富含海藻糖的酵母提取物的制作方法

1.本发明涉及一种用于制备富含海藻糖的酵母提取物的方法，所述方法包含通过使用一种或更多种蛋白酶酶促破坏酵母细胞的步骤。本发明还涉及一种通过本发明方法可得的新型富含海藻糖的酵母提取物。基于干物质，所述新型富含海藻糖的酵母提取物包含至少15% (w/w)的量的海藻糖。本发明也涉及所述新型富含海藻糖的酵母提取物作为添加剂在化妆品、药物、食物或饮料产品中的用途。


背景技术：

2.海藻糖，一种非还原性的葡萄糖二糖，可见于许多生物体例如植物、昆虫、细菌和酵母中。它充当贮藏碳水化物，也充当对抗不同形式胁迫的保护剂。尤其是，海藻糖对质膜有稳定效果，且增加细胞对抗干燥、脱水、温度变化和高温的抵抗能力。
3.虽然海藻糖仅有蔗糖甜度的一半，但由于其有利特性，该糖常用作食物和饮料中的添加剂。海藻糖是一种抗氧化剂且充当天然防腐剂，由此延长食物和饮料的保存期限。除此之外，其保持食物湿润且帮助保持质地和风味，减少苦味且掩盖异味。出于这些原因，海藻糖在工业上作为添加剂广泛使用以提升食物和饮料的品质。
4.现有技术中描述了用于海藻糖生产的不同工艺。例如，描述了从酵母提取海藻糖的工艺，其中所述工艺包含酵母细胞中海藻糖的积累以及随后通过h2so4或乙醇对该糖的提取。在koch & koch (1925)；stewart等人(1950)；yoshikawa等人(1994)；steiner & cori (1935)；chuanbin等人(1998)；kanji & yumi, (1992)中描述了此类提取工艺。遗憾的是，这些工艺不仅费时、费力及昂贵，而且与海藻糖低产率相关联。另外，因为糖的提取涉及溶剂或酸的使用，由这些工艺产生的环境负担也很重。出于这些原因，现在海藻糖通常使用酶α
‑
1,4
‑
d
‑
葡聚糖磷酸化酶和海藻糖磷酸化酶的组合由玉米淀粉制备。然而，虽然这些工艺更环境友好，但其仍费力且昂贵，导致高成本。
5.因此，对于生产可用作食物和饮料中添加剂的含海藻糖组合物的新方法有需要。所述含海藻糖组合物应可以技术上不复杂且不昂贵的方式生产而不使用潜在有害物质。特别是应避免有机溶剂的使用。


技术实现要素：

6.海藻糖，也称为α
‑
d
‑
吡喃葡萄糖基
‑
[1,1]
‑
α
‑
d
‑
吡喃葡萄糖苷，为一种自然界中广泛分布的非还原性二糖。海藻糖在酸性条件下比蔗糖更稳定，而因此常用于口香糖中。虽然相比蔗糖，海藻糖的甜化能力更弱，但因为海藻糖在摄入后仅对血糖水平有较低影响，其在食物中非常优选。以下描绘了海藻糖的结构式。
[0007]
一方面，本发明基于以下见解，即包含富含海藻糖的酵母提取物的组合物是一种对于大量应用特别有利的产品，其中基于干物质，所述富含海藻糖的酵母提取物具有至少15%(w/w)的海藻糖含量。另一方面，本发明基于以下发现，即此类提取物可通过以下如本文规定的方法以可再现方式很容易地制备。
[0008]
因此，第一方面，本发明涉及一种用于制备富含海藻糖的酵母提取物的方法，基于干物质，该富含海藻糖的酵母提取物包含至少15% (w/w)的海藻糖含量，所述方法包含：（a）在合适培养基中使酵母细胞发酵；（b）使酵母细胞经受非生物胁迫；（c）使酵母细胞经受至少70℃的温度以灭活酵母酶；（d）用至少一种蛋白酶或肽酶培育酵母细胞；以及（e）在肽酶处理后移除不溶性细胞组分；以及（f）得到所述富含海藻糖的酵母提取物。
[0009]
在以上方法的第一步骤中，在合适培养基中使酵母细胞发酵。用于使酵母发酵的培养基和方法在本领域广泛知晓且可从不同制造商购得。合适的培养基包含例如sigma aldrich (taufkirchen, 德国)的ypd培养基。大量其他培养基可从不同制造商购得。
[0010]
酵母细胞可在本领域知晓的标准条件下培养。例如，所述细胞可在烧瓶中25
‑
35℃间的温度下正常培养。可在搅拌下持续培养直到达到预定的细胞密度。细胞密度优选通过在600 nm处的光密度(od600)测量。优选在使细胞经受非生物胁迫前将细胞培养至od600为0.8 到 1.0。
[0011]
可用于本发明方法的酵母类型不特别受限。合适的酵母细胞可包含，例如：属于酵母属(saccharomyces)的酵母，例如酿酒酵母(s. cerevisiae)、薛瓦酵母(s. chevalieri)、布拉氏酵母(s. boulardii)、贝酵母(s. bayanus)、意大利酵母(s. italicus)、德尔布酵母(s. delbrueckii)、罗斯酵母(s. rosei)、微球酵母(s. microellipsodes)、卡尔斯伯酵母(s. carlsbergensis)、二孢酵母(s. bisporus)、发酵性酵母(s. fermentati)、鲁氏酵母(s. rouxii)或葡萄汁酵母(s. uvarum)；属于裂殖酵母属(schizosaccharomyces)的酵母，例如日本裂殖酵母(s. japonicus)、s. kambucha、八孢裂殖酵母(s. octosporus)或粟酒裂殖酵母(s. pombe)；属于汉逊酵母属(hansenula)的酵母，例如温奇汉逊酵母(h. wingei)、h. arni、亨氏汉逊酵母(h. henricii)、美洲汉逊酵母(h. americana)、加拿大汉逊酵母(h. canadiensis)、h. capsulata或多形汉逊酵母(h. polymorpha)；属于假丝酵母属(candida)的酵母，例如白色假丝酵母(c. albicans)、产朊假丝酵母(c. utilis)、博伊丁假丝酵母(c. boidinii)、星形假丝酵母(c. stellatoidea)、无名假丝酵母(c. famata)、热带假丝酵母(c. tropicalis)、光滑假丝酵母(c. glabrata)或近平滑假丝酵母(c. parapsilosis)；属于毕赤酵母属(pichia)的酵母，例如巴斯德毕赤酵母(p. pastoris)、克鲁维毕赤酵母(p. kluyveri)、p. polymorpha、
巴氏毕赤酵母(p. barkeri)、喜仙人掌毕赤酵母(p. cactophila)、罗丹毕赤酵母(p. rhodanensis)、p. cecembensis、p. cephalocereana、角百灵毕赤酵母(p. eremophilia)、发酵毕赤酵母(p. fermentans)或库德毕赤酵母(p. kudriavzevii)；属于克鲁维酵母属(kluyveromyces)的酵母，例如马克斯克鲁维酵母(k. marxianus)；以及属于球拟酵母属(torulopsis)的酵母，例如牛球拟酵母(t. bovina)或光滑球拟酵母(t. glabrata)。
[0012]
在一个优选实施方案中，在以上方法的步骤（a）中发酵的酵母细胞属于酵母属。在一个特别优选的实施方案中，所述酵母细胞属于酿酒酵母种。
[0013]
如果从以上方法得到的提取物意图用于食物品类，则可以任选地在步骤（a）或（b）后用碱性缓冲液、比如氢氧化钠缓冲液洗涤细胞。这样的洗涤步骤可用于减少来自该工艺的酵母提取物的味道。如果本发明方法包括用碱性缓冲液洗涤的步骤，则该方法也包括至少一个随后的用水洗涤步骤以确保残留的碱性缓冲液被移除。例如，如果酵母细胞用一定体积的碱性缓冲液洗涤，则其随后用两倍体积的水洗涤。
[0014]
达到足够细胞密度（通常od600为1.0）后，在所述方法的步骤（b）中使酵母细胞经受非生物胁迫。非生物胁迫可包括：在高温或低温下培育细胞，加入潜在有毒化合物如乙醇，或在培养基中应用高渗条件，比如高盐或糖浓度。在一个特别优选的实施方案中，步骤（b）中的非生物胁迫通过培育所述细胞到高温来施加。这可通过在发酵期结束时提高培养温度实现。在一个优选实施方案中，培养温度增加5℃以上、10℃以上或15℃以上。
[0015]
在一个特别优选的实施方案中，在以上方法的步骤（a）中在25℃到 35℃温度下培养酵母细胞直到达到想要的密度，然后将酵母培养物的温度增加10℃，到35℃到45℃间的胁迫温度。在一个甚至更优选的实施方案中，在以上方法的步骤（a）中在约30℃的温度下培养酵母细胞，然后转换至40℃的胁迫温度。增加的胁迫温度将保持至少30分钟、60分钟、90分钟、120分钟、150分钟、180分钟、210分钟、240分钟、270分钟或300分钟。在一个实施方案中，胁迫温度为40℃以上，且将在以上方法的步骤b期间保持240分钟以上。
[0016]
然后在随后的步骤（c）中，使酵母细胞经受至少70℃的温度以灭活会催化细胞中累积的海藻糖分子分解的酵母酶。在此步骤期间，温度可为，例如，约75℃、约80℃、约 85℃、约90℃、约95℃或甚至更高。在酶灭活温度下酵母细胞的培育将优选实施至少10分钟、至少20分钟、至少30分钟、至少60分钟或更长。特别优选在至少70
°
c温度下培育至少60分钟。在一些实施方案中，酶灭活温度可保持超过60分钟，例如至少90分钟、120分钟、150分钟、180分钟、210分钟、240分钟、270分钟或 300 分钟。特别优选在至少90℃温度下培育1
‑
4小时。甚至更优选在至少90℃温度下培育2
‑
3小时。
[0017]
酶灭活之后，在以上方法的步骤（d）中酵母细胞被溶解。出于此目的，用至少一种对使酵母细胞细胞壁碎裂有效的肽酶培育从以上方法的步骤（c）得到的酵母细胞。如本文所使用，术语“肽酶”指催化蛋白质或肽降解的蛋白水解活性酶。该术语意在包括肽酶和蛋白酶二者。
[0018]
用于本发明方法中合适的肽酶包括内肽酶和外肽酶二者。如本文所使用，“内肽酶”指能降解蛋白质或肽中的内部肽键的任何酶。相反，“外肽酶”为能降解位于蛋白质或肽末端之一处的肽键的酶。
[0019]
在一个优选实施方案中，以上方法的步骤（d）中的溶解包括使用至少一种内肽酶。在另一个优选实施方案中，以上方法的步骤（d）中的溶解包括使用至少一种外肽酶。在另一
个优选实施方案中，以上方法的步骤（d）中的溶解包括使用至少一种内肽酶和至少一种外肽酶。例如，溶解包括使用内肽酶和外肽酶的混合物。例如，以上方法的步骤（d）中的酵母细胞的溶解可通过加入包含内肽酶和外肽酶二者的酶混合物实现。
[0020]
要用在本发明工艺中的肽酶可源于不同来源。例如，肽酶可来源于真菌、植物或动物来源。商业上可得的肽酶的例子包含flavourzyme
®ꢀ
(novozymes a/s)、proteax (amano enzyme inc.)、prohydrolase (deerland enzymes inc.)、sumizyme lpl
‑
g (shin nihon chemical co. ltd.)、flavorpro 795 mdp (biocatalysts ltd.)、foodpro alkaline protease (danisco a/s)或其他。由不同制造商提供的其他酶也可使用。
[0021]
优选地，肽酶培育在干物质含量为约4
‑
20%、优选约6
‑
18%且更优选约8
‑
16%下实施。组合物（比如酵母细胞培养物）的干物质含量可使用商业上可得装置，例如moisture analyzer (mettler
‑
toledo gmbh, gie
ß
en, 德国)，依照标准程序确定。一旦确定了起始酵母细胞培养物的干物质含量，其可通过稀释或浓缩培养物来调整至预定值。
[0022]
取决于所选用于分解酵母细胞蛋白质的肽酶，可能需要调整混合物的合适ph以便提供蛋白质酶促分解的最佳条件。取决于肽酶，步骤（d）可在ph 3
‑
10范围内的条件下实施，优选在ph 4
‑
9的范围内。
[0023]
肽酶或肽酶混合物可以按组合物总干物质计0.1到5.0% (w/w)的肽酶的浓度加入到酵母细胞悬浮液中。优选地，所述浓度为按组合物总干物质计0.2到4.0% (w/w)的肽酶，更优选0.3到3.0%，比如2.0%。用肽酶或肽酶混合物在容许细胞壁蛋白质分解的条件下培育酵母细胞。这些条件将优选包含约30
‑
65℃之间的温度，更优选约40
‑
60℃之间，比如50
‑
55℃。
[0024]
反应时间将取决于若干因素，例如，酶加入时的细胞密度，酶加入的量以及培育温度。培育时间可在30分钟到24小时间，但通常将在1
‑
12小时范围内，比如在2
‑
8小时间或最优选在4
‑
6小时间。最优条件可由技术人员通过常规实验确定。
[0025]
酵母细胞被肽酶处理破坏后，在以上方法的步骤（e）中从不溶性部分分离可溶性部分。不溶性部分主要含有细胞壁组分、细胞器和未溶解细胞。从不溶性部分分离可溶性部分可通过不同方法实施，包括离心、过滤和其他方法。
[0026]
在一个简单实施方案中，包含经破坏酵母细胞的细胞溶解物(经稀释或未经稀释的)经受在例如 2,000 到25,000 g下的离心以沉淀不溶性物质。得到了包含包括累积海藻糖的可溶性细胞组分的上清液，且上清液优选冷却至低于20℃直到进一步使用。或者，不溶性物质的移除可通过使用保留所述不溶性化合物的过滤材料的标准过滤实现。例如，可实施使用孔径≤3 μm的过滤器的死端过滤。也可用交叉流或切向流过滤以避免过滤器的堵塞或结垢。在所有情况下，过滤器孔径必须小于3
ꢀµ
m以保留酵母细胞和细胞碎片。
[0027]
在以上方法的步骤（f）中，得到富含海藻糖的酵母提取物且可任选地进一步处理。例如，酵母提取物可被灭菌或干燥。在一个优选实施方案中，水性提取物被灭菌。灭菌可通过热处理、紫外光照射或其他常见技术实现。例如，灭菌可通过过滤水相穿过孔径为0.22
ꢀµ
m或更小的过滤器实现。
[0028]
在一个特别优选的实施方案中，本发明的工艺，即以上由步骤（a）
‑
（f）规定的工艺，不涉及任何有机溶剂(如乙醇或丙醇)或酸(如硫酸)。特别地，本发明的工艺不涉及利用任何有机溶剂或酸的海藻糖提取步骤。
[0029]
在另一个优选实施方案中，干燥水性提取物。提取物的干燥可通过例如冷冻干燥或喷雾干燥实现。喷雾干燥的原理基于将溶液分散成细小的液滴，其被引导入热空气流中。溶剂从底物液滴蒸发，从而保留干产品簇。可使用标准喷雾干燥装置，比如来自b
ü
chi labortechnik gmbh (essen, 德国)的mini spray dryer b
‑
290或来自gea (berlin, 德国)的mobile minor
™ꢀ
spray dryer。
[0030]
冷冻干燥或冻干为从产品移除水以延长保存期限的工艺。冷冻干燥包含冷冻产品以及降低压力以容许材料中的冷冻水升华。可应用各种方法使产品冷冻。例如，冷冻可通过使用标准冷冻器或冷却浴实现。冷却产品至低于其三相点确保加热时会发生升华。为防止可能破坏要被干燥的产品结构的大晶粒形成，冷冻快速进行。当冷冻水升华时，产品中约95%的水被移除。大多数材料可被干燥至1
‑
5%残留水分。可使用标准冷冻干燥装置，比如来自gea (berlin, 德国)的lyovac
™ꢀ
装置、来自christ (osterode am harz, 德国)的gamma 2
‑
20 freeze dryer lcm
‑
1 或来自fisher scientific gmbh (schwerte, 德国)的christ martin
™ꢀ
alpha 1
‑
2 lyophilisator。
[0031]
另一方面，本发明提供了一种可通过以上描述的方法、即包含步骤（a）到（f）的方法得到的富含海藻糖的酵母提取物。基于干物质，所述提取物包含至少15% (w/w)的海藻糖含量。优选地，基于干物质，所述海藻糖含量为至少30%、至少35%、至少40%或至少45% (w/w)。所述提取物不包括任何外部加入的糖，特别是无外部加入的海藻糖。这意味着提取物中全部海藻糖的量来源于酵母细胞。海藻糖含量优选通过megazyme, wicklow, 爱尔兰的“trehalose assay kit”测量。
[0032]
另一个方面，本发明提供一种富含海藻糖的酵母提取物，基于干物质，其包含至少15%、至少20%、至少25% (w/w)的海藻糖含量。优选地，基于干物质，所述海藻糖含量为至少30%、至少35%、至少40%或至少45% (w/w)。例如，基于干物质，所述海藻糖含量可为至少16%、至少17%、至少18%、至少19%、至少20%、至少21%、至少22%、至少23%、至少24%、至少25%、至少26%、至少27%、至少28%、至少29%或至少30% (w/w)。基于干物质，所述提取物的蛋白质含量为至少20%、至少25%、至少30%或至少40% (w/w)。所述提取物不包括任何外部加入的糖，特别是无外部加入的海藻糖。这意味着提取物中全部海藻糖的量来源于酵母细胞。
[0033]
基于干物质，本发明富含海藻糖的酵母提取物优选包含1
‑
30% (w/w)间的rna含量，比如在2
‑
25% (w/w)间、3
‑
20% (w/w)间、 4
‑
15% (w/w)间、5
‑
10% (w/w)间或
ꢀꢀ6‑
8% (w/w)间。基于干物质，本发明的酵母提取物优选还包含0.1
‑
5% (w/w) 之间的量的nacl，比如0.2
‑
4% (w/w)间、0.5
‑
2.5% (w/w)间或1
‑
2% (w/w)间。基于干物质，本发明富含海藻糖的酵母提取物的脂肪含量优选在1
‑
10% (w/w)间，比如在2
‑
7% (w/w)间或在3
‑
5% (w/w)间。基于干物质，本发明的酵母提取物的灰分含量优选在1
‑
20% (w/w)间，比如 3
‑
15% (w/w)间、5
‑
10% (w/w)间或6
‑
8% (w/w)间。
[0034]
富含海藻糖的酵母提取物进一步以高蛋白质含量为特征。基于干物质，提取物的蛋白质含量为至少20%、至少25%、至少30%或至少40% (w/w)。蛋白质优选由kjeldahl的标准方法确定，例如通过使用kjeltec
™ꢀ
8400 装置 (foss gmbh, hamburg, 德国)。
[0035]
在一个特别优选的实施方案中，本发明富含海藻糖的酵母提取物包含：(a) 基于干物质，至少20%，更优选至少25% (w/w)的海藻糖含量；以及(b) 基于干物质，至少20%，更优选至少25% (w/w)的蛋白质含量；以及
(c) 基于干物质，1
‑
10% (w/w)间的脂肪含量；以及(d) 基于干物质，1
‑
30% (w/w)间的rna含量。
[0036]
另一个方面，本发明提供了包含如本文描述的富含海藻糖的酵母提取物的药物组合物、化妆品组合物、食物产品或饮料产品。优选地，这些组合物和产品不包括来自除所述富含海藻糖的酵母提取物之外的来源的任何海藻糖。
[0037]
补充有本文描述的富含海藻糖的酵母提取物的化妆品组合物可包括糖浆(比如止咳糖浆)和片剂。
[0038]
补充有本文描述的富含海藻糖的酵母提取物的化妆品组合物可包括护肤凝胶、乳液或霜。在这些组合物中，海藻糖可支持所述组合物渗透皮肤。
[0039]
富含海藻糖的酵母提取物可添加到的食物或饮料产品不特别受限。原则上，所有不同类型的食物或饮料产品可通过加入本文别处描述的富含海藻糖的酵母提取物来优化。富含海藻糖的酵母提取物可添加到的合适食物产品包括但不限于乳制品（例如酸奶）、烘焙产品（例如面包、饼干）、布丁、水果制品、番茄酱、沙司、调味品、冰淇淋、早餐麦片、巧克力、糖果、水果或酒胶糖、糖食、蛋糕、果酱和果冻、巧克力酱或榛子酱等等。
[0040]
富含海藻糖的酵母提取物可添加到的饮料包括但不限于：调味水，果汁喷趣酒，乳制品基饮料例如饮用酸奶、酪乳、酸乳酒，果汁，柠檬水，能量运动饮料，茶例如冰茶、甜茶、速溶茶以及即饮茶，咖啡例如冰咖啡、调味咖啡、速溶咖啡以及即饮咖啡，大豆基饮料，奶饮品例如调味奶饮品（例如香草
‑
、巧克力
‑
或草莓
‑
调味的），加甜粉末饮料，含咖啡因或不含咖啡因的软饮料等等。在一个特别优选的实施方案中，富含海藻糖的酵母提取物添加到的产品为奶饮品，优选为豆奶饮品。
[0041]
食物或饮料产品可包括在食物和营养技术领域常用的另外组分。例如，食物和饮料产品可包含其他甜味剂，例如葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、乳糖、阿斯巴甜、糖精、三氯蔗糖或糖醇。组合物还可包含维生素或香料，比如橘子、香草、柠檬或草莓香料。其他常见添加剂包括着色剂、乳化剂、稳定剂、调质剂(texturizer)、防腐剂、抗氧化剂、增稠剂等等。
[0042]
最后一方面，本发明涉及如本文描述的酵母提取物作为添加剂在化妆品、药物、食物或饮料产品中的用途。
附图说明
[0043]
图1示出了根据本发明用于制备富含海藻糖的酵母提取物粉末且依照以下本文描述的实施例1制备的一个优选实施方案的示意性纵览。
实施例
[0044]
提供以下实施例以阐释本发明。然而应理解本发明的范围不受限于所述实施例。技术人员将理解在不偏离本发明范围的情况下可作出若干修改。
[0045]
实施例1：富含海藻糖的酵母提取物的制备酿酒酵母株atcc 204508在30℃下在ypd培养基（1%酵母提取物、2%蛋白胨和2%葡萄糖）中生长过夜。第二天早晨，将新鲜ypd培养基加入到酵母细胞以提供0.1的od600。在30℃下培养细胞直到达到1.0的od600。随后，通过将生长温度从30℃提高到40℃持续4小时，使得指数生长的酵母细胞培养物经受热冲击。使用标准分离器收获酵母细胞且用水洗涤两
次。
[0046]
以此方式，得到了有约18%的干物质和基于干物质为约9% (w/w)的海藻糖浓度的酵母细胞底物。酵母底物被加热至90℃持续1小时以灭活固有酵母酶。然后，以基于干物质酵母底物为0.5% (w/w)的浓度加入肽酶(corolase 7089, ab enzymes gmbh, darmstadt, 德国)。使用moisture analyzer (mettler
‑
toledo gmbh, gie
ß
en, 德国)确定干物质含量。
[0047]
水解反应在剧烈搅拌下于55℃培育3小时。使用10%氢氧化钠溶液维持ph在ph 7。然后使用标准实验室离心机（10分钟、4700 g、室温、heraeus multifuge x3r, thermofisher scientific）分离水解混合物。移除固体颗粒以得到水性的富含海藻糖的酵母提取物。
[0048]
为了得到干燥粉末产品，水相接着通过加热至90℃持续30分钟灭菌，且使用恒定输入温度在133
‑
136℃间且输出温度为93
±
2℃的来自b
ü
chi labortechnik gmbh (essen, 德国)的mini spray dryer b
‑
290喷雾干燥。分析最终粉末产品的海藻糖含量，得到为干物质的25.3% (w/w)的海藻糖浓度。