 多为皮试，部分过敏原可进行血液ige含量的检测。但是，这些检测通常是在 患者表现出严重过敏反应后进行的，这严重影响了孩子的生命健康。尤其是对 于难以明确表述自己症状的婴幼儿来说，过敏反应造成的影响更是惨重的。因 此，尽早预测和预防过敏性疾病的发生是减轻过敏反应对孩子生命健康影响的 有效途径。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于提供一种儿童过敏性相关的152个基因位点基因分型 的检测方法，该检测方法能够在同一体系中实现对儿童过敏性相关的152个基 因位点同时扩增，进而能够实现对过敏性相关152个基因位点的检测，有利于 尽早预测和预防过敏性疾病的发生。
6.为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：
7.本发明第一方面提供一种儿童过敏性相关的152个基因位点基因分型的 检测方法，包括如下步骤：
8.(a)收集检测对象唾液或口腔拭子，并提取dna；
9.(b)以得到的dna为模板对152个基因位点进行pcr扩增，并对扩增 后的产物进行磁珠纯化，其中，所述152个基因位点分为两组分别进行pcr 扩增，第一组为85个基因位点：rs7936434、rs1500963、rs511898、rs2054517、 rs10062446、rs631208、rs7179742、rs267759、rs4271002、rs10494133、rs1125642、 rs17513503、rs2503222、rs6069674、rs1946518、rs3818822、rs12135788、 rs7551789、rs917650、rs6498482、rs16823014、rs528557、rs1042151、rs3856806、 rs56151068、rs11740584、rs290992、rs1243064、rs4251481、rs4310804、rs4950928、 rs1898671、rs6131034、rs9833094、rs2700521、rs3794262、rs17737064、rs7862221、 rs10483907、rs12123821、rs16851030、rs17616434、rs5961136、rs1929992、rs139462954、rs1938821、rs7192、rs17565502、rs4251559、rs1353577、rs12143400、 rs9323624、rs16950131、rs17388568、rs10492737、rs10018666、rs8011069、 rs7717393、rs2065746、rs10492736、rs12437556、rs2280089、rs1715794、 rs6733160、rs11652573、rs1042136、rs1461567、rs73118440、rs11717893、 rs3024492、rs28359885、rs10889502、rs3860069、rs6673480、rs1800469、 rs6554809、rs12774458、rs1544623、rs17330462、rs9273440、rs1800925、 rs4516432、rs880633、rs12330531、rs12873765；
10.第二组为67个基因位点：rs3097671、rs12028467、rs163550、rs11949166、 rs11079339、rs334807、rs7572857、rs1853232、rs6474695、rs324015、rs4054760、 rs73908987、rs1335464、rs499368、rs557881、rs2367563、rs11610328、rs2155219、 rs7775228、rs7475217、rs2076530、rs12746200、rs730012、rs12158991、rs1391351、 rs7017801、rs9275596、rs1131882、rs3130100、rs114892859、rs1325195、 rs7851969、rs10492734、rs10809464、rs4928089、rs74995702、rs11819745、 rs2243250、rs10507385、rs890448、rs9406426、rs72827854、rs2070874、rs761142、 rs250585、rs17156347、rs12584136、rs144897250、rs2069772、rs6665683、 rs10956253、rs1059288、rs7617456、rs1800896、rs2280090、rs3024496、rs3129294、 rs2280091、rs1116931、rs7789045、rs10492735、rs2071888、rs4662366、rs1335467、 rs1059513、rs4291、rs4292；
11.所述第一组基因位点依次对应的上游扩增引物序列如seq id no：1～85 所示，下游扩增引物序列如seq id no：86～170所示；
12.所述第二组基因位点依次对应的上游扩增引物序列如seq id no： 171～237所示，下游扩增引物序列如seq id no：238～304所示；
13.(c)对纯化产物进行索引序列的连接，再次磁珠纯化，得到pcr文库；
14.(d)对pcr文库进行基因测序，根据测序结果得到儿童过敏性相关的 152个基因位点的基因分型结果。
15.优选地，所述pcr扩增的体系中152个基因位点对应的扩增引物的工作 浓度分别为0.05-0.40μm。
16.优选地，所述pcr扩增的体系中还包括dna聚合酶预混液和pcr增强 剂。
17.优选地，所述第一组基因位点的pcr扩增程序如下：
18.heat lid 150℃，95℃for 3min 30s，(98℃for 20s，58℃for 4min)
×ꢀ
18cycles，72℃for 5min。
19.优选地，所述第二组基因位点的pcr扩增程序如下：
20.heat lid 150℃，95℃for 3min 30s，(98℃for 20s，60℃for 4min)
×ꢀ
18cycles，72℃for 5min。
21.优选地，所述磁珠纯化采用的磁珠为ampure xp磁珠。
22.优选地，所述索引序列包括igt-15index和igt-17index。
23.与现有技术相比，本发明的有益效果至少包括：
24.本发明检测方法能够在同一体系中针对同一个体的152个基因位点进行 扩增，进而能够实现对过敏性相关152个基因位点的检测，有利于尽早预测和 预防过敏性疾病的发生；上述152个基因位点涵盖气传、口服和注入性三大类 过敏原以及常见过敏性疾病，进而能够从生物学的角度综合评估儿童的过敏遗 传情况，帮助家长了解孩子的过敏风险，指导科学、有效降低儿童的严重过敏 发生，并为儿童过敏原的早发现、早干预、早治疗；此外，本发明检测方法操 作简单，时间短，效率高。
25.本发明检测方法中采用两轮pcr反应进行文库构建，具有文库构建周期 短，比对率高，捕获率高，均一性好，重复性好，操作简便等优点。
附图说明
26.为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将 对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。在所有附 图中，类似的元件或部分一般由类似的附图标记标识。附图中，各元件或部分 并不一定按照实际的比例绘制。
27.图1为本发明实施例中测序得到的碱基比例分布图；
28.图2为本发明实施例中测序得到的插入片段大小分布图；
29.图3为本发明实施例中测序得到的深度积累分布图；
30.图4为本发明实施例中测序得到的深度分布图；
31.图5为本发明实施例中测序得到的单区间深度分布图。
具体实施方式
32.下面将结合实施例对本发明技术方案的实施例进行详细的描述。以下实施 例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案，因此只作为示例，而不能以此来 限制本发明的保护范围。
33.需要注意的是，除非另有说明，本技术使用的技术术语或者科学术语应当 为本发明所属领域技术人员所理解的通常意义。
34.本发明实施例提供一种儿童过敏性相关的152个基因位点基因分型的检 测方法，包括如下步骤：
35.(a)收集检测对象唾液或口腔拭子，并提取dna；
36.(b)以得到的dna为模板对152个基因位点进行pcr扩增，并对扩增 后的产物进行磁珠纯化，其中，所述152个基因位点分为两组分别进行pcr 扩增，第一组为85个基因位点：rs7936434、rs1500963、rs511898、rs2054517、 rs10062446、rs631208、rs7179742、rs267759、rs4271002、rs10494133、rs1125642、 rs17513503、rs2503222、rs6069674、
rs1946518、rs3818822、rs12135788、 rs7551789、rs917650、rs6498482、rs16823014、rs528557、rs1042151、rs3856806、 rs56151068、rs11740584、rs290992、rs1243064、rs4251481、rs4310804、rs4950928、 rs1898671、rs6131034、rs9833094、rs2700521、rs3794262、rs17737064、rs7862221、 rs10483907、rs12123821、rs16851030、rs17616434、rs5961136、rs1929992、 rs139462954、rs1938821、rs7192、rs17565502、rs4251559、rs1353577、rs12143400、rs9323624、rs16950131、rs17388568、rs10492737、rs10018666、rs8011069、 rs7717393、rs2065746、rs10492736、rs12437556、rs2280089、rs1715794、 rs6733160、rs11652573、rs1042136、rs1461567、rs73118440、rs11717893、 rs3024492、rs28359885、rs10889502、rs3860069、rs6673480、rs1800469、 rs6554809、rs12774458、rs1544623、rs17330462、rs9273440、rs1800925、 rs4516432、rs880633、rs12330531、rs12873765；
37.第二组为67个基因位点：rs3097671、rs12028467、rs163550、rs11949166、 rs11079339、rs334807、rs7572857、rs1853232、rs6474695、rs324015、rs4054760、 rs73908987、rs1335464、rs499368、rs557881、rs2367563、rs11610328、rs2155219、 rs7775228、rs7475217、rs2076530、rs12746200、rs730012、rs12158991、rs1391351、 rs7017801、rs9275596、rs1131882、rs3130100、rs114892859、rs1325195、 rs7851969、rs10492734、rs10809464、rs4928089、rs74995702、rs11819745、 rs2243250、rs10507385、rs890448、rs9406426、rs72827854、rs2070874、rs761142、 rs250585、rs17156347、rs12584136、rs144897250、rs2069772、rs6665683、 rs10956253、rs1059288、rs7617456、rs1800896、rs2280090、rs3024496、rs3129294、 rs2280091、rs1116931、rs7789045、rs10492735、rs2071888、rs4662366、rs1335467、 rs1059513、rs4291、rs4292；
38.第一组基因位点依次对应的上游扩增引物序列如seq id no：1～85所示， 下游扩增引物序列如seq id no：86～170所示；
39.第二组基因位点依次对应的上游扩增引物序列如seq id no：171～237所 示，下游扩增引物序列如seq id no：238～304所示；
40.具体地，各基因位点对应的引物序列如下表所示；
41.42.43.44.45.[0046][0047]
(c)对纯化产物进行索引序列的连接，再次磁珠纯化，得到pcr文库；
[0048]
(d)对pcr文库进行基因测序，根据测序结果得到儿童过敏性相关的 152个基因位点的基因分型结果。
[0049]
在一实施方式中，上述152个基因位点对应的扩增引物的工作浓度分别为 0.05-0.40μm；例如，具体可以为0.05μm、0.10μm、0.20μm或0.40μm。
[0050]
进一步地，在pcr扩增的体系中还包括dna聚合酶预混液和pcr增强 剂。
[0051]
在一实施方式中，第一组基因位点的pcr扩增程序如下：
[0052]
heat lid 150℃，95℃for 3min 30s，(98℃for 20s，58℃for 4min)
×ꢀ
18cycles，72℃for 5min。
[0053]
第二组基因位点的pcr扩增程序如下：
[0054]
heat lid 150℃，95℃for 3min 30s，(98℃for 20s，60℃for 4min)
×ꢀ
18cycles，72℃for 5min。
[0055]
进一步地，磁珠纯化采用的磁珠为ampure xp磁珠；索引序列包括 igt-15index(通用序列为aatg atacggcg accaccgagatct，seq idno：305)和igt-17index(通用序列为caagcagaagacggcatacgagat， seq id no：306)。
[0056]
以下通过具体的实施例对本发明的技术方案作进一步详细说明。
[0057]
实施例
[0058]
本实施例为一种儿童过敏性相关的152个基因位点基因分型的检测方法， 该检测方法包括如下步骤：
[0059]
(a)收集检测对象唾液，并提取dna：
[0060]
采集检测对象唾液，向唾液样品中加入提取缓冲溶液，该提取缓冲溶反复 吹打混匀后，8000
×
g离心5min，弃去上清，此步骤重复一次；得到的沉淀中 加裂解液和蛋白酶k，彻底悬浮沉淀并充分混匀后，室温放置30min，期间来 回颠倒离心管数次；得到的混合液中，加入浓度为10mg/ml rna酶的水溶液 10ul，37℃下静置10min；得到的上清液中，加入等体积苯酚-氯仿混合溶液， 苯酚和氯仿体积比为1.0，充分混匀，混合液4℃，12000
×
g离心5min，上清 液移入干净离心管内；加入等体积苯氛-氯仿-异戊醇混合溶液，苯酚、氯仿和 异戊醇体积比为25:24:1，充分混匀后，4℃，12000
×
g离心5min，上清液移 入干净离心管内；加入等体积氯仿-异戊醇混合溶液，充分混匀后，3-5℃， 12000
×
g离心5min，上清液移入干净离心管内；加入0.6倍体积的冰浴异丙 醇溶液及0.10倍的3.0mol/l醋酸钠溶液，-20℃静置60min，4℃，12000
×
g 离心10min，弃上清液；得到的沉淀物中加入0.5ml 70％乙醇
清洗沉淀物， 4℃，12000
×
g离心5min，弃上清液，此步骤重复一次；得到的沉淀物自然风 干，加入20μl无菌超纯水回溶，-20℃保存备用；
[0061]
(b)对得到的dna进行pcr扩增，并对扩增后的产物进行磁珠纯化：
[0062]
pcr反应分为2个反应管，使用的多重引物分别为primer pool t1(即 第一组基因位点对应的扩增引物)，primer pool t2(即第二组基因位点对应的 扩增引物)；2个反应管内的其他试剂相同，液体配备如下表1所示：
[0063]
表1
[0064][0065][0066]
gdna为步骤(a)中提取得到的dna；
[0067]
pcr反应条件如下：
[0068]
t1管运行pcr仪程序：
[0069]
heat lid 150℃，95℃for 3min 30s，(98℃for 20s，58℃for 4min)
×
18cycles， 72℃for 5min；
[0070]
t2管运行pcr仪程序：
[0071]
heat lid 150℃，95℃for 3min 30s，(98℃for 20s，60℃for 4min)
×
18cycles， 72℃for 5min；
[0072]
将上述t1管和t2管pcr反应产物进行合并；
[0073]
磁珠纯化上述合并产物，具体如下：
[0074]
1)向30μl pcr合并产物加入27μl室温平衡后的ampure xp磁珠，用 移液器轻缓吸打混匀20次；
[0075]
2)室温孵育5min后，将pcr管置于dynamag-96side磁力架上3 min；
[0076]
3)彻底移除上清，将pcr管从磁力架取下，向管内加入50μl yf buffer b 用移液器轻缓吸打混匀20次；
[0077]
4)室温孵育5min后，将pcr管置于dynamag-96side磁力架上3min；
[0078]
5)移除上清，pcr管继续放置在磁力架上，向管内加入180μl 80％乙醇 溶液，静置30s；
[0079]
6)移除上清，pcr管继续放置在磁力架上，向管内加入180μl 80％乙醇 溶液，静置30s后彻底移除上清(建议使用10μl移液器移除底部残留乙醇 溶液)；
[0080]
7)室温静置3min，使残留乙醇彻底挥发；
[0081]
8)将pcr管从磁力架取下，加入24μl nuclease-free water，移液器轻轻 吸打重悬磁珠，避免产生气泡，室温静置2min；
[0082]
9)将pcr管重新置于磁力架上，静置3min；
[0083]
10)用移液器吸取18μl上清液，转移到新的200μl pcr管内，管内上 清液为合并后的多重pcr产物；
[0084]
(c)对磁珠纯化产物进行索引序列的连接，再次磁珠纯化，得到pcr文 库；
[0085]
对磁珠纯化产物进行索引序列的连接的反应体系如表2所示：
[0086]
表2
[0087]
reagentvolume(μl)pcr product mixture
[1]
18igt-15 index(10μm)1igt-17 index(10μm)1igt-em808 polymerase mixture10
[0088]
注：[1]pcr product mixture为上一步纯化后的多重pcr产物
[0089]
反应条件如下：
[0090]
运行pcr仪程序：
[0091][0092]
第2轮磁珠纯化：
[0093]
步骤1)-9)同上述步骤(b)中磁珠纯化方法；
[0094]
10)用移液器吸取20μl上清液，转移到新的pcr管中，管中上清为制备 好的多重pcr文库；文库定量及质量检测；
[0095]
(d)使用illumina二代测序仪，按照测序常规步骤操作对pcr文库进行 基因测序，根据测序结果得到儿童过敏性相关的152个基因位点的基因分型结 果；
[0096]
测序的碱基比例分布图如图1所示，插入片段大小分布图如图2所示，深 度积累分布图如图3所示，深度分布图如图4所示，单区间深度分布图如图5 所示；
[0097]
图1在多重pcr技术中，由于技术特性的原因，四种碱基的分布呈不均 衡的状态。
[0098]
图2插入片段反应文库的大小分布，一般波峰在150-250bp之间；
[0099]
图3目标区域不同测序深度(均一化处理，平均深度为1)的累积占比，比如 深度为0.2时坐标为90，代表90％的目标区域测序深度大于等于平均深度的 20％；
[0100]
图4目标区域不同测序深度(均一化处理，平均深度为1)的占比，比如深度 为1时纵坐标为0.5，代表0.5％的目标区域测序深度等于该样本平均深度，该 图一般在平均深度周围成泊松分布；
[0101]
图5中横坐标为每个区间编号，纵坐标为该区间的深度(经过排序及均一 化处理，平均深度值为0)。将每个连续区间的平均深度进行均一化后，可以从 另一个角度观察均一性的好坏。
[0102]
上述结果表明测序结果的均一性较好。
[0103]
测序数据质量评估，对比对率、覆盖率、捕获率等指标进行统计，评估建 库测序是
否达到了标准，符合标准则进行后续分析；其中，评估结果为比对率 为99.10％，覆盖率为99.21％，捕获率为98.94％。
[0104]
本发明可以根据基因位点对过敏性疾病进行预测：
[0105]
比如，特应性皮炎是一种慢性、复发性、炎症性皮肤病，主要表现为剧烈 的瘙痒、明显的湿疹样变和皮肤干燥。除了常见的皮肤表现外，约30％的患者 伴发哮喘，另有约35％的患者伴发过敏性鼻炎。目前多认为免疫异常，特别是 th1/th2失衡是特应性皮炎的发病原因之。环境因素在特应性皮炎的发病过 程中也起着重要的作。气候同环境干燥可以影响特应性皮炎的发病；各种变 态反应原进攻人体，造成人体致敏，引起皮肤过敏性炎症反应，导致特应性皮 炎发病。
[0106]
当kif3a基因rs2897442位点为t/t或c/t，不会增高特应性皮炎的患病 风险，为未见突变基因型；
[0107]
当kif3a基因rs2897442位点为c/c，会增高特应性皮炎的患病风险，为 低风险基因型。
[0108]
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其 限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术 人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者 对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相 应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围，其均应涵盖在本发明 的权利要求和说明书的范围当中。