方法、用途和组合物与流程

1.本发明涉及转导颗粒比如噬菌体的产生以及包含所述颗粒的组合物及其用途。所述颗粒特别地可用于将毒性有效载荷递送到靶细菌中以发挥抗菌作用。本发明还可用于产生野生型(“天然”)噬菌体和包含不同类型噬菌体的噬菌体混合物。实施方案使得能够产生用于医疗、环境或食品生产环境的这种颗粒的组合物。
2.背景使用辅助噬菌体将噬菌粒dna包装成噬菌体病毒颗粒为已知的。一个实例为m13ko7辅助噬菌体，一种用于大肠杆菌宿主细胞的m13的衍生物。其他实例为r408和cm13。
3.细菌噬菌体(噬菌体)为感染细菌的病毒门，并且不同于动物和植物病毒。噬菌体可具有“溶菌性”生命周期、可潜在地变成溶菌性的“溶原性”生命周期或“非溶菌性”生命周期。通过溶菌性周期复制的噬菌体导致宿主靶细菌细胞的溶解，作为其生命周期的正常部分。通过溶原性周期复制的噬菌体称为温和噬菌体。其可通过溶菌性生命周期进行复制并导致宿主细菌的溶解，或者它们可将其dna掺入到宿主细菌dna中并变成非感染性原噬菌体。噬菌体为仅在其特定细菌宿主内感染和繁殖的细菌病毒。通常在菌株水平、物种水平或更罕见地在属水平上发现宿主特异性。这种特异性使得能够使用噬菌体定向靶向危险细菌。除几种罕见情况外在所有情况下，噬菌体吸附到宿主细胞上为感染过程开始的必要条件。
4.噬菌体感染和杀死细菌的自然能力以及噬菌体
‑
细菌相互作用的特异性，为建立噬菌体疗法概念所基于的基本现象。因此，具有溶菌性生命周期的噬菌体为噬菌体疗法的合适候选者。作为一种用于生物控制不需要的病原体、提高尤其新鲜和即食食品的安全性的新方法，噬菌体在食品生产中的使用最近已成为食品工业的一种选择。
5.pct/ep2018/082053和ussn 15/985,658公开了非复制性转导颗粒的产生。pct/ep2018/071454公开了转导颗粒传播的方法。
6.国际专利申请号wo 00/69269公开了使用某些噬菌体菌株用于治疗由屎肠球菌(enterococcus faecium)的万古霉素敏感性以及抗性菌株引起的感染，和国际专利申请号wo 01/93904公开了单独或与其他抗微生物手段组合的噬菌体用于预防或治疗与梭菌属(clostridium)的物种相关的胃肠疾病的用途。
7.美国专利申请号2001/0026795描述了用于产生经修饰以延迟被宿主防御系统灭活，从而增加噬菌体有效杀死细菌的时间段的噬菌体的方法。
8.美国专利申请号2002/0001590公开了使用噬菌体疗法来对抗多重耐药细菌，特别是耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(methicillin
‑
resistant staphylococcus aureus)，和国际专利申请号wo 02/07742公开了具有多个宿主范围的噬菌体的开发。
9.使用噬菌体疗法用于治疗特定的细菌感染性疾病公开于例如美国专利申请号2002/0044922、2002/0058027和国际专利申请号wo 01/93904中。
10.us20160333348描述了使用噬菌体作为载体递送至宿主靶细菌细胞的crispr/cas系统的用途。
11.用于治疗用途的噬菌体组合物的商业规模生产仍然有限。在当前的技术中，噬菌体组合物的滴度低，在实验室规模上通常在109‑
10
11 pfu/ml的范围内，和在商业规模上在107‑
109的范围内，而噬菌体疗法一般地需要的滴度为10
12 pfu/ml。另外，为了达到期需的滴度，需要非常大体积的液体。
12.随着转导颗粒(例如噬菌体)在工业和医疗环境中使用的增加，需要商业数量的这种颗粒。因此，需要一种提供良好的产量滴度和/或减少制造体积的用于产生转导颗粒的方法。
13.发明概述本发明提供：在第一配置中一种产生转导颗粒的方法，其中颗粒能够识别细菌靶细胞上的受体以转导细胞，方法包括在细菌生产细胞中产生颗粒，其中生产细胞在其表面上不表达所述受体。
14.在第二配置中生产细胞用于提高转导颗粒的产量的用途。
15.在第三配置中包含通过本发明的方法或用途获得或可获得的转导颗粒的组合物(任选地药用组合物)。
16.在第四配置中一种杀死细菌靶细胞的方法，方法包括使细胞与本发明的组合物接触，其中转导颗粒感染细胞并将感兴趣的核酸或核苷酸序列(nsi)引入其中，其中nsi包含或编码杀死靶细胞的抗菌剂，或者其中nsi包含或编码这种抗菌剂的组分。
17.在第五配置中用于在治疗或预防人类或动物受试者的疾病或病症的方法中使用的本发明组合物，其中疾病或病症由细菌靶细胞介导，方法包括给予受试者组合物并使靶细胞与组合物接触，藉此杀死靶细胞或者抑制靶细胞的生长或增殖，从而治疗或预防疾病或病症。
18.在第六配置中可通过该方法获得的多个转导颗粒。
[0019]“转导颗粒”可为噬菌体或小于噬菌体并且为能够将核酸(例如编码抗生素或其组分)转导到靶细胞中的颗粒。转导颗粒的实例为噬菌体或包含噬菌体衣壳的颗粒。在一个实例中，每个颗粒均为复制缺陷型噬菌体颗粒。在一个实例中，每个颗粒为由基因组岛(例如致病岛，比如sapi)或其修饰形式产生的颗粒。
[0020]
附图简述图1：大肠杆菌的lps核心生物合成途径(www.ecocyc.org)。数字表示合成的顺序。参与该途径的基因被单独敲除，并对每个突变体测试p2噬菌体繁殖。p2斑块形成所必需的基因用星号标记。
[0021]
图2：通过从野生型(wt)和从噬菌体受体突变体(δrfad)细胞制备的溶解产物转导大肠杆菌c1a细胞。(a) 通过将壮观霉素标记物转导到c1a细胞来测定产量。溶解产物被连续稀释并与恒定数量的受体细胞混合。(b) 转导效率，定义为每1 ml溶解产物中获得的壮观霉素抗性菌落的数量，从两种菌株的6个独立溶解产物计算。误差条显示与平均值的标
准偏差。
[0022]
详述本发明涉及转导颗粒比如噬菌体的产生以及包含这些颗粒的组合物及其用途。这些颗粒特别地可用于将毒性有效载荷递送到靶细菌中以发挥抗菌作用。本发明还可用于产生野生型(“天然”)噬菌体和包含不同类型噬菌体的噬菌体混合物。实施方案使得能够产生用于医疗、环境或食品生产环境的这种颗粒的组合物。转导颗粒(例如噬菌体)可用于组合物，比如药物、除草剂和其他其中可有用地使用这种颗粒的试剂中。因此，本发明提供以下条款和实施方案。
[0023]
条款1. 一种产生转导颗粒的方法，其中颗粒能够识别细菌靶细胞上的受体以转导细胞，方法包括在细菌生产细胞中产生颗粒，其中生产细胞在其表面上不表达所述受体。
[0024]
当在靶细胞上表面表达时，颗粒能够附着于所述受体。在一个实例中，颗粒附着于靶细胞上的所述受体并将dna转导到靶细胞中。在一个实施方案中，dna包含nsi。在一个实例中，颗粒为噬菌体样的或者为噬菌体。例如，颗粒包含其中包装dna的噬菌体衣壳。
[0025]
在一个实例中，生产细胞和靶细胞为细菌细胞。在另一个实例中，其为古细菌细胞。
[0026]
生产细胞不同于靶细胞。至少，其不同之处在于前者不(或基本上不)表面表达所述受体，而后者则表达。
[0027]
2. 条款1的方法，其中生产细胞和靶细胞为相同物种的细胞。
[0028]
任选地，除靶细胞表面表达所述受体以外，生产细胞和靶细胞为相同菌株的细胞。
[0029]
3. 任何前述条款的方法，其中生产细胞为大肠杆菌细胞。
[0030]
在一个实例中，细胞为大肠杆菌nissle或k
‑
12 (例如k
‑
12 mg1655)细胞。
[0031]
在一个实例中，每个生产细胞包含含有感兴趣的核酸序列(nsi)、噬菌体包装序列(例如pac或cos或其同源物)和复制起点的核酸。在一个实施方案中，核酸为噬菌粒或质粒。核酸被包装于生产细胞中以产生本发明的颗粒。在一个实施方案中，生产细胞包含辅助病毒或噬菌体的基因组，其用于提供在生产细胞中包装和/或复制核酸所需的必不可少功能。技术人员将熟悉辅助病毒和辅助噬菌体。
[0032]
在一个实例中，每个生产细胞包含 (i) 辅助噬菌体基因组；和(ii)包含感兴趣的核酸序列(nsi)、噬菌体包装序列(例如pac或cos)、复制起点和任选地一个或多个核苷酸序列(每个编码用于激活辅助噬菌体的辅助噬菌体反式激活因子)的核酸。在一个实施方案中，组分(i)包含在核酸(ii)中。在一个实施方案中，核酸(ii)为噬菌粒或质粒。
[0033]
在一个实施方案中，nsi编码感兴趣的蛋白(poi)，例如酶、核酸酶、抗生素、抗原结合位点、标记物(例如抗生素标记物或荧光标记物)或者药物或其组分。
[0034]
4. 任何前述条款的方法，其中转导颗粒包含噬菌体衣壳，其中衣壳包含用于转导到靶细菌细胞中的包装的感兴趣的核酸(nsi)。
[0035]
在一个实例中，nsi包含在噬菌粒中。在一个实例中，nsi包含在质粒中。
[0036]
5. 条款4的方法，其中nsi包含或编码杀死靶细胞的抗菌剂，或者其中nsi包含或编码这种抗菌剂的组分。
[0037]
6. 条款5的方法，其中nsi包含编码crispr/cas系统的引导rna (任选地单引导
rna)的核苷酸序列。
[0038]
任选地，引导包含能够与包含在靶细胞中的前间隔序列(protospacer sequence)杂交的间隔序列。在一个实施方案中，靶细胞包含内源活性的cas (例如cas 3或cas9)，其可与靶细胞中的引导rna一起操作以将cas引导至同源前间隔序列以修饰(例如切割)序列并且任选地杀死靶细胞。在另一个实施方案中，cas代替由通过本发明的颗粒转导到靶细胞中的dna或另外由其编码。
[0039]
7. 任何前述条款的方法，其中转导颗粒为噬菌体。
[0040]
8. 任何前述条款的方法，其中转导颗粒为非自我复制的。
[0041]
9. 任何前述条款的方法，其中每个生产细胞的基因组包含破坏受体合成和/或其作为细胞表面受体的表达的遗传修饰。
[0042]
在一个实例中，每个生产细胞为rfa突变体，例如其中生产细胞为大肠杆菌细胞。在一个实施方案中，rfa为rfac。在一个实施方案中，rfa为rfad。在一个实施方案中，rfa为rfaf。在一个实施方案中，rfa为rfag。在一个实施方案中，rfa为rfai。在一个实施方案中，rfa为rfa j。例如参见图1。
[0043]
任选地，在生产细胞的基因组(例如染色体)中存在rfa 基因(例如rfac、rfad、rfae、rfaf、rfag、rfap、rfaq、rfay、rfab、rfai或rfaj)的破坏。 任选地，破坏为rfad和/或rfae的破坏(例如缺失)。任选地，生产细胞在此为大肠杆菌细胞。破坏可为基因的敲除、基因中异源核苷酸序列的插入、一种或多种突变(例如基因中的缺失、取代或添加或任何组合)，其使基因无法用于产生受体、受体组分或生产细胞中受体产生所必需的基因产物。用于实现这一点的标准分子生物学技术对技术人员为显而易见的。
[0044]
10. 条款9的方法，其中修饰为脂多糖(lps)合成途径的修饰。
[0045]
11. 任何前述条款的方法，其中受体包含lps。
[0046]
在一个实例中，受体为表1
‑
3中提及的或本文另外提及的任何受体。在一个实例中，颗粒包含p2噬菌体衣壳和受体为p2受体。
[0047]
12. 如任何前述条款中定义的生产细胞用于提高转导颗粒的产量的用途。
[0048]
13. 条款12的用途，其中转导颗粒如条款1
‑
11中任何一项所定义。
[0049]
14. 条款12或13的用途，其用于与表面表达受体的生产细胞中的生产相比较，增加产量至至少10倍。
[0050]
15. 条款14的用途，其中增加为至少100倍。
[0051]
16. 条款14的用途，其中增加为10
‑
1000倍。
[0052]
17. 任何前述条款的方法或用途，其包括从细胞材料中分离转导颗粒。
[0053]
18. 一种包含通过条款17的方法或用途获得或可获得的转导颗粒的组合物(任选地药用组合物)。
[0054]
任选地，组合物包含杀死靶细胞或对靶细胞毒性的抗生素。
[0055]
19. 条款18的组合物，其中组合物不包含生产细胞lps。
[0056]
20. 一种杀死细菌靶细胞的方法，方法包括使细胞与条款18或19的组合物接触，其中转导颗粒感染细胞并在其中引入nsi，其中nsi包含或编码杀死靶细胞的抗菌剂，或其中nsi包含或编码这种抗菌剂的组分。
[0057]
任选地，本发明的组合物、群体或颗粒的任何方法或用途为体外或离体的方法或
用途。任选地，方法或用途不在人类或动物中或之上进行。任选地，方法或用途在人类或动物组织、细胞或血清样品中或之上体外进行。
[0058]
21. 一种用于在治疗或预防人类或动物受试者的疾病或病症的方法中使用的条款18或19的组合物，其中疾病或病症由细菌靶细胞介导，方法包括给予受试者组合物和使靶细胞与条款18或19的组合物接触，藉此杀死靶细胞或者抑制靶细胞的生长或增殖，从而治疗或预防疾病或病症。
[0059]
22. 条款21的组合物，其中包含在组合物中的转导颗粒感染靶细胞并在其中引入nsi，其中nsi包含或编码杀死靶细胞的抗菌剂，或其中nsi包含或编码这种抗菌剂的组分。
[0060]
23. 条款21或22的组合物，其中靶细胞为埃希氏菌属、克雷伯氏菌属、梭菌属或假单胞菌属细胞。
[0061]
24. 条款21或22的组合物，其中靶细胞为大肠杆菌、肺炎克雷伯氏菌(k. pneumoniae)、艰难梭菌(c. dificile)或铜绿假单胞菌(p. aeruginosa)细胞。
[0062]
以下讨论用于本发明的受体的实例。
[0063]
蛋白质受体主要为外膜蛋白；糖部分包括构成细胞壁、菌膜、磷壁酸和lta的那些。本发明的受体例如选自这些中的任何一种。
[0064]
噬菌体吸附启动感染过程。通过细菌噬菌体(噬菌体)的结合蛋白和细菌细胞表面上的受体之间的一系列相互作用，病毒识别潜在敏感的宿主，并然后定位自身以射出dna。因此，噬菌体吸附不仅为感染过程中的关键步骤，而且还代表病毒和宿主之间的初始接触点并决定宿主范围的特异性。
[0065]
噬菌体吸附通常由3个步骤组成：初始接触、可逆结合和不可逆附着(duckworth 1987)。第一步骤包括由布朗运动、分散、扩散或流动引起的噬菌体和宿主之间的随机碰撞(kokjohn和miller 1992)。在可逆步骤中，与细菌表面组分的结合不是不可更改的，并且噬菌体可从宿主释放。该过程首先由garen和puck (1951)通过洗脱之后噬菌体分离的实验观察鉴定，可用于在其搜寻特定受体时保持噬菌体靠近细胞表面(kokjohn和miller 1992)。细菌受体和噬菌体结合结构域之间的特定连接有时通过酶促裂解介导。该步骤触发其他噬菌体分子的构象重排，使得能够将遗传物质插入到宿主中(有关噬菌体基因组射出机制的进一步细节参见molineux和panja (2013)的综述)。
[0066]
许多综述研究突显了噬菌体在吸附期间靶向的广泛范围的宿主相关受体(蛋白、糖和细胞表面结构) (lindberg 1977; schwartz 1980; wright, mcconnell和kanegasaki 1980; heller 1992; frost 1993; henning和hashemolhosseini 1994; vinga et al. 2006; rakhuba et al. 2010; chaturongakul和ounjai 2014)。噬菌体识别的宿主细胞受体的性质和位置根据噬菌体和宿主而非常不同。它们的范围从肽序列到多糖部分。事实上，已显示噬菌体与位于革兰氏阳性(xia et al. 2011)和革兰氏阴性细菌(marti et al. 2013)两者的壁中、细菌荚膜或粘液层(fehmel et al. 1975)中以及附属器[例如菌毛(guerrero
‑
ferreira et al. 2011)和鞭毛(shin et al. 2012)]中的受体结合。所涉及的受体和结构的这种多样性证明噬菌体和宿主为克服其对应物采用的进化策略而发展的多种机制。考虑到估计定殖于地球不同环境中的噬菌体的多样性和数量惊人，遇到如此多的可能性并不出乎意料(clokie et al. 2011)。然而，在所有情况下，迄今为止已显示吸附涉及细菌细胞壁的成分或突出结构。因此，在一个实施方案中，本发明中的受体可
为本段落或本公开中别处提及的任何这种受体。
[0067]
任选地，受体包含脂多糖(lps)、庚糖部分、宿主的葡糖基化细胞壁磷壁酸(wta)、yueb或被噬菌体的尾丝蛋白或噬菌体的gp21识别的受体。
[0068]
革兰氏阳性细菌细胞壁中的受体肽聚糖或胞壁质为细菌细胞壁的重要组分，并且通常参与噬菌体吸附。其为由多个单元的氨基酸和糖衍生物
‑
n
‑
乙酰葡糖胺和n
‑
乙酰胞壁酸组成的聚合物。这些糖成分通过糖苷键连接，形成通过氨基酸的交联连接在一起的聚糖四肽片。交联通过二氨基庚二酸(一种氨基酸类似物)和d
‑
丙氨酸之间的肽键或通过短肽间桥发生。革兰氏阳性细菌中的这些间桥数量更多，导致其特征性更厚的细胞壁。
[0069]
可参与噬菌体吸附的革兰氏阳性细菌细胞壁的另一种主要组分为磷壁酸
‑
由甘油磷酸酯或核糖醇磷酸酯和氨基酸组成的多糖。它们与肽聚糖的胞壁酸键合。当磷壁酸与质膜的脂质键合时，它们称为脂磷壁酸(lta)。细菌细胞壁组成的进一步细节可见于tortora, funke和case (2007), willey, sherwood和woolverton (2008), pommerville (2010)和madigan et al. (2012)。
[0070]
迄今为止鉴定的大多数受体与肽聚糖或磷壁酸结构相关(表1)。在表1中报道的30种靶向革兰氏阳性细菌的噬菌体中，只有10种利用其他结构进行吸附。在这10种噬菌体中，9种显示与磷壁酸(噬菌体spp1)或肽聚糖(噬菌体5、13、c2、h、ml3、kh、l和p2)的残基相互作用以进行可逆结合。这突显了这些结构在噬菌体吸附到革兰氏阳性细菌方面可起到重要作用。
[0071]
任选地，本发明的受体为肽聚糖、胞壁质、磷壁酸或脂磷壁酸(lta)。任选地，本发明的每个转导颗粒为第一噬菌体或包含第一噬菌体的衣壳，其中第一噬菌体为表1中所列科的噬菌体(并且任选地生产细胞和/或靶细胞为表1所列噬菌体的宿主和/或受体为表1所列噬菌体的受体)。在一个实施方案中，生产细胞和靶细胞为革兰氏阳性细胞。任选地，生产细胞和/或靶细胞属于表1中所列的物种或菌株(其中生产细胞和靶细胞物种不同或相同)。优选地，当生产细胞为革兰氏阳性细菌时，受体为肽聚糖。或者，当生产细胞为革兰氏阳性细菌时，受体为磷壁酸。
[0072]
革兰氏阴性细菌细胞壁中的受体在革兰氏阴性细菌中，肽聚糖层相对薄，并且位于外膜(细胞壁的主要组分)的内侧。这两层由braun脂蛋白连接。外膜为一种复杂结构，由装饰有蛋白、多糖和脂质的脂质双层组成；后两种分子形成lps层。lps为由3个部分组成的复合物：脂质a、核心多糖和o
‑
多糖。通常，脂质a由附着于葡糖胺磷酸酯二糖的脂肪酸组成。核心多糖通过酮脱氧辛酸酯接头连接于脂质a。核心多糖和o
‑
多糖(o
‑
链或o
‑
抗原)含有向外延伸至外膜的数个糖残基单元。含有lps的所有3种组分的细胞称为光滑(s)型，和缺少o
‑
多糖部分的那些区分为粗糙(r)型。通常，组成o
‑
抗原的糖为高度可变的，和核心多糖的那些在物种间更为保守。因此，当与能够吸附于r
‑
型细胞的那些相比较时，仅对s
‑
型菌株特异性的噬菌体趋于靶向o
‑
多糖，并因此通常具有更窄的宿主范围(rakhuba et al. 2010)。
[0073]
表2(a)汇编了与噬菌体受体
‑
结合蛋白(rbp)相互作用的位于细胞壁中的革兰氏阴性细菌受体。有趣的是，在大肠杆菌噬菌体中，对蛋白质或多糖受体没有偏好：一些噬菌体吸附于细胞壁蛋白上，一些吸附于糖部分上，和其他的则需要两种结构进行吸附。在沙门
氏菌属噬菌体的情况下，情景没有那么不同：一些使用蛋白，一些使用糖部分和一些使用两种类型的受体。另一方面，假单胞菌属噬菌体通常吸附到多糖受体上。尽管不能从这种小的样本规模得出最终结论，但应当注意的是假单胞菌属可具有两个lps部分，一个称为a带的短链 lps和一个较长的b带lps (beveridge和graham 1991)。
[0074]
任选地，本发明的受体为宿主细胞壁蛋白。任选地，受体为糖。任选地，受体包含o
‑
抗原、lps脂质a或lps核心多糖。在一个实例中，受体为光滑lps或粗糙lps。任选地，宿主细胞为s
‑
型细菌和受体包含宿主的o
‑
抗原。任选地，宿主细胞为r
‑
型细菌和受体包含宿主的lps脂质a。
[0075]
任选地，受体为宿主细胞壁蛋白。任选地，受体为糖。任选地，受体包含o
‑
抗原、lps脂质a或lps核心多糖。在一个实例中，受体为光滑lps或粗糙lps。任选地，宿主细胞为s
‑
型细菌和受体包含宿主的o
‑
抗原。任选地，宿主细胞为r
‑
型细菌和受体包含宿主的lps脂质a。
[0076]
在一个实例中，宿主为大肠杆菌和转导颗粒为大肠杆菌噬菌体(或包含大肠杆菌噬菌体衣壳)，其中受体为多糖受体和/或宿主细胞壁蛋白受体。在一个实例中，生产细胞被改造为不表达大肠杆菌多糖受体和/或大肠杆菌细胞壁蛋白受体。
[0077]
在一个实例中，宿主为沙门氏菌属，其中受体为多糖受体和/或宿主细胞壁蛋白受体。在一个实例中，生产细胞被改造为不表达沙门氏菌属多糖受体和/或沙门氏菌属细胞壁蛋白受体。
[0078]
在一个实例中，宿主为克雷伯氏菌属，其中受体为多糖受体和/或宿主细胞壁蛋白受体。在一个实例中，生产细胞被改造为不表达克雷伯氏菌属多糖受体和/或克雷伯氏菌属细胞壁蛋白受体。
[0079]
在一个实例中，宿主为假单胞菌属，其中受体为多糖受体。在一个实例中，第二细胞被改造为不表达假单胞菌属多糖受体。
[0080]
任选地，本发明的每个转导颗粒为第一噬菌体或包含第一噬菌体的衣壳，其中第一噬菌体为表2中所列科的噬菌体(并且任选地生产细胞为表2中所列噬菌体的宿主和/或受体为表2中所列噬菌体的受体)。
[0081]
在一个实施方案中，生产细胞和靶细胞为革兰氏阴性细胞。优选地，生产细胞为大肠杆菌细胞。任选地，生产细胞和/或靶细胞属于表2中所列的物种或菌株(例如其中细胞物种不同或相同)。
[0082]
表2(b)报告了其中噬菌体不仅吸附到细菌表面上，而且还酶促降解o
‑
链结构中的糖部分的情况。应当注意的是所有这些噬菌体均属于短尾噬菌体科(podoviridae)。
[0083]
革兰氏阴性细菌其他结构中的受体在本章节中，讨论了也用作颗粒或噬菌体的受体的除细胞壁部分以外的细菌结构。这些包括结构比如鞭毛、菌毛和荚膜。它们可见于来自两种革兰氏菌株的物种。例如参见表3。
[0084]
任选地，本发明的受体为鞭毛、菌毛或荚膜组分(例如所列的物种中在表3中所列的或如在属于与所列不同的物种的宿主中发现的组分)。任选地，噬菌体为表3中所列科的噬菌体(并且任选地宿主为如表3中所列噬菌体的宿主和/或受体为如表3中所列噬菌体的受体)。 任选地，噬菌体为表3中所列的噬菌体(并且任选地宿主为如表3中所列噬菌体的宿主和/或受体为如表3中所列噬菌体的受体)。
[0085]
鞭毛为长且薄的螺旋结构，其赋予细胞运动性。它们由基体、鞭毛钩和由鞭毛蛋白亚基组成的鞭毛丝组成(willey, sherwood和woolverton 2008)。表3(a)报告了附着于鞭毛蛋白上的噬菌体。噬菌体对丝结构的粘附通常为可逆的，并且鞭毛的螺旋移动导致噬菌体沿着其表面移动，直至其到达细菌壁。然后，在鞭毛基部附近，于位于细菌表面的受体上发生不可逆吸附(schade, adler和ris 1967; lindberg 1973; guerrero
‑
ferreira et al. 2011)。有趣的是，观察到一些噬菌体(
ϕ
cbk和
ϕ
cb13)含有从其衣壳突出的丝，丝负责可逆地结合到宿主的鞭毛上；只有当噬菌体的尾部与细胞极上的菌毛孔相互作用时才会发生不可逆吸附(guerrero
‑
ferreira et al.2011)。由于这些噬菌体在菌毛上发生不可逆吸附，因此即使它们与鞭毛相互作用，在表3(b)中报告它们，该表侧重于与菌毛和配对形成结构中的受体相互作用的噬菌体。
[0086]
菌毛为用于细菌接合的杆形丝状附属器(lindberg 1973)。它们从供体细胞延伸并附着于受体细胞壁上的受体。菌毛的解聚导致其缩回，使两个细胞彼此更靠近。通过其表面上的结合蛋白来实现细胞的进一步粘附；遗传物质通过这种接合连接而转移(madigan et al. 2012)。迄今为止，吸附于菌毛结构与属于不同于有尾噬菌体目的目的噬菌体相关(表3b)。事实上，根据frost (1993)，囊状噬菌体科和丝状噬菌体科组成吸附到菌毛结构上的大多数噬菌体。有趣的是，噬菌体可对菌毛的某些部分具有选择性。对于f
‑
型噬菌体就是这种情况，其吸附仅发生于菌毛尖端(click和webster 1998)。在其他噬菌体(比如
ϕ
6)中，附着发生在结构的侧面(柄) (daugelavicius et al. 2005)。
[0087]
荚膜为从细胞壁径向延伸的柔性胶结物质。其充当细菌之间和/或细胞和基质之间的结合剂(beveridge和graham 1991)。粘液层类似于荚膜，但更易于变形。两者均由细菌释放的粘性物质制成，并且其共同组分为多糖或蛋白(madigan et al. 2012)。噬菌体吸附于荚膜或粘液层为通过组成这些层的胞外多糖的酶促裂解介导。该层的水解为一个可逆步骤，而不可逆的结合为通过噬菌体与细胞壁上的受体结合来实现(rakhuba et al. 2010)。从表3(c)中可以看出，经鉴定具有rbp识别胞外多糖的少数噬菌体主要具有短尾噬菌体科形态学。
[0088]
在一个实例中，生产细胞为沙门氏菌属(例如肠道沙门氏菌鼠伤寒血清变型(s enterica serovar typhimurium))细胞并且受体选自鞭毛、维生素b
12
摄取外膜蛋白、btub和脂多糖相关的o
‑
抗原。在一个实例中，受体为鞭毛或btub，和第一噬菌体为长尾噬菌体科噬菌体。在一个实例中，受体为lps的o
‑
抗原和第一噬菌体为短尾噬菌体科噬菌体。任选地，受体为flic宿主受体或fljb受体。
[0089]
任选地，生产细胞为肠道沙门氏菌或铜绿假单胞菌细胞。任选地，受体为如表4中所列宿主的受体。
[0090]
沙门氏菌属o66的o
‑
抗原结构已经确立，据报道其与已知的大肠杆菌o166的o
‑
抗原结构的不同之处仅在于一个连键(最有可能是o
‑
单元之间的连键)和o
‑
乙酰化。发现沙门氏菌属o66和大肠杆菌o166的o
‑
抗原基因簇具有类似的组织，仅有的例外为沙门氏菌属o66中的wzy基因被非编码区替换。大肠杆菌o166中wzy基因的功能通过缺失和反式互补突变体的构建和分析证实。有人提出位于o
‑
抗原基因簇之外的功能性wzy基因参与沙门氏菌属o66 o
‑
抗原生物合成，如先前在沙门氏菌属血清组a、b和d1中报道的那样。沙门氏菌属o66和大肠杆菌o166的o
‑
抗原基因簇之间相应基因的序列同一性在64%
‑
70%的范围内，表明它们可
能源于一个共同祖先。可能在物种分化之后，沙门氏菌属o66通过灭活位于o
‑
抗原基因簇中的wzy基因并获得两个均位于o
‑
抗原基因簇之外的新基因(一个wzy基因和一个o
‑
乙酰基修饰的原噬菌体基因)而获得其特定的o
‑
抗原形式。
[0091]
在一个实例中，生产细胞为大肠杆菌细胞并且不包含可表达的大肠杆菌(例如大肠杆菌o166) wzy基因。
[0092]
任选地，受体选自脂多糖、磷壁酸(任选mannac(β1
→
4)glcnac二糖，其中1
‑
3个甘油磷酸酯附着于mannac残基的c4羟基，然后是甘油或核糖醇磷酸酯重复单元的长链)、蛋白和鞭毛。
[0093]
任选地，受体包含生产细胞物种的o
‑
抗原。
[0094]
任选地，本发明的噬菌体或颗粒为可操作的以在生产细胞中表达内溶素或穴蛋白，任选地当噬菌体或颗粒在生产细胞中复制时。这对于释放颗粒用于随后从细胞材料中纯化出以产生本发明的组合物是有用的。
[0095]
在一个实施方案中，每个颗粒能够感染靶细菌，颗粒包含能够在靶细菌中表达蛋白或rna的感兴趣的核苷酸序列(nsi)，或者其中nsi包含可在靶细菌中操作的调控元件。在一个实例中，nsi能够与靶细胞染色体或包含在靶细胞中的附加体重组以修饰染色体或附加体。任选地，这在其中切割染色体或附加体(例如在预定位点使用引导性核酸酶，比如cas、talen、锌指或大范围核酸酶；或限制性核酸内切酶)并且同时或依序地用包含含有nsi的第一dna的颗粒感染细胞的方法中进行，其中将dna引入到细胞中并将nsi或其序列引入到染色体或附加体中处于或邻近切割位点。在一个实例中，第一dna包含可操作以进行切割的crispr/cas系统的一个或多个组分(例如至少包含编码用于靶向待切割位点的引导rna或crrna的核苷酸序列)并且进一步包含nsi。
[0096]
在一个实施方案中，nsi或其编码的蛋白或rna在靶细菌中的存在介导靶细胞杀伤或者靶细胞生长或繁殖的下调，或者介导由靶细胞基因组编码的一种或多种rna或蛋白的表达的关闭或其下调。
[0097]
在一个实施方案中，nsi或其编码的蛋白或rna在靶细菌中的存在介导靶细胞生长或繁殖的上调，或者介导靶细胞基因组编码的一种或多种rna或蛋白的表达的开启或其上调。
[0098]
在一个实施方案中，nsi编码对靶细菌毒性的crispr/cas系统的组分。
[0099]
在一个实施方案中，第一nsi包含在载体(例如质粒或穿梭载体)中。
[0100]
一个实施方案提供一种离体处理环境的方法，方法包括使环境暴露于可通过本发明的生产方法获得的转导颗粒群体，其中环境包含靶细菌和颗粒(例如噬菌体或包含噬菌体衣壳的颗粒)感染并杀死靶细菌。在一个实例中，与噬菌体给予同时或依序地进一步给予环境作用剂。在一个实例中，作用剂为除草剂、杀虫剂、杀虫药、植物肥料或清洁剂。
[0101]
提供一种治疗人类或动物受试者的靶细菌感染的方法，方法包括使细菌暴露于可通过生产方法获得的转导颗粒群体，其中颗粒感染并杀死靶细菌。
[0102]
任选地，本文中的靶细菌包含在受试者的微生物组，例如肠道微生物组中。或者，微生物组为皮肤、头皮、毛发、眼睛、耳部、口腔、喉咙、肺部、血液、直肠、肛门、阴道、阴囊、阴茎、鼻部或舌头微生物组。
[0103]
在一个实例中，进一步与转导颗粒给予同时或依次地给予受试者药物。在一个实
例中，药物为抗生素、抗体、免疫检查点抑制剂(例如抗pd
‑
1、抗pd
‑
l1或抗ctla4抗体)、过继性细胞疗法(例如car
‑
t疗法)或疫苗。
[0104]
在一个实例中，本发明采用辅助噬菌体来包装nsi。在一个实例中，辅助噬菌体能够包装包含nsi的dna以产生第一转导颗粒，其中颗粒不同于辅助噬菌体并且辅助噬菌体本身不能产生辅助噬菌体颗粒。
[0105]
提供一种包含本发明的转导颗粒群体的组合物，其中颗粒需要根据前一段的辅助噬菌体来复制转导颗粒；并且任选地其中少于20、15、10、5、4、3、2、1、0.5、0.4、0.2或0.1%的包含在组合物中的总转导颗粒为这种辅助噬菌体的颗粒。在一个实例中，组合物包含辅助噬菌体并且少于1%的包含在组合物中的总转导颗粒为这种辅助噬菌体的颗粒。在一个实例中，组合物包含辅助噬菌体并且少于0.5%的包含在组合物中的总转导颗粒为这种辅助噬菌体的颗粒。在一个实例中，组合物包含辅助噬菌体并且少于0.1%的包含在组合物中的总转导颗粒为这种辅助噬菌体的颗粒。在一个实例中，组合物包含辅助噬菌体并且少于0.01%的包含在组合物中的总转导颗粒为这种辅助噬菌体的颗粒。在一个实例中，组合物包含辅助噬菌体并且少于0.001%的包含在组合物中的总转导颗粒为这种辅助噬菌体的颗粒。在一个实例中，组合物包含辅助噬菌体并且少于0.0001%的包含在组合物中的总转导颗粒为这种辅助噬菌体的颗粒。在一个实例中，组合物包含辅助噬菌体并且少于0.00001%的包含在组合物中的总转导颗粒为这种辅助噬菌体的颗粒。在一个实例中，组合物包含辅助噬菌体并且少于0.000001%的包含在组合物中的总转导颗粒为这种辅助噬菌体的颗粒。在一个实例中，组合物包含辅助噬菌体并且少于0.0000001%的包含在组合物中的总转导颗粒为这种辅助噬菌体的颗粒。在一个实例中，组合物包含辅助噬菌体并且少于0.00000001%的包含在组合物中的总转导颗粒为这种辅助噬菌体的颗粒。
[0106]
在一个实例中，组合物或群体包含至少103、104、105或106个转导颗粒，例如如转导测定所示。在一个实例中，组合物或群体包含至少103个转导颗粒并且例如不超过10
14
个颗粒。在一个实例中，组合物或群体包含至少104个转导颗粒并且例如不超过10
14
个颗粒。在一个实例中，组合物或群体包含至少105个转导颗粒并且例如不超过10
14
个颗粒。在一个实例中，群体包含至少106个转导颗粒并且例如不超过10
14
个颗粒。例如，为了测量颗粒浓度，当本发明颗粒的基因组含有抗生素标记物时，可进行标准转导测定。因此，在这种情况下，本发明的颗粒能够感染靶细菌，并且在1 ml样品中，群体的组合物包含至少103、104、105或106个转导颗粒，这可通过以感染复数< 0.1感染易感细菌并通过在20
‑
37摄氏度下，例如在20或37摄氏度下体外在与抗生素标记物相应的选择性琼脂板上铺板确定感染细胞的数量来确定。
[0107]
任选地，至少99.9、99.8、99.7、99.6、99.5、99.4、99.3、99.2、99.1、90、85、80、70、60、50或40%的包含在组合物中的总转导颗粒为本发明颗粒的颗粒。
[0108]
在一个实例中，本发明颗粒的基因组包含f1复制起点。
[0109]
在一个实例中，辅助噬菌体为大肠杆菌噬菌体。在一个实例中，本发明的颗粒为大肠杆菌、艰难梭菌(c difficile)、链球菌属(streptococcus)、克雷伯氏菌属(klebsiella)、假单胞菌属(pseudomonas)、不动杆菌属(acitenobacter)、肠杆菌科(enterobacteriacea)、厚壁菌门(firmicutes)或拟杆菌门(bacteroidetes)噬菌体，或者包含这种属的衣壳(capsid)，其中衣壳包装nsi。在一个实例中，辅助噬菌体为经改造的m13
噬菌体。
[0110]
在一个实例中，本发明颗粒的基因组包含噬菌粒，其中噬菌粒包含用于在存在辅助噬菌体的情况下包装颗粒的包装信号。
[0111]
本发明的颗粒可含有包含感兴趣的核苷酸序列(nsi)的dna，例如如本文定义的，比如编码可在可被颗粒感染的靶细菌中操作的crispr/cas系统的组分的nsi。一旦在靶细菌内，任选地在没有辅助噬菌体的情况下颗粒dna不能被包装以形成转导颗粒。这有效地含有本发明颗粒的基因组及其编码的产物(蛋白和/或核酸)的活性，以及限制或控制nsi及其编码的产物在包含暴露于本发明颗粒的靶细菌的环境中的剂量。这例如对于控制包含在人类或动物受试者、植物中的环境或其他环境(例如土壤或食品或食品成分)的医学处理是有用的。
[0112]
在一个实施方案中，本发明的每个颗粒包含一种或多种噬菌体结构蛋白和/或包含噬菌体衣壳。噬菌体结构蛋白的实例为噬菌体外壳蛋白、项圈蛋白(collar proteins)和噬菌体尾丝蛋白。在一个实例中，颗粒包含第一类型噬菌体的衣壳和尾丝蛋白。例如，噬菌体类型为大肠杆菌、肺炎克雷伯氏菌(klebsiella pneumoniae)、铜绿假单胞菌(pseudomonas aeruginosa)、艰难梭菌(clostridium difficile)、幽门螺杆菌(helicobacter pylori)、金黄色葡萄球菌(staphylococcus aureus)、沙门氏菌(salmonelly) (例如鼠伤寒沙门氏菌)或弯曲杆菌属(campylobacter)噬菌体。
[0113]
任选地，至少95% (例如100%)的包含在组合物中的转导颗粒为本发明的颗粒。
[0114]
在另一个实施方案中，组合物包含第二转导(例如噬菌体)颗粒，其中第二颗粒不同于本发明的第一颗粒(即权利要求1中所述的颗粒)。
[0115]
任选地，组合物群体包含至少103、104、105或106个噬菌体颗粒，如转导测定所示。
[0116]
任选地，本发明的每个颗粒包含用于nsa的载体，其中载体为质粒或噬菌粒。例如，载体为可在宿主细菌中复制的穿梭载体(例如puc载体)。
[0117]
任选地，本发明每个颗粒的基因组包含包装信号，比如pac或cos序列或其同源物。
[0118]
任选地，本发明的转导颗粒为温和噬菌体。任选地，本发明的转导颗粒为溶菌噬菌体。
[0119]
任选地，本发明的颗粒能够感染靶细菌，颗粒包含能够在靶细菌中表达蛋白或rna (例如grna或crrna)的感兴趣的核苷酸序列(nsi)，或者其中nsi包含可在靶细菌中操作的调控元件。
[0120]
任选地，nsi或其编码的蛋白或rna在靶细菌中的存在介导靶细胞杀伤或者靶细胞生长或繁殖的下调，或者介导由靶细胞基因组编码的一种或多种rna或蛋白的表达的关闭或其下调。
[0121]
任选地，nsi或其编码的蛋白或rna在靶细菌中的存在介导靶细胞的生长或繁殖的上调，或者介导靶细胞基因组编码的一种或多种rna或蛋白的表达的开启或其上调。
[0122]
任选地，本发明的颗粒能够感染靶细菌并且每个颗粒包含用于杀死靶细菌的经改造的抗菌手段。通过使用术语“经改造的”，技术人员易于显而易见的是相关手段已被引入并且不是天然存在于噬菌体或颗粒中。例如，手段为重组的、人工的或合成的。
[0123]
在一个实例中，本发明的每个颗粒包含基因组岛dna或致病岛(例如sapi) dna，其中任选地dna包含用于杀死靶细菌的nsi或经改造的抗菌手段(例如dna编码核酸酶，比如
cas核酸酶(例如cas9或cas3)，和/或用于在靶细菌中表达的引导rna)。
[0124]
任选地，抗菌手段包含crispr/cas系统的一个或多个组分。任选地，一个或多个组分包含(i)编码引导rna(例如单引导rna)或包含用于产生引导rna的crispr阵列的dna序列，其中引导rna能够靶向靶细菌的基因组；(ii)cas核酸酶编码dna序列；和/或(iii)编码cascade的一个或多个组分的dna序列。在一个实例中，本文的cas为cas9。在一个实例中，本文的cas为cas3。cas可与靶细菌编码的cas相同。
[0125]
任选地，抗菌手段包含编码引导性核酸酶(比如cas核酸酶、talen、锌指核酸酶或大范围核酸酶)的核酸。
[0126]
任选地，组合物、群体或转导颗粒为用于对人类或动物受试者实施的医药的eac，或者组合物为用于对人类或动物受试者实施的医药的药用组合物。在一个实例中，动物为牲畜或伴侣宠物(例如牛、猪、山羊、绵羊、马、狗、猫或兔)。在一个实例中，动物为昆虫(处于其生命周期任何阶段的昆虫，例如卵、幼虫或蛹)。在一个实例中，动物为原生动物。在一个实例中，动物为头足类动物。
[0127]
任选地，组合物为除草剂、杀虫剂、食品或饮料加工剂、食品或饮料添加剂、石化或燃料加工剂、净水剂、化妆品添加剂、洗涤剂添加剂或环境(例如土壤)添加剂或清洁剂。
[0128]
在一些实施方案中本发明的颗粒不能自我复制并且需要辅助噬菌体来实现自我复制有效地提供在组合物的作用位置(例如肠道)和/或在受试者的环境中的遏制，例如当暴露于受试者的分泌物比如尿液和粪便时，否则其可能含有复制的第一噬菌体。在一些实施方案中辅助噬菌体不能自我包装限制颗粒形成包装颗粒所需因素的可用性，因此通过限制本发明颗粒的传播来提供遏制。这可为有用的，例如以遏制由颗粒提供的抗菌活性，比如crispr/cas杀伤原理。
[0129]
在一个实例中，当受试者为人类时，受试者不是胚胎。
[0130]
任选地，环境为以下的微生物组：土壤；植物、一部分(例如叶子、果实、蔬菜或花)的部分或植物产品(例如果肉)；水；水道；流体；食物或其成分；饮料或其成分；医疗装置；化妆品；洗涤剂；血液；体液；医疗设备；工业设备；石油钻井平台；石化加工、储存或运输设备；车辆或集装箱。在一个实例中，环境为已经给予组合物的人类或动物受试者的离体体液(例如尿液、血液、血液制品、汗液、眼泪、痰液或唾液)、身体固体(例如粪便)或组织。
[0131]
任选地，抗菌手段包含crispr/cas系统的一个或多个组分。例如，一个或多个组分包含(i)编码引导rna(例如单引导rna)或包含用于产生引导rna的crispr阵列的dna序列，其中引导rna能够靶向靶细菌的基因组；(ii)cas(例如cas9、cas3、cpf1、casx或casy)核酸酶编码dna序列；和/或(iii)编码cascade的一个或多个组分(例如casa)的dna序列。
[0132]
任选地，抗菌手段包含编码引导性核酸酶(比如cas核酸酶、talen、锌指核酸酶或大范围核酸酶)的核酸。
[0133]
在一个实例中，本发明的颗粒、群体或组合物包含在医疗容器，例如注射器、小瓶、iv袋、吸入器、滴眼器或喷雾器中。在一个实例中，本发明的颗粒、群体或组合物包含在无菌容器中。在一个实例中，本发明的颗粒、群体或组合物包含在医学相容性容器中。在一个实例中，本发明的颗粒、群体或组合物包含在发酵容器，例如金属、玻璃或塑料容器中。
[0134]
在一个实例中，本发明的颗粒、群体或组合物例如与说明书或包装标签组合包含在药物中，所述说明书或包装标签带有关于通过口服、iv、皮下、鼻内、眼内、阴道、局部、直
肠或吸入将药物给予人类或动物受试者的指示。在一个实例中，本发明的颗粒、群体或组合物包含在口服药物制剂中。在一个实例中，本发明的颗粒、群体或组合物包含在鼻内或眼部药物制剂中。在一个实例中，本发明的颗粒、群体或组合物包含在个人卫生组合物(例如洗发水、肥皂或除臭剂)或化妆品制剂中。在一个实例中，本发明的颗粒、群体或组合物包含在洗涤剂制剂中。在一个实例中，本发明的颗粒、群体或组合物包含在例如用于清洁医疗或工业装置或设备的清洁制剂中。在一个实例中，本发明的颗粒、群体或组合物包含在食物、食物成分或食物加工剂中。在一个实例中，本发明的颗粒、群体或组合物包含在饮料、饮料成分或饮料加工剂中。在一个实例中，本发明的颗粒、群体或组合物包含在医用绷带、织物、膏药或拭子中。在一个实例中，本发明的颗粒、群体或组合物包含在除草剂或杀虫剂中。在一个实例中，本发明的颗粒、群体或组合物包含在杀虫药中。
[0135]
在一个实例中，每个颗粒为第一噬菌体颗粒或包含第一噬菌体的衣壳(并且任选地还包含第一噬菌体的尾丝)，其中第一噬菌体为覆盖噬菌体科(corticoviridae)、囊状噬菌体科(cystoviridae)、丝状噬菌体科(inoviridae)、光滑噬菌体科(leviviridae)、微小噬菌体科(microviridae)、肌尾噬菌体科(myoviridae)、短尾噬菌体科(podoviridae)、长尾噬菌体科(siphoviridae)或复层噬菌体科(tectiviridae)病毒。在一个实例中，辅助噬菌体为覆盖噬菌体科(corticoviridae)、囊状噬菌体科(cystoviridae)、丝状噬菌体科(inoviridae)、光滑噬菌体科(leviviridae)、微小噬菌体科(microviridae)、肌尾噬菌体科(myoviridae)、短尾噬菌体科(podoviridae)、长尾噬菌体科(siphoviridae)或复层噬菌体科(tectiviridae)病毒。在一个实例中，辅助噬菌体为丝状m13、noviridae、有尾噬菌体(例如肌尾噬菌体科、长尾噬菌体科或短尾噬菌体科)或无尾噬菌体(例如复层噬菌体科)。
[0136]
在一个实例中，第一噬菌体两者均为覆盖噬菌体科。在一个实例中，第一噬菌体为囊状噬菌体科。在一个实例中，第一噬菌体为丝状噬菌体科。在一个实例中，第一噬菌体为光滑噬菌体科。在一个实例中，第一噬菌体为微小噬菌体科。在一个实例中，第一噬菌体为短尾噬菌体科。在一个实例中，第一个噬菌体为长尾噬菌体科。 在一个实例中，第一噬菌体为复层噬菌体科。
[0137]
在一个实例中，crispr/cas组分为i 型crispr/cas系统的组分。在一个实例中，crispr/cas组分为ii型crispr/cas系统的组分。在一个实例中，crispr/cas组分为iii型crispr/cas系统的组分。在一个实例中，crispr/cas组分为iv型crispr/cas系统的组分。在一个实例中，crispr/cas组分为v型crispr/cas系统的组分。在一个实例中，crispr/cas组分包含cas9编码核苷酸序列(例如化脓性链球菌(s pyogenes) cas9、金黄色葡萄球菌(s. aureus) cas9或嗜热链球菌(s thermophilus) cas9)。在一个实例中，crispr/cas组分包含cas3编码核苷酸序列(例如大肠杆菌cas3、艰难梭菌(c difficile) cas3或沙门氏菌属cas3)。在一个实例中，crispr/cas组分包含cpf编码核苷酸序列。在一个实例中，crispr/cas组分包含casx编码核苷酸序列。在一个实例中，crispr/cas 组分包含casy编码核苷酸序列。
[0138]
在一个实例中，颗粒的基因组编码来自包含可在靶细菌中操作的启动子的核苷酸序列的感兴趣的crispr/cas组分或蛋白。
[0139]
在一个实例中，宿主细菌和/或靶细菌为大肠杆菌。在一个实例中，宿主细菌和/或靶细菌为艰难梭菌(例如载体为可在大肠杆菌中操作的穿梭载体和宿主细菌为艰难梭菌)。
(例如粪肠球菌或屎肠球菌，例如利奈唑胺耐药的)。任选地，每个生产细菌和/或靶细菌为不动杆菌属(acinetobacter) (例如鲍曼不动杆菌，例如多重耐药的)。
[0141]
靶细胞和利用本发明在这种细胞中靶向抗生素抗性的进一步实例如下：
‑
1. 任选地，靶细菌为金黄色葡萄球菌(staphylococcus aureus)细胞，例如对选自甲氧西林、万古霉素、利奈唑胺、达托霉素(daptomycin)、奎奴普丁(quinupristin)、达福普汀(dalfopristin)和替考拉宁(teicoplanin)的抗生素具有抗性。
[0142]
2. 任选地，靶细菌为铜绿假单胞菌(pseudomonas aeuroginosa)细胞，例如对选自头孢菌素类(cephalosporins) (例如头孢他啶(ceftazidime))、碳青霉烯类(carbapenems) (例如亚胺培南(imipenem)或美罗培南(meropenem))、氟喹诺酮类(fluoroquinolones)、氨基糖苷类(aminoglycosides) (例如庆大霉素(gentamicin)或妥布霉素(tobramycin))和粘菌素(colistin)的抗生素具有抗性。
[0143]
3. 任选地，靶细菌为克雷伯氏菌属(klebsiella) (例如肺炎克雷伯氏菌)细胞，例如对碳青霉烯(carbapenem)具有抗性。
[0144]
4. 任选地，靶细菌为链球菌属(streptoccoccus) (例如嗜热链球菌、肺炎链球菌或化脓性链球菌)细胞，例如对选自红霉素(erythromycin)、克林霉素(clindamycin)、β
‑
内酰胺(beta
‑
lactam)、大环内酯(macrolide)、阿莫西林(amoxicillin)、阿奇霉素(azithromycin)和青霉素(penicillin)的抗生素具有抗性。
[0145]
5. 任选地，靶细菌为沙门氏菌属(salmonella) (例如伤寒血清型(serotype typhi))细胞，例如对选自头孢曲松(ceftriaxone)、阿奇霉素(azithromycin)和环丙沙星(ciprofloxacin)的抗生素具有抗性。
[0146]
6. 任选地，靶细菌为志贺氏菌属(shigella)细胞，例如对选自环丙沙星(ciprofloxacin)和阿奇霉素(azithromycin)的抗生素具有抗性。
[0147]
7. 任选地，靶细菌为结核分枝杆菌(mycobacterium tuberculosis)细胞，例如对选自对异烟肼(isoniazid) (inh)、利福平(rifampicin) (rmp)、氟喹诺酮(fluoroquinolone)、阿米卡星(amikacin)、卡那霉素(kanamycin)和卷曲霉素(capreomycin)和阿奇霉素(azithromycin)的抗生素具有抗性。
[0148]
8. 任选地，靶细菌为肠球菌属(enterococcus)细胞，例如对万古霉素(vancomycin)具有抗性。
[0149]
9. 任选地，靶细菌为肠杆菌科(enterobacteriaceae)细胞，例如对选自头孢菌素(cephalosporin)和碳青霉烯(carbapenem)的抗生素具有抗性。
[0150]
10. 任选地，靶细菌为大肠杆菌细胞，例如对选自甲氧苄啶(trimethoprim)、呋喃妥因(itrofurantoin)、头孢氨苄(cefalexin)和阿莫西林(amoxicillin)的抗生素具有抗性。
[0151]
11. 任选地，靶细菌为梭菌属(clostridium) (例如艰难梭菌)细胞，例如对选自氟喹诺酮(fluoroquinolone)抗生素和碳青霉烯(carbapenem)的抗生素具有抗性。
[0152]
12. 任选地，靶细菌为淋病奈瑟氏菌(neisseria gonnorrhoea)细胞，例如对选自头孢克肟(cefixime) (例如口服头孢菌素)、头孢曲松(ceftriaxone) (注射用头孢菌素)、阿奇霉素(azithromycin)和四环素(tetracycline)的抗生素具有抗性。
[0153]
13. 任选地，靶细菌为鲍曼不动杆菌(acinetoebacter baumannii)细胞，例如对
(sapibov5)，并发现其使用两种不同的、未描述的包装策略。sapibov5由典型的pac型辅助噬菌体或由cos型噬菌体包装于全尺寸的噬菌体样颗粒中，即其具有pac和cos位点两者，并使用两种不同的噬菌体编码的ters。这是由cos噬菌体进行sapi包装的一个实例，并且其中，它类似于大肠杆菌的p4质粒。金黄色葡萄球菌中的cos位点包装的另外独特之处在于除大末端酶亚基之外，其还需要仅由cos噬菌体携带的hnh核酸酶，用于cos位点切割和融化。
[0161]
几种噬菌体诱导性sapi及其辅助噬菌体的表征已经确定pac (或有头)机制用于进行衣壳化。与这一概念一致，一些sapi编码ters的同源物，其与噬菌体编码的大末端酶亚基terl复合，使得能够将sapi dna包装于由噬菌体蛋白组成的感染性颗粒中。这些还含有形态发生(cpm)模块，导致形成与小sapi基因组相称的小衣壳。在首次表征的sapi序列中，有几种不包括ters同源物或cpm同源物，并且几种随后从牛源中鉴定出的sapi和来自其他物种的许多噬菌体诱导性染色体岛也是如此。对于这几种岛，假定它们为最初拥有这些基因的元件的缺陷型衍生物，或者存在ters和cpm基因但未根据同源性识别。
[0162]
quiles
‑
puchalt et al观察到
ϕ
slt/sapibov5包装的一个重要特征为需要hnh核酸酶，其在
ϕ
slt末端酶模块近旁编码。携带hnh结构域的蛋白在自然界中广泛存在，存在于所有生物界。hnh基序为约30
‑
40 aa残基的简并小核酸结合和切割模块，并与单个二价金属离子结合。已经在多种酶中发现了hnh基序，这些酶在许多不同的细胞过程中发挥重要作用，所述细胞过程包括细菌杀伤；dna修复、复制和重组；以及与rna相关的过程。hnh核酸内切酶存在于革兰氏阳性和阴性细菌的许多cos位点噬菌体中，总是邻近编码末端酶和其他形态发生蛋白的基因。quiles
‑
puchalt et al已经证明，由
ϕ
12编码的hnh核酸酶和密切相关的
ϕ
slt具有非特异性核酸酶活性并且为包装这些噬菌体和sapibov5所需要的。quiles
‑
puchalt et al已经表明，hnh和terl为cos位点切割共同需要的。quiles
‑
puchalt et al还观察到，只有革兰氏阴性以及革兰氏阳性细菌的cos噬菌体编码hnh核酸酶，这符合对cos位点切割而不是pac位点切割的特殊要求，后者产生平末端产物。某些而非其他cos噬菌体需要hnh核酸酶活性这一证明表明，在两种类型噬菌体的terl蛋白之间存在差异——一种能够切割两条链，和另一种需要第二蛋白以能够产生双链切割。
[0163]
在备选方案中，每个生产细胞和/或靶细胞不是细菌而是古细菌细胞，并且不是存在噬菌体而是存在能够感染古细菌细胞的病毒(或者每个颗粒均包含这种病毒的衣壳(和任选地尾丝))。
[0164]
任选地，转导颗粒为非自我复制性颗粒。“非自我复制性转导颗粒”是指能够将编码抗菌剂或组分的核酸分子递送到细菌细胞中，但不将其自身复制的基因组包装到转导颗粒中的颗粒(例如噬菌体或噬菌体样颗粒；或从基因组岛(例如sapi)或其修饰形式产生的颗粒)。在本文的备选方案中，不是使用或包装噬菌体而是使用或包装感染动物、人类、植物或酵母靶细胞的病毒。例如，当靶细胞为人类细胞时为腺病毒。
[0165]
任选地，每个颗粒的基因组缺乏编码噬菌体结构蛋白的基因。这些可在产生期间由辅助噬菌体代替提供。任选地，每个颗粒的基因组缺乏一个或多个噬菌体基因rina、ters和terl。
[0166]
任选地，基因组岛为在靶和/或生产细菌细胞中天然存在的岛(并且任选地在本发明的颗粒中，基因组岛dna包含nsi)。在一个实例中，基因组岛选自sapi、sapi1、sapi2、sapibov1和sapibov2基因组岛。例如，岛为经修饰的致病岛。任选地，致病岛为天然存在于
靶和/或生产细菌细胞中的岛，例如葡萄球菌属(staphylococcus) sapi或弧菌属(vibrio) ple或铜绿假单胞菌(p. aeruginosa)致病岛(例如papi或pagi，例如papi
‑
1、pagi
‑
5、pagi
‑
6、pagi
‑
7、pagi
‑
8、pagi
‑
9、pagi
‑
10或pagi
‑
11)。任选地，致病岛为sapi (金黄色葡萄球菌(s aureus)致病岛)；任选地，在这种情况下，在生产期间使用辅助噬菌体，其中辅助噬菌体为φ11、80α、φ12或φslt。葡萄球菌属噬菌体80α似乎动员所有已知的sapi。因此，在一个实例中，每个颗粒的基因组包含经修饰的sapi和辅助噬菌体为80α。任选地，致病岛为霍乱弧菌(v.cholerae) ple (噬菌体诱导性染色体岛样元件)和任选地第一噬菌体为icp1。任选地，致病岛为大肠杆菌ple。
[0167]
任选地，每个颗粒基因组包含p4 dna，例如至少p4包装信号序列。颗粒可包含含有p4包装信号和nsi或抗菌手段的dna。在一个实施方案中，辅助噬菌体用于产生颗粒，其中辅助噬菌体为p2噬菌体或自我复制性缺陷型的经修饰的p2噬菌体；任选地作为生产细胞基因组中的原噬菌体存在。
[0168]
任选地，颗粒核酸的转录在组成型启动子的控制下，用于在靶细胞中转录抗菌剂或组分或nsi的拷贝。
[0169]
任选地，靶细胞中的组成型转录和产生可用于应当杀死靶细胞的情形，例如在医疗环境中。
[0170]
任选地，颗粒核酸的转录在诱导型启动子的控制下，用于在靶细胞中转录抗菌剂或组分或nsi的拷贝。
[0171]
例如，这可用于控制针对靶细菌细胞的抗菌活性的开启，比如在环境(例如土壤或水)中或在含有靶细胞的工业培养物或发酵容器中。例如，靶细胞可用于工业过程(例如用于发酵，例如在酿造或乳制品工业中)，并且诱导使得能够通过使用针对靶细菌的抗菌剂，控制(例如停止或减少)该过程。
[0172]
当抗菌剂包含多个组分时，例如其中抗菌剂为crispr/cas系统，或者为编码crrna的crispr阵列或编码可与靶细胞中的cas一起操作的引导rna (例如单指导rna)的核酸，其中crrna或grna将cas引导至细胞中的靶序列以修饰靶标(例如切割它或抑制其转录)。任选地，基因包含在靶细胞染色体和/或一个或多个细胞附加体中。
[0173]
任选地，抗菌剂为引导性核酸酶系统或其组分，其中抗菌剂能够识别和切割靶细胞dna (例如染色体dna)。
[0174]
在实例中，这种切割会导致以下中的一项或多项：
‑
(i) 靶细胞被抗菌剂杀死；(ii) 靶细胞的生长或增殖减少；和/或(iii) 使靶细胞对抗生素敏感，藉此抗生素对细胞具有毒性。
[0175]
任选地，引导性核酸酶系统选自crispr/cas系统、talen系统、大范围核酸酶系统或锌指系统。任选地，系统为crispr/cas系统并且每个颗粒基因组编码(a) 编码crrna的crispr阵列或(b) 编码引导rna (grna，例如单引导rna)的核酸，其中crrna或grna可与靶细胞中的cas一起操作，其中crrna或grna将cas引导至靶细胞中的靶核酸序列以修饰靶序列(例如切割它或抑制其转录)。任选地，cas为由靶细胞的功能性内源性核酸编码的cas。例如，靶标包含在靶细胞的dna或rna中。任选地，系统为crispr/cas系统并且每个颗粒基因组编码cas (例如cas核酸酶)，其可在靶细菌细胞中操作以修饰包含在靶细胞中的靶核酸序
列。
[0176]
本文中的任何cas可为cas3、cas9、cas13、casx、casy或cpf1。
[0177]
任选地，系统为crispr/cas系统并且每个颗粒基因组编码一种或多种cascade cas (例如cas a、b、c、d和e)。
[0178]
任选地，每个颗粒基因组进一步编码可在靶细菌细胞中与cascade cas一起操作的cas3。
[0179]
任选地，生产细胞和/或靶细胞为第一物种或菌株的细胞，其中第一物种或菌株为革兰氏阳性物种或菌株。
[0180]
任选地，生产细胞和/或靶细胞为第一物种或菌株的细胞，其中第一物种或菌株为革兰氏阴性物种或菌株。
[0181]
任选地，第一物种或菌株选自表6。例如，第一物种或菌株选自志贺氏菌属(shigella)、大肠杆菌、沙门氏菌属(salmonella)、沙雷菌属(serratia)、克雷伯氏菌属(klebsiella)、耶尔森氏菌属(yersinia)、假单胞菌属(pseudomonas)和肠杆菌属(enterobacter)。这些为p2噬菌体可感染的物种。因此，在一个实施方案中，颗粒基因组包含一个或多个p4序列(例如p4包装序列)并且基因组由p2噬菌体衣壳包装。因此，基因组由p2结构蛋白包装，并且所得转导颗粒可有效地感染广谱物种，即志贺氏菌属(shigella)、大肠杆菌、沙门氏菌属(salmonella)、沙雷菌属(serratia)、克雷伯氏菌属(klebsiella)、耶尔森氏菌属(yersinia)、假单胞菌属(pseudomonas)和肠杆菌属(enterobacter)中的两种或更多种。这提供一种广泛适用的递送平台，其中靶细胞抗菌特异性可通过基于特异性地靶向志贺氏菌属、大肠杆菌、沙门氏菌属、沙雷菌属、克雷伯氏菌属、耶尔森氏菌属、假单胞菌属和肠杆菌属组中的一种或多种预定物种的颗粒基因组引导rna的编码来实现。
[0182]“非复制性”或“复制性缺陷型”意指颗粒本身不能自我复制。例如，颗粒基因组缺乏编码产生转导颗粒所必需的蛋白(例如结构蛋白)的一个或多个核苷酸序列。
[0183]
在一个实例中，靶细胞的生长或增殖减少至少50、60、70、80、90或95%。
[0184]
在一个实例中，每个生产细胞和/或靶细胞选自葡萄球菌(staphylococcal)、弧菌属(vibrio)、假单胞菌属(pseudomonas)、梭菌属(clostridium)、大肠杆菌、螺杆菌属(helicobacter)、克雷伯氏菌属(klebsiella)和沙门氏菌属(salmonella)细胞。
[0185]
任选地，每个颗粒包含含有以下的质粒：a. 编码用于在靶细菌细胞中表达的抗菌剂或其组分的核苷酸序列；b. 用于控制抗菌剂或组分表达的组成型启动子；c. 任选的ters核苷酸序列；d. 复制起点(ori)；和e. 噬菌体包装序列(任选地pac、cos或其同源物)；和f. 缺乏以下的质粒g. 编码产生转导颗粒(任选地噬菌体)所必需的噬菌体结构蛋白的所有核苷酸序列，或者缺乏至少一个这种序列的质粒；和h. 任选地terl。
[0186]
任选地，抗菌剂为crispr/cas系统并且质粒编码crrna或引导rna (例如单一grna)，其可与靶细胞中的cas一起操作以将cas引导至靶核苷酸序列以修饰(例如切割)该
序列，藉此(a) 靶细胞被抗菌剂杀死；(b) 靶细胞的生长或增殖减少；或(c) 使靶细胞对抗生素敏感，藉此抗生素对细胞具有毒性。
[0187]
任选地，抗菌剂为crispr/cas系统并且质粒编码cas，其可与靶细胞中的crrna或引导rna (例如单一grna)一起操作以将cas引导至靶核苷酸序列以修饰(例如切割)该序列，藉此(a) 靶细胞被抗菌剂杀死；(b) 靶细胞的生长或增殖减少；或(c) 使靶细胞对抗生素敏感，藉此抗生素对细胞具有毒性。
[0188]
任选地，质粒进一步编码所述crrna或grna。
[0189]
提供可通过本发明方法获得的多种转导颗粒以用于医学，例如用于治疗或预防人类或动物受试者被靶细菌细胞感染，其中给予受试者转导颗粒以感染靶细胞并使用抗菌剂杀死细胞。
[0190]
任选地，颗粒用于给予人类或动物以用于医疗用途。
[0191]
本发明的进一步概念如下：
‑
本发明任选地用于工业或家庭用途，或者用于这种用途的方法中。例如，其用于或使用于农业、燃油或石油工业、食品或饮料工业、服装工业、包装工业、电子工业、计算机工业、环境工业、化学工业、航空航天工业、汽车工业、生物技术工业、医疗工业、医疗保健工业、牙科工业、能源工业、消费品工业、制药工业、采矿工业、清洁工业、林业、渔业、休闲工业、回收工业、化妆品工业、塑料工业、纸浆或造纸工业、纺织工业、服装工业、皮革或绒面革或动物皮工业、烟草工业或钢铁工业。
[0192]
本发明任选地用于工业或者环境为工业环境，其中工业为选自以下领域的工业：医疗和保健；制药；人类食品；动物食品；植物肥料；饮料；乳制品；肉类加工；农业；畜牧业；家禽养殖；鱼类和贝类养殖；兽医；燃油；气体；石化；水处理；污水处理；包装；电子和计算机；个人保健和洗漱用品；化妆品；牙科；非医疗牙科；眼科；非医疗眼科；矿产开采和加工；金属开采和加工；采石；航空；汽车；轨道；航运；空间；环境；土壤处理；纸浆和造纸；服装制造；染料；印刷；粘合剂；空气处理；溶剂；生物防御；维生素补充剂；冷藏；纤维浸渍和生产；生物技术；化学；工业清洁产品；家用清洁产品；肥皂和洗涤剂；消费产品；林业；捕鱼；休闲；回收；塑料；兽皮、皮革和绒面革；废物管理；殡葬事业；燃料；建筑；能源；钢铁；和烟草工业领域。
[0193]
在一个实例中，每个颗粒基因组包含编码靶向靶细菌的相应引导rna的crispr阵列，其中阵列包含一个或两个或更多个间隔区(例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或更多个间隔区)用于靶向靶细菌的基因组。
[0194]
在一个实例中，靶细菌包含在如下的环境中。在一个实例中，环境为人类的微生物组，例如口腔微生物组或肠道微生物组或血流。在一个实例中，环境不是人类体内或之上的环境。在一个实例中，环境不是非人动物体内或之上的环境。在一个实施方案中，环境为空气环境。在一个实施方案中，环境为农业环境。在一个实施方案中，环境为燃油或石油采收环境，例如燃油或石油田或井。在一个实例中，环境为用于人类或非人动物消费的食物或饮
料中或之上的环境。
[0195]
在一个实例中，环境为人类或动物微生物组(例如肠道、阴道、头皮、腋窝、皮肤或口腔微生物组)。在一个实例中，靶细菌包含在人类或动物微生物组(例如肠道、阴道、头皮、腋窝、皮肤或口腔微生物组)中。
[0196]
在一个实例中，将本发明的颗粒、群体或组合物鼻内、局部或口服给予人类或非人动物，或者用于这种给予。旨在治疗人类或动物微生物组的技术人员将能够根据感兴趣的微生物组确定最佳给予途径。例如，当微生物组为肠道微生物组时，可鼻内或口服给予。当微生物组为头皮或腋窝微生物组时，可局部给予。当微生物组在口腔或喉咙中时，可口服给予。
[0197]
在本文的任何用途或方法中，在一个实施方案中，本发明的颗粒以至少0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、300、400、500、600或700的感染复数(moi)与靶细菌接触。例如，moi为20
‑
200、20
‑
100、50
‑
200、50
‑
100、75
‑
150、100或约100、或者200或约200。在一个实例中，这可通过获得含有靶细菌的微生物组的样品(例如受试者的水道或肠道微生物组的样品)并确定样品中的cfu/ml或mg数量且使用它以期望的moi滴定待暴露于微生物组或给予待治疗的环境或受试者的噬菌体剂量来确定。
[0198]
在一个实例中，环境包含在饮料或水(例如供人类消费的水道或饮用水)或土壤中。水任选地在加热、冷却或工业系统中，或者在饮用水储存容器中。
[0199]
在一个实例中，生产细菌和/或靶细菌为选自以下的厚壁菌门(firmicutes)：厌氧棍状菌属(anaerotruncus)、厌氧发酵产氢细菌(acetanaerobacterium)、聚乙酸菌属(acetitomaculum)、醋弧菌属(acetivibrio)、厌氧球菌属(anaerococcus)、厌氧细杆菌属(anaerofilum)、厌氧弯曲菌属(anaerosinus)、厌氧棒状菌属(anaerostipes)、anaerovorax、丁酸弧菌属(butyrivibrio)、梭菌属(clostridium)、粪球菌属(capracoccus)、脱卤素杆菌属(dehalobacter)、小杆菌属(dialister)、多尔氏菌属(dorea)、肠球菌属(enterococcus)、产乙醇杆菌属(ethanoligenens)、栖粪杆菌属(faecalibacterium)、梭杆菌属(fusobacterium)、gracilibacter、guggenheimella、hespellia、毛形杆菌属(lachnobacterium)、毛螺旋菌属(lachnospira)、乳杆菌属(lactobacillus)、明串珠菌属(leuconostoc)、巨单胞菌属(megamonas)、moryella、光冈菌属(mitsuokella)、颤杆菌克属(oribacterium)、产醋杆菌属(oxobacter)、乳头杆属(papillibacter)、丙酸螺菌属(proprionispira)、假丁酸弧菌属(pseudobutyrivibrio)、假支杆菌属(pseudoramibacter)、罗氏菌属(roseburia)、瘤胃球菌属(ruminococcus)、八叠球菌属(sarcina)、清野氏菌属(seinonella)、shuttleworthia、sporobacter、sporobacterium、链球菌属(streptococcus)、罕见小球菌属(subdoligranulum)、互营球菌属(syntrophococcus)、栖热杆菌属(thermobacillus)、turibacter和魏斯氏菌属(weissella)。
[0200]
在一个实例中，颗粒、群体、组合物、用途或方法用于减少病原体感染或者用于重新平衡肠道或口腔微生物群，例如用于治疗或预防人类或动物的肥胖症或疾病。例如，颗粒、群体、组合物、用途或方法用于敲减人类或动物肠道微生物群中的艰难梭菌或大肠杆菌细菌。
[0201]
在一个实例中，疾病或病症为癌症、炎症性或自身免疫性疾病或病症，例如肥胖症、糖尿病、ibd (例如其中靶细胞为大肠杆菌或克雷伯氏菌属细胞)、gi道病症或口腔病症。
[0202]
任选地，环境包含在或靶细菌包含在肠道微生物群、皮肤微生物群、口腔微生物群、喉咙微生物群、毛发微生物群、腋窝微生物群、阴道微生物群、直肠微生物群、肛门微生物群、眼部微生物群、鼻部微生物群、舌头微生物群、肺部微生物群、肝脏微生物群、肾脏微生物群、生殖器微生物群、阴茎微生物群、阴囊微生物群、乳腺微生物群、耳部微生物群、尿道微生物群、唇微生物群、器官微生物群或牙齿微生物群中。任选地，环境包含在或靶细菌包含在植物(例如烟草、作物、果树、蔬菜植物或烟草，例如在植物表面上或包含在植物中)或环境(例如土壤或水或水道或水性液体)中。
[0203]
任选地，人类或动物受试者的疾病或病症选自：(a) 神经退行性疾病或病症；(b) 脑部疾病或病症；(c) cns疾病或病症；(d) 记忆丧失或损伤；(e) 心脏或心血管疾病或病症，例如心脏病发作、中风或心房颤动；(f) 肝脏疾病或病症；(g) 肾脏疾病或病症，例如慢性肾脏疾病(ckd)；(h) 胰腺疾病或病症；(i) 肺部疾病或病症，例如囊性纤维化或copd；(j) 胃肠疾病或病症；(k) 喉咙或口腔疾病或病症；(l) 眼部疾病或病症；(m) 生殖器疾病或病症，例如阴道、阴唇、阴茎或阴囊疾病或病症；(n) 性传播疾病或病症，例如淋病、hiv感染、梅毒或衣原体属(chlamydia)感染；(o) 耳部疾病或状况；(p) 皮肤病或病症；(q) 心脏病或病症；(r) 鼻部疾病或病症(s) 血液疾病或病症，例如贫血，例如慢性病或癌症性贫血；(t) 病毒感染；(u) 致病性细菌感染；(v) 癌症；(w) 自身免疫性疾病或病症，例如sle；(x) 炎症性疾病或病症，例如类风湿性关节炎、银屑病、湿疹、哮喘、溃疡性结肠炎、结肠炎、克罗恩病(crohn’s disease)或ibd；(y) 自闭症；(z) adhd；(aa) 双相型障碍(bipolar disorder)；
(bb) als [肌萎缩侧索硬化]；(cc) 骨关节炎；(dd) 先天性或发育缺陷或病症；(ee) 流产；(ff) 血液凝固病症；(gg) 支气管炎；(hh) 干性或湿性amd；(ii) 新血管形成(例如肿瘤或眼睛中的)；(jj) 普通感冒；(kk) 癫痫；(ll) 纤维化，例如肝脏或肺部纤维化；(mm) 真菌性疾病或病症，例如鹅口疮；(nn) 代谢性疾病或病症，例如肥胖症、厌食症、糖尿病、i型或ii型糖尿病。
[0204]
(oo) 溃疡，例如胃溃疡或皮肤溃疡；(pp) 干性皮肤；(qq) 干燥综合征(sjogren’s syndrome)；(rr) 细胞因子风暴；(ss) 耳聋、听力丧失或损伤；(tt) 缓慢或快速的新陈代谢(即比受试者的体重、性别和年龄的平均值更缓慢或更快速)；(uu) 受孕障碍，例如不育或生育力低；(vv) 黄疸；(ww) 皮疹；(xx) 川崎病(kawasaki disease)；(yy) 莱姆病(lyme disease)；(zz) 过敏，例如坚果、草、花粉、尘螨、猫或狗的皮毛或皮屑过敏；(aaa) 疟疾、伤寒、结核病或霍乱；(bbb) 抑郁症；(ccc) 智力低下；(ddd) 小头畸形；(eee) 营养不良；(fff) 结膜炎；(ggg) 肺炎；(hhh) 肺栓塞；(iii) 肺动脉高压；(jjj) 骨病；(kkk) 败血症或败血症性休克；(lll) 鼻窦炎；(mmm) 应激(例如职业性应激)；
(nnn) 地中海贫血、贫血、血管性血友病(von willebrand disease)或血友病；(ooo) 带状疱疹或感冒疮(cold sore)；(ppp) 月经；(qqq) 精子计数低。
[0205]
用于通过本发明治疗或预防的神经退行性或cns疾病或病症在一个实例中，神经退行性或cns疾病或病症选自阿尔茨海默病(alzheimer disease)、老年精神病、唐氏综合征(down syndrome)、帕金森病(parkinson's disease)、克雅氏病(creutzfeldt
‑
jakob disease)、糖尿病性神经病、帕金森综合征(parkinson syndrome)、亨廷顿病(huntington's disease)、马查多
‑
约瑟夫病(machado
‑
joseph disease)、肌萎缩侧索硬化、糖尿病性神经病和克罗伊茨费尔特
‑
雅各布病(creutzfeldt creutzfeldt
‑ꢀ
jakob disease)。例如，疾病为阿尔茨海默病(alzheimer disease)。例如，疾病为帕金森综合征。
[0206]
在一个实例中，其中本发明的方法对人类或动物受试者实施以治疗cns或神经退行性疾病或病症，方法导致受试者的treg细胞下调，从而促进系统性单核细胞衍生的巨噬细胞和/或treg细胞穿过脉络丛进入受试者的大脑，藉此治疗、预防疾病或病症(例如阿尔茨海默病)或者减缓其进展。在一个实施方案中，方法导致受试者的cns系统(例如大脑和/或csf)中的ifn
‑
γ增加。在一个实例中，方法恢复神经纤维和/或减少神经纤维损伤的进展。在一个实例中，方法恢复神经髓鞘和/或减缓神经髓鞘损伤的进展。在一个实例中，本发明的方法治疗或预防wo2015136541中公开的疾病或病症和/或方法可与wo2015136541中公开的任何方法一起使用(该文献的公开内容通过参考以其全部结合至本文中，例如用于提供这种方法、疾病、病症和潜在治疗剂的公开，这些治疗剂可给予受试者以实现cns和神经退行性疾病和病症的治疗和/或预防，例如治疗剂比如免疫检查点抑制剂，例如抗pd
ꢀ‑
1、抗pd
‑
l1、抗tim3或其中公开的其他抗体)。
[0207]
用于通过该方法治疗或预防的癌症可治疗的癌症包括没有血管化的或基本上没有血管化的肿瘤以及血管化的肿瘤。癌症可包括非实体肿瘤(比如血液肿瘤，例如白血病和淋巴瘤)或者可包括实体肿瘤。待用本发明治疗的癌症类型包括(但不限于)癌、母细胞瘤和肉瘤，以及某些白血病或淋巴系统恶性肿瘤、良性和恶性肿瘤(malignant tumour)以及恶性肿瘤(malignancies)，例如肉瘤、癌和黑色素瘤。成人肿瘤/癌症和儿科肿瘤/癌症也包括在内。
[0208]
血液癌症为血液或骨髓的癌症。血液学(或造血性)癌症的实例包括白血病，包括急性白血病(比如急性淋巴细胞白血病、急性髓细胞白血病、急性髓性白血病和髓母细胞、早幼粒细胞性、髓单核细胞性、单核细胞性和红白血病)、慢性白血病(比如慢性髓细胞性(粒细胞性)白血病、慢性髓性白血病和慢性淋巴细胞白血病)、真性红细胞增多症、淋巴瘤、霍奇金病(hodgkin's disease)、非霍奇金淋巴瘤(non
‑
hodgkin's lymphoma) (惰性和高级别形式)、多发性骨髓瘤、瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症(waldenstrom's macroglobulinemia)、重链病、骨髓增生异常综合征、毛细胞白血病和脊髓发育不良。
[0209]
实体肿瘤为通常不含囊肿或液体区域的异常组织团块。实体肿瘤可为良性或恶性的。不同类型的实体肿瘤以形成它们(比如肉瘤、癌和淋巴瘤)的细胞类型命名。实体肿瘤(比如肉瘤和癌)的实例包括纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤、骨肉瘤和其他肉瘤、
滑膜瘤、间皮瘤、尤因氏肿瘤(ewing's tumour)、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、结肠癌、淋巴系统恶性肿瘤、胰腺癌、乳腺癌、肺癌、卵巢癌、前列腺癌、肝细胞癌、鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺癌、汗腺癌、甲状腺髓样癌、甲状腺乳头状癌、嗜铬细胞瘤皮脂腺癌、乳头状癌、乳头状腺癌、髓样癌、支气管肺癌、肾细胞癌、肝癌、胆管癌、绒毛膜癌、维尔姆斯肿瘤(wilms' tumour)、宫颈癌、睾丸肿瘤、精原细胞瘤、膀胱癌、黑色素瘤和cns肿瘤(比如胶质瘤(比如脑干胶质瘤和混合性胶质瘤)、胶质母细胞瘤(也称为多形性胶质母细胞瘤)、星形细胞瘤、cns淋巴瘤、生殖细胞瘤、髓母细胞瘤、神经鞘瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、松果体瘤、血管母细胞瘤、听神经瘤、少突胶质细胞瘤、脑膜瘤、神经母细胞瘤、视网膜母细胞瘤和脑转移瘤)。
[0210]
用于通过该方法治疗或预防的自身免疫性疾病1. 急性播散性脑脊髓炎(adem)2. 急性坏死性出血性白质脑炎3. 艾迪生病(addison’s disease)4. 无丙种球蛋白血症5. 斑秃6. 淀粉样变性7. 强直性脊柱炎8. 抗gbm/抗tbm肾炎9. 抗磷脂综合征(aps)10. 自身免疫性血管性水肿11. 自身免疫性再生障碍性贫血12. 自身免疫性自主神经功能障碍13. 自身免疫性肝炎14. 自身免疫性高脂血症15. 自身免疫性免疫缺陷16. 自身免疫性内耳疾病(aied)17. 自身免疫性心肌炎18. 自身免疫性卵巢炎19. 自身免疫性胰腺炎20. 自身免疫性视网膜病21. 自身免疫性血小板减少性紫癜(atp)22. 自身免疫性甲状腺疾病23. 自身免疫性荨麻疹24. 轴突和神经元神经病(axonal & neuronal neuropathies)25. 巴洛病(balo disease)26. 白塞氏病(behcet’s disease)27. 大疱性类天疱疮28. 心肌病29. 卡斯尔曼病(castleman disease)30. 乳糜泻
31. 恰加斯病(chagas disease)32. 慢性疲劳综合征33. 慢性炎症性脱髓鞘性多发性神经病(cidp)34. 慢性复发性多灶性骨髓炎(crmo)35. churg
‑
strauss综合征(churg
‑
strauss syndrome)36. 瘢痕性类天疱疮/良性黏膜类天疱疮37. 克罗恩病(crohn’s disease)38. 科干综合征(cogans syndrome)39. 冷凝集素病40. 先天性心脏阻滞41. 柯萨奇心肌炎(coxsackie myocarditis)42. crest病43. 特发性混合型冷球蛋白血症44. 脱髓鞘性神经病45. 疱疹样皮炎46. 皮肌炎47. 德维克病(devic’s disease) (视神经脊髓炎)48. 盘状狼疮49. 德雷斯勒综合征(dressler’s syndrome)50. 子宫内膜异位51. 嗜酸性食管炎52. 嗜酸性筋膜炎53. 结节性红斑54. 实验性变应性脑脊髓炎55. 埃文斯综合征(evans syndrome)56. 纤维肌痛57. 纤维化性肺泡炎58. 巨细胞动脉炎(颞动脉炎)59. 巨细胞性心肌炎60. 肾小球肾炎61. 肺出血
‑
肾炎综合征(goodpasture’s syndrome)62. 肉芽肿性多血管炎(gpa) (以前称为韦格纳肉芽肿(wegener’s granulomatosis))63. 格雷夫斯病(graves
’ꢀ
disease)64. 吉兰
‑
巴利综合征(guillain
‑
barre syndrome)65. 桥本脑炎(hashimoto’s encephalitis)66. 桥本甲状腺炎(hashimoto’s thyroiditis)67. 溶血性贫血68. 亨诺
‑
许兰紫癜(henoch
‑
schonlein purpura)
69. 妊娠疱疹70. 低丙种球蛋白血症71. 特发性血小板减少性紫癜(itp)72. iga肾病73. igg4相关的硬化性疾病74. 免疫调节性脂蛋白75. 包涵体肌炎76. 间质性膀胱炎77. 幼年关节炎78. 幼年型糖尿病(1型糖尿病)79. 幼年肌炎80. 川崎综合征(kawasaki syndrome)81. 兰伯特
‑
伊顿综合征(lambert
‑
eaton syndrome)82. 白细胞碎裂性血管炎83. 扁平苔藓84. 硬化性苔藓85. 木样结膜炎86. 线状iga病(lad)87. 狼疮(sle)88. 莱姆病(lyme disease)，慢性89. 梅尼埃病(meniere’s disease)90. 显微镜下多血管炎91. 混合性结缔组织病(mctd)92. 莫伦氏溃疡(mooren’s ulcer)93. 穆夏
‑
哈伯曼病(mucha
‑
habermann disease)94. 多发性硬化95. 重症肌无力96. 肌炎97. 发作性睡病98. 视神经脊髓炎(德维克(devic’s))99. 中性粒细胞减少症100. 眼部瘢痕性类天疱疮101. 视神经炎102. 复发性风湿病103. pandas (儿童链球菌属相关性自身免疫性神经精神障碍)104. 副肿瘤性小脑变性105. 阵发性睡眠性血红蛋白尿(pnh)106. 帕罗综合征(parry romberg syndrome)107. 牧师
‑
特纳综合征(parsonnage
‑
turner syndrome)
108. 扁平部睫状体炎(pars planitis) (周边葡萄膜炎)109. 天疱疮110. 周围神经病111. 静脉周围脑脊髓炎112. 恶性贫血113. poems综合征114. 结节性多动脉炎115. i、ii、iii型自身免疫性多腺体综合征116. 风湿性多肌痛117. 多发性肌炎118. 心肌梗塞后综合征119. 心包切开术后综合征120. 孕酮皮炎121. 原发性胆汁性肝硬化122. 原发性硬化性胆管炎123. 银屑病124. 银屑病关节炎125. 特发性肺纤维化126. 坏疽性脓皮病127. 单纯红细胞再生障碍性贫血128. 雷诺现象(raynauds phenomenon)129. 反应性关节炎130. 反射性交感神经营养不良131. 赖特综合征(reiter’s syndrome)132. 复发性多软骨炎133. 不宁腿综合征134. 腹膜后纤维化135. 风湿热136. 类风湿性关节炎137. 结节病138. 施密特综合征(schmidt syndrome)139. 巩膜炎140. 硬皮病141. 干燥综合征(sjogren’s syndrome)142. 精子和睾丸自身免疫143. 僵人综合症(stiff person syndrome)144. 亚急性细菌性心内膜炎(sbe)145. 苏萨克综合征(susac’s syndrome)146. 交感性眼炎
10
10
个本发明的转导颗粒。在一个实例中，本发明的任何组合物每ml或mg包含至少1 x 10
11
个本发明的转导颗粒。在一个实例中，本发明的任何组合物每ml或mg包含至少1 x 10
12
个本发明的转导颗粒。在一个实例中，本发明的任何组合物每ml或mg包含至少1 x 10
13
个本发明的转导颗粒。在一个实例中，本发明的任何组合物每ml或mg包含至少1 x 10
14
个本发明的转导颗粒。
[0212]
在一个实例中，本发明的任何组合物每ml或mg包含多达1 x 10
14
个本发明的转导颗粒，比如当组合物包含在流体(例如液体)或固体中时。在一个实例中，本发明的任何组合物每ml或mg包含多达1 x 10
13
个本发明的转导颗粒。在一个实例中，本发明的任何组合物每ml或mg包含多达1 x 10
12
个本发明的转导颗粒。在一个实例中，本发明的任何组合物每ml或mg包含多达1 x 10
11
个本发明的转导颗粒。在一个实例中，本发明的任何组合物每ml或mg包含多达1 x 10
10
个本发明的转导颗粒。在一个实例中，本发明的任何组合物每ml或mg包含多达1 x 109个本发明的转导颗粒。
[0213]
在一个实例中，本发明的任何组合物每ml或mg包含至少1 x 103‑
1 x 10
10
、1 x 10
11
、1 x 10
12
、1 x 10
13
或1 x 10
14
个本发明的转导颗粒，比如当组合物包含在流体(例如液体)或固体中时。在一个实例中，本发明的任何组合物每ml或mg包含至少1 x 104‑
1 x 10
10
、1 x 10
11
、1 x 10
12
、1 x 10
13
或1 x 10
14
个本发明的转导颗粒。在一个实例中，本发明的任何组合物每ml或mg包含至少1 x 105‑
1 x 10
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、1 x 10
11
、1 x 10
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、1 x 10
13
或1 x 10
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个本发明的转导颗粒。在一个实例中，本发明的任何组合物每ml或mg包含至少1 x 106‑
1 x 10
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、1 x 10
11
、1 x 10
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、1 x 10
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或1 x 10
14
个本发明的转导颗粒。在一个实例中，本发明的任何组合物每ml或mg包含至少1 x 107‑
1 x 10
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、1 x 10
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、1 x 10
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、1 x 10
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或1 x 10
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个本发明的转导颗粒。在一个实例中，本发明的任何组合物每ml或mg包含至少1 x 108‑
1 x 10
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、1 x 10
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、1 x 10
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、1 x 10
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或1 x 10
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个本发明的转导颗粒。在一个实例中，本发明的任何组合物每ml或mg包含至少1 x 109‑
1 x 10
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、1 x 10
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、1 x 10
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、1 x 10
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或1 x 10
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个本发明的转导颗粒。在一个实例中，本发明的任何组合物每ml或mg包含至少1 x 10
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‑
1 x 10
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、1 x 10
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、1 x 10
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、1 x 10
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或1 x 10
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个本发明的转导颗粒。在一个实例中，本发明的任何组合物每ml或mg包含至少1 x 10
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1 x 10
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、1 x 10
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、1 x 10
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、1 x 10
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或1 x 10
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个本发明的转导颗粒。在一个实例中，本发明的任何组合物每ml或mg包含至少1 x 10
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‑
1 x 10
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、1 x 10
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、1 x 10
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、1 x 10
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或1 x 10
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个本发明的转导颗粒。在一个实例中，本发明的任何组合物每ml或mg包含至少1 x 10
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、1 x 10
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或1 x 10
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个本发明的转导颗粒。在一个实例中，本发明的任何组合物每ml或mg包含至少1 x 10
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‑
1 x 10
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、1 x 10
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、1 x 10
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、1 x 10
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或1 x 10
14
个本发明的转导颗粒。
[0214]
在一个实例中，组合物包含一个或多个剂量的本发明转导颗粒，用于给予受试者以用于医疗用途，例如治疗或预防受试者的疾病或病症。在一个实例中，组合物包含单一剂量。在一个实例中，组合物包含(或至少包含) 2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个剂量。在一个实例中，每个剂量为(或至少为) 0.5、1、2、3、4、5、10、20、25、30、40、50、75、100、125、200或250 mg或ml包含所述噬菌体的剂量(即剂量为所述量并且包含例如噬菌体和赋形剂、稀释剂或载剂)。
[0215]
在一个实例中，组合物包含一个或多个剂量的本发明转导颗粒，用于给予受试者以用于非医疗用途，例如农业用途。在一个实例中，组合物包含单一剂量。在一个实例中，组
合物包含(或至少包含) 2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个剂量。在一个实例中，每个剂量为(或至少为) 0.5、1、2、3、4、5、10、20、25、30、40、50、75、100、125、200、250、500、750、1000、2000、3000、4000、5000、10000、50000、100000 mg或ml包含所述噬菌体的剂量(即剂量为所述量并且包含例如噬菌体和赋形剂、稀释剂或载剂)。在用于与靶细菌接触之前，可使剂量溶解或稀释于溶剂(例如水性溶剂或水)中。在一个实例中，1英制加仑包含一个剂量的本发明转导颗粒，例如用于农业用途，例如作物喷洒，或用于动物或牲畜用途，比如用作饮料。
[0216]
任选地，nsi包含在高拷贝数质粒中。任选地，nsi包含在中拷贝数质粒中。低、中和高拷贝数ori和质粒的含义为技术人员已知的并且这些为技术术语。如技术人员已知的，拷贝数表示每个细胞的平均质粒拷贝数。例如，低拷贝数质粒为每个其中包含质粒的细菌细胞中以1
‑
10个拷贝存在的质粒；中拷贝数质粒以每个细胞11
‑
50 (例如11
‑
40或20
‑
30或40)个拷贝存在；和高拷贝数为每个细胞>50 (例如多达100、200、250、300、400、500、600或700)个拷贝。在一个实例中，包含第一dna的质粒或载体为中拷贝数质粒或载体。在一个实例中，包含第一dna的质粒或载体为高拷贝数质粒或载体。常见ori和质粒的一个实例如表8所示。
实施例
[0217]
实施例1：通过抑制噬菌体再吸收增加转导颗粒的产生背景本研究涉及含有感兴趣的dna序列的转导颗粒的产生，其中颗粒可有效地用于感染靶细菌以引入dna用于在靶细菌中表达。这些颗粒可将其dna注入到与颗粒设计所基于的初始噬菌体相同组的细菌菌株中。噬菌体颗粒与宿主细胞的结合需要细胞表面存在一种或多种特定分子，从而提供噬菌体受体。我们惊奇地看到颗粒产生的产量有很大增加。尽管不希望受到任何理论的束缚，但从生产细胞的表面消除噬菌体受体可防止产生的颗粒再吸收，从而显著增加产量。
[0218]
方法和结果我们使用经充分研究的p2噬菌体/大肠杆菌系统作为模型。为了鉴定p2受体突变体，我们在标准软琼脂覆盖斑点测试中测试了一组来自keio集合的单敲除突变体(“construction of escherichia coli k
‐
12 in
‐
frame, single
‐
gene knockout mutants: the keio collection”, tomoya baba et al, doi 10.1038/msb4100050, molecular systems biology (2006) 2, 2006.0008)的p2斑块形成。在培养皿中制备lb琼脂，并覆盖3 ml软琼脂覆盖层(lb 0.6%琼脂)，其中含有100 ul过夜细胞培养物。将p2病毒噬菌体溶解产物点于平板上，并在37℃下过夜温育之后检查平板的斑块形成。我们发现p2不会在一组参与lps核心生物合成的rfa突变体上形成斑块(图1)。
[0219]
为了构建受体缺失突变体以进行进一步研究，我们使用lambda red系统在大肠杆菌c1a p2溶原性细菌中用zeocin抗性标记物替换rfad基因(“one
‑
step inactivation of chromosomal genes in escherichia coli k
‑
12 using pcr products”, kirill a. datsenko和barry l. wanner, pnas 2000年6月6日 97 (12) 6640
‑
6645; https://doi.org/10.1073/pnas.120163297)。使用引物rfadupr (seq id no: 1)和rfaddnr (seq id no: 2)对质粒pem7/zeo (invitrogen)的zeocin标记物进行pcr扩增。大肠杆菌c1a p2
溶原性细菌细胞用携带lambda red系统的质粒kd46 (genbank: mf287367.1)进行转化。转化体在30℃下于含有100 ug/ml氨苄青霉素的lb中生长至对数中期，并用0.4%阿拉伯糖诱导2小时。细胞用20%甘油洗涤，并用含有zeo标记物的pcr片段进行电穿孔。在还消除具有温度敏感复制的pkd46质粒的37℃下于lb zeo平板上选择重组体。用zeo标记物对rfad基因的正确替换经过序列验证。
[0220]
亲代菌株(c1a p2溶原性细菌)和受体突变体(c1a p2溶原性细菌
△
rfad)两者均用含有以下的质粒转化：(i) 阿拉伯糖诱导型p4噬菌体反式激活区(以诱导p2辅助物起作用)，(ii) p4包装位点，(iii) 壮观霉素抗性标记物，和(iv) clodf13复制起点。
[0221]
为了比较在两种菌株中获得的转导颗粒的产量，将过夜细胞培养物在含有50 μg/ml壮观霉素、10 mm mgso4和5 mm cacl2的lb培养基中1:25稀释。在37℃下振荡90分钟之后，向培养物中加入0.8%阿拉伯糖。由于染色体p2噬菌体的诱导，细胞在3小时之后溶解。通过离心去除细胞碎片，并用氯仿提取溶解产物以去除任何剩余的细胞。
[0222]
通过测量壮观霉素标记物的转导来量化生产的产量。溶解产物在含有10 mm mgso4和5 mm cacl2的lb培养基中以100 μl体积连续稀释(10倍步骤)，并将稀释液与100 μl过夜大肠杆菌c1a细胞培养物混合。在37℃下30 分钟之后，将10 μl的每个样品点于lb壮观霉素平板上。过夜温育之后计数菌落。结果如图2所示。
[0223]
结论：去除噬菌体受体出人意料地将转导颗粒的产量提高至多于100倍。因此，本发明可大大降低转导颗粒或噬菌体的生产成本。
[0224]
表4:沙门氏菌属和铜绿假单胞菌噬菌体的特定宿主受体.
表5: 序列序列以5’到3’方向书写.
表7: sapis
int，整合酶：na，不适用；s. aureus，金黄色葡萄球菌；s. haemolyticus，溶血性葡萄球菌；s. saprophyticus，腐生葡萄球菌。
[0225]
*baba et al.
36
提出的命名法。
‡
lindsay和holden
37
使用的命名法。
§
该菌株尚未测序，因此sapi1的基因组位置未知。
ii
由于已在溶血性链球菌基因组中记录的主要染色体倒位，shpi2位于与具有相同att核心序列的其他sapi相距180
°
。
¶
genbank登记号nc 007622。
[0226]
表8: 实例质粒和拷贝数