保护心肌细胞免受应激损伤的saRNA及其应用的制作方法

保护心肌细胞免受应激损伤的sarna及其应用
技术领域
1.本发明涉及一种sarna、含有该sarna的药物组合物以及它们的应用。具体而言，本发明涉及一种用于保护心肌细胞免受应激损伤的sarna、含有该sarna作为活性成分的药物组合物、所述sarna和药物组合物在制备用于保护心肌细胞免受应激损伤的药物中的应用以及利用所述sarna和药物组合物保护心肌细胞免受应激损伤的方法。


背景技术：

2.由双链rna(double-stranded rna，dsrna)所介导的基因表达沉默现象被称为rna干扰(rna interference，rnai)。随着研究深入，rnai的机制已逐渐被阐明。外源导入的长dsrna、小发夹rna(small hairpin rna，shrna)以及小干扰rna(small interfering rna，sirna)在胞浆内经过一定的加工，最终发挥活性的形式均为活化的sirna，长度约为21-23nt。活化的sirna结合dicer及trbp(transactivator rna binding protein)，并招募ago2(argonaute 2)共同构成rna诱导的沉默复合体(rna-induced silencing complex，risc)。sirna的先导链(反义链)进入ago2，从属链则被ago2切割失去活性，组成活化的risc。活化的risc在先导链的引导下，与靶mrna上的靶序列互补配对，进而对其进行切割，在转录后水平下调靶基因的表达水平。
3.近年来，有报道指出，在研究钙调素(e-cadherin)靶向的dsrna对启动子区表观遗传状态的调控时，发现外源导入的钙调素dsrna在pc-3细胞中使钙调素mrna表达水平出现显著上调。随后，在p21(p21waf1/cip1)和血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，vegf)两个基因中也发现了类似的现象。该现象在不同的人类肿瘤细胞系中的探索都得到了相似的结果，证明这并不是某个细胞系中的偶然现象，而是一种序列特异性的规律性改变。这种具有激活靶基因特性的dsrna与下调靶基因表达水平的sirna相比具有不同的靶点性质和功能，而在结构上具有高度的相似性，因此，这种可与特定基因启动子序列结合并激活基因表达的长约21nt的双链小rna被命名为小激活rna(small activating rna，sarna)。此类rna激活(rna activation，rnaa)现象的发现和sarna功能的鉴定填补了小rna领域研究的空白，证明了小rna正向调控作用的存在，构建起了完整的rna功能研究网络。
4.目前，已报道了sarna在抑制肿瘤生长和促进肿瘤细胞凋亡方面的作用，但距离最终在临床实践中广泛应用还有较长的距离，需要更多的基础研究和临床证据给予支持。另一方面，虽然sarna技术在肿瘤领域获得了较大的进展，但是在心血管领域尚未进行相关的探索。考虑到从理论上讲，sarna可基于rnaa这一机制以序列特异性的方式激活任何感兴趣的目的基因的表达，从而达到治疗疾病的目的，将sarna应用于心血管领域(例如用于防止心肌肥厚刺激和缺氧刺激等应激引起的损伤甚至更严重的心血管疾病)，将会有重要的理论意义和实践意义。


技术实现要素：

5.为解决上述课题，本发明在大鼠心肌细胞系中筛选了能够激活心肌肥厚相关基因dusp12以及缺氧应激相关基因hspa1a的sarna，分别转染sarna进行靶基因表达的激活，在此基础上分别给予心肌肥厚刺激和缺氧刺激，发现激活靶基因对处于应激条件下的细胞产生了良好的保护作用，因而为细胞保护提供了一种有效的新方法，由此完成了本发明。
6.在第一方面，本发明提供了一种用于保护心肌细胞免受应激损伤的sarna，其特征在于，所述sarna为针对心肌肥厚相关基因dusp12和/或缺氧应激相关基因hspa1a的sarna。
7.优选地，所述sarna针对所述心肌肥厚相关基因dusp12和/或缺氧应激相关基因hspa1a的转录起始位点上游2000bp以内的dna序列来设计。
8.更优选地，所述针对心肌肥厚相关基因dusp12和/或缺氧应激相关基因hspa1a的sarna为如下sarna中的一个或多个：
9.sarna 1：cccauuggauccuucuguu(seq id no.1)；
10.sarna 2：gcaccaaagacacucguau(seq id no.2)；
11.sarna 4：gcaggacaccauuguagau(seq id no.4)；及
12.sarna d：gcagcaguaucacgccuuu(seq id no.8)。
13.在第二方面，本发明提供了一种用于保护心肌细胞免受应激损伤的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物含有如第一方面所述的针对心肌肥厚相关基因dusp12和/或缺氧应激相关基因hspa1a的sarna作为活性成分以及药学上可接受的载体。
14.在第三方面，本发明提供了一种用于保护心肌细胞免受应激损伤的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒含有如第一方面所述的针对心肌肥厚相关基因dusp12和/或缺氧应激相关基因hspa1a的sarna和/或如第二方面所述的药物组合物。
15.在第四方面，本发明提供了如第一方面所述的针对心肌肥厚相关基因dusp12和/或缺氧应激相关基因hspa1a的sarna和/或如第二方面所述的药物组合物在制备用于保护心肌细胞免受应激损伤的药物中的应用。
16.在第五方面，本发明提供了一种保护心肌细胞免受应激损伤的方法，其特征在于，所述方法包括将如第一方面所述的针对心肌肥厚相关基因dusp12和/或缺氧应激相关基因hspa1a的sarna和/或如第二方面所述的药物组合物导入所述心肌细胞。
17.优选地，所述保护心肌细胞免受应激损伤的方法可以在体外(in vitro)、离体(ex vivo)或在体内(in vivo)进行。
18.优选地，在本发明的第一方面直至第五方面中，所述应激选自于心肌肥厚刺激和/或心肌缺氧刺激，即，保护心肌细胞免受应激损伤是指防止心肌细胞因遭受心肌肥厚刺激和/或心肌缺氧刺激而引起的损伤；更优选地，所述心肌肥厚刺激是血管紧张素ⅱ(angiotensin ii，angii)刺激，所述心肌缺氧刺激是心肌缺血刺激、心室压力或容量过负荷刺激、血管紧张素刺激、血管加压素刺激和/或异丙肾上腺素刺激。
19.优选地，在本发明的第一方面直至第五方面中，所述心肌细胞为大鼠h9c2心肌细胞。
20.有益效果
21.一方面，通过对心肌细胞给予dusp12启动子靶向sarna转染处理，可以在mrna水平激活dusp12表达，进而可以抑制心肌肥厚相关分子标志物的表达上调，表明本发明的sarna
具有保护心肌细胞免受应激损伤(例如防止心肌细胞因遭受心肌肥厚刺激(例如angii刺激)而引起的损伤)、在心肌肥厚逆转的过程中发挥作用的潜能。另一方面，通过在缺氧前对心肌细胞给予hspa1a启动子靶向sarna转染处理，可以诱导hspa1a表达显著上调，保护心肌细胞免受应激损伤(例如防止心肌细胞因遭受缺氧刺激而引起的损伤)，表明本发明的sarna具有较强的心肌细胞保护作用。由此，将本发明的sarna应用于心血管领域(例如用于防止心肌肥厚刺激和缺氧刺激等应激引起的损伤甚至更严重的心血管疾病)将会有重要的理论意义和实践意义。
22.本发明的其它特征和优点将在下述具体实施方式中予以详细说明。
附图说明
23.图1示出了sarna预激活抗心肌细胞肥大的示意性方案。
24.图2示出了qrt-pcr检测h9c2细胞系中sarna对靶基因dusp12的激活效果。*p《0.05vs nc组。nc：阴性对照。
25.图3示出了qrt-pcr检测sarna转染对anp表达水平的改变：a.转染sarna 1细胞的anp表达水平改变；b.转染sarna 2细胞的anp表达水平改变；c.转染sarna 4细胞的anp表达水平改变。*p《0.05vs nc组；#p《0.05vs nc angii组。nc：阴性对照。
26.图4示出了qrt-pcr检测sarna转染对β-mhc表达水平的改变：a.转染sarna 1细胞的β-mhc表达水平改变；b.转染sarna 2细胞的β-mhc表达水平改变；c.转染sarna 4细胞的β-mhc表达水平改变。*p《0.05vs nc组；#p《0.05vs nc angii组。nc：阴性对照。
27.图5示出了qrt-pcr检测h9c2细胞系中sarna在不同工作浓度下对靶基因hspa1a的激活效果：a.sarna在20nm的工作浓度下对靶基因的激活效果；b.sarna在50nm的工作浓度下对靶基因的激活效果。*p《0.05vs nc组。nc：阴性对照。
28.图6示出了qrt-pcr以及mts检测h9c2细胞系中sarna的心肌保护作用的功能检测：a.qrt-pcr检测sarna d对靶基因hspa1a的激活效果；b.缺氧处理24h后sarna d的心肌保护作用。*p《0.05vs nc组。nc：阴性对照。
29.图7示出了流式细胞学检测h9c2细胞系中sarna的心肌保护作用的功能检测(缺氧24h)：a.nc组细胞流式细胞学结果；b-e.sarna d不同转染浓度的流式细胞学结果；f.流式细胞学的统计学结果。*p《0.05vs nc组。nc：阴性对照。
30.图8示出了sarna d心肌保护作用的机制探索结果：a.western blot检测sarna对hspa1a的激活和jnk的调控；b.western blot检测sarna对hspa1a激活的统计结果；c.western blot检测sarna对p-jnk激活的统计结果。*p《0.05vs nc组。nc：阴性对照。
具体实施方式
31.以下对本发明的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。
32.一.本发明的sarna
33.本发明的sarna是针对心肌肥厚相关基因dusp12和/或缺氧应激相关基因hspa1a的sarna。在一些优选的实施方式中，本发明的sarna是sarna 1、sarna 2、sarna 4和sarna d(分别如seq id no.1、seq id no.2、seq id no.4和seq id no.8所示)，但本发明不限于
此。
34.本领域技术人员知晓的是，可以通过本领域常规的sarna设计方法或在线网站(例如利用invitrogen的sirna设计软件(block-it
tm rnai designer))得到本发明所述的针对心肌肥厚相关基因dusp12和/或缺氧应激相关基因hspa1a的sarna的序列。进而，基于本发明，本领域技术人员也能够从中获得可用于保护心肌细胞免受应激损伤的sarna。
35.本发明的sarna含有核苷酸基团作为基本结构单元，所述核苷酸基团含有磷酸基团、核糖基团和碱基。在本发明的sarna中，正义链和反义链的3’端还可根据需要连接有垂悬末端(overhang)dtdt。
36.本发明的sarna还可以含有修饰的核苷酸基团，所述修饰的核苷酸基团不会导致所述sarna激活基因表达的功能明显削弱或丧失。迄今为止，本领域存在多种可用于修饰sarna的方式，包括骨架修饰(如磷酸基团修饰)、核糖基团修饰及碱基修饰等(watts,j.k.,g.f.deleavey,and m.j.damha,chemically modified sarna:tools and applications.drug discov today,2008.13(19-20):p.842-55)。在本发明所述sarna的一些实施方式中，所述修饰的核苷酸基团为核糖基团以及任选的磷酸基团被修饰的核苷酸基团，但不限于此。
37.本领域技术人员还知晓的是，可以通过本领域常规的sarna制备方法(例如固相合成和液相合成)得到本发明所述的sarna，例如sarna1、sarna 2、sarna 4和sarna d。其中，固相合成已经有商业化订制服务。或者，可以通过使用具有相应修饰的核苷酸单体来将修饰的核苷酸基团引入本发明所述的sarna中，制备具有相应修饰的核苷酸单体的方法及将修饰的核苷酸基团引入sarna的方法也是本领域技术人员所熟知的。
38.二.本发明的药物组合物
39.在本发明的药物组合物中，含有本发明所述的sarna和药学上可接受的载体。所述药学上可接受的载体可以是sarna给药领域常规使用的载体，例如但不限于磁性纳米粒(magnetic nanoparticles，如fe3o4、fe2o3)、碳纳米管(carbon nanotubes)、介孔硅(mesoporous silicon)、磷酸钙纳米粒(calcium phosphate nanoparticles)、聚乙烯亚胺(polyethylenimine，pei)、聚酰胺胺型树形高分子(polyamidoamine(pamam)dendrimer)、聚l-赖氨酸(poly(l-lysine)，pll)、壳聚糖(chitosan)、1,2-二油酰基-3-三甲铵丙烷(1,2-dioleoyl-3-trimethylammonium-propane，dotap)、聚d型或l型乳酸/羟基乙酸共聚物(poly(d&l-lactic/glycolic acid)copolymer，plga)、聚(2-氨乙基乙撑磷酸酯)(poly(2-aminoethyl ethylene phosphate)，ppeea)和聚(甲基丙烯酸-n,n-二甲氨基乙酯)(poly(2-dimethylaminoethyl methacrylate)，pdmaema)以及它们的衍生物等。在本发明的药物组合物中，对sarna和药学上可接受的载体的含量没有特别要求，一般而言，sarna与药学上可接受的载体的重量比为1:(1-50)。
40.在本发明的药物组合物中，还可以额外包含药学上可接受的其它辅料，该辅料可以为本领域常规采用的各种制剂或化合物中的一种或多种。例如，所述药学上可接受的其它辅料可以包括ph值缓冲液、保护剂和渗透压调节剂中的至少一种。所述ph值缓冲液可以为ph值7.5-8.5的三羟甲基胺基甲烷盐酸盐缓冲液和/或ph值5.5-8.5的磷酸盐缓冲液，优选为ph值5.5-8.5的磷酸盐缓冲液。所述保护剂可以为肌醇、山梨醇、蔗糖、海藻糖、甘露糖、麦芽糖、乳糖和葡糖糖中的至少一种。以所述药物组合物的总重量为基准，所述保护剂的含
量可以为0.01-30重量％。所述渗透压调节剂可以为氯化钠和/或氯化钾。所述渗透压调节剂的含量使所述药物组合物的渗透压为200-700毫渗摩尔/千克。根据所需渗透压，本领域技术人员可以容易地确定所述渗透压调节剂的含量。
41.根据本发明的一些实施方式，所述药物组合物可以为液体制剂，例如注射液；也可以为冻干粉针剂，实施给药时与液体辅料混合，配制成液体制剂。所述液体制剂可以但不限于用于皮下、肌肉或静脉注射给药。
42.三.本发明的试剂盒
43.在本发明的试剂盒的一些实施方式中，可使一个容器用于提供sarna、至少另一个容器用于提供药学上可接受的载体和/或辅料。除了sarna和药学上可接受的载体和/或辅料以外，所述试剂盒中还可包含其它成分，如稳定剂或防腐剂等。所述其它成分可包含于所述试剂盒中，但存在于与提供sarna和药学上可接受的载体和/或辅料的容器均不同的容器中。在这些实施方式中，所述试剂盒可包含用于将sarna与药学上可接受的载体和/或辅料或其它成分进行混合的说明书。
44.在本发明的试剂盒中，所述sarna和药学上可接受的载体和/或辅料可以通过任何形式来提供，例如液体形式、干燥形式或冻干形式。优选所述sarna和药学上可接受的载体和/或辅料基本上纯净和/或无菌。可任选地在本发明的试剂盒中提供无菌水。
45.四.本发明的sarna和药物组合物的应用
46.通过将本发明的sarna和/或药物组合物给予有需要的受试者或心肌细胞，可通过rnaa机制达到保护心肌细胞免受应激损伤的目的。因此，本发明的sarna和/或药物组合物可用于保护心肌细胞免受应激损伤或用于制备用于保护心肌细胞免受应激损伤的药物。
47.本文所使用的术语“细胞应激”是指当细胞处于不利环境或遇到有害刺激时所产生的防御反应或适应性反应。细胞应激的基本过程包括(1)细胞感受应激原的刺激；(2)启动细胞内应激反应相关信号转导通路；(3)改变细胞内一些转录因子的活性；(4)促进应激反应相关基因的快速表达；以及(5)应激相关基因促进细胞的存活或凋亡。应激主要包括热应激、氧化应激(由活性氧或自由基造成的细胞应激)、基因毒应激(由dna损伤引起的细胞应激，包括自发的dna损伤以及各种应激原的作用如紫外线、电离辐射、病毒感染、化学诱变剂等)、缺氧应激(单纯性的缺氧或缺血缺氧可诱发缺氧应激)以及由引发组织炎症及重构反应的生物因子等引起的应激，但本发明不限于此。
48.细胞在经受应激之后，在损伤比较轻的细胞中会诱导保护性蛋白的生成，增强细胞对应激原的抵抗力(防止细胞损伤、修复损伤)；而在损伤比较严重的细胞中则会诱导细胞生长抑制、凋亡(对于dna损伤的细胞而言，细胞凋亡的重要意义在于可防止细胞恶性转化和肿瘤形成)自噬、坏死等。相应地，本文所使用的术语“应激损伤”是指因细胞遭受应激而引起的任何损伤，包括但不限于细胞形态损伤、细胞dna损伤和/或细胞功能损伤等。从更广义的角度而言，本文所使用的术语“应激损伤”还包括因细胞损伤之后造成的任何组织损伤、器官损伤和/或机体损伤等。
49.在本发明的一些优选实施方式中，保护心肌细胞免受应激损伤是指防止心肌细胞因遭受心肌肥厚刺激和/或心肌缺氧刺激而引起的损伤。在本发明的一些更为优选的实施方式中，所述心肌肥厚刺激是血管紧张素ⅱ(angiotensin ii，angii)刺激。在本发明的一些更为优选的实施方式中，所述心肌缺氧刺激是心肌缺血刺激、心室压力或容量过负荷刺
激、血管紧张素刺激、血管加压素刺激和/或异丙肾上腺素刺激。
50.本文所使用的术语“给药/给予”是指通过使得至少部分地将sarna或药物组合物定位于期望位点以产生期望效果的方法或途径，将sarna或药物组合物放置入受试者体内或心肌细胞内。在本发明的各种实施方式中，保护心肌细胞免受应激损伤的方法可以在体外、离体或在体内进行；相应地，可以在体外、离体或在体内进行本发明的sarna和/或药物组合物的给药。本领域技术人员知晓sarna或其药物组合物的给药方法。例如，在体内进行本发明的sarna和/或药物组合物的给药的情况下，适于本发明方法的给药途径包括局部给药和全身给药。一般而言，局部给药导致与受试者整个身体相比将更多sarna或药物组合物递送至特定位点；而全身给药导致将所述sarna或药物组合物递送至受试者的基本整个身体。考虑到本发明旨在提供防止心肌肥厚和缺氧损伤引起的心血管疾病的手段，优选能够将sarna或药物组合物递送至心血管的给药方式。
51.可通过本领域已知的任何合适途径向心肌细胞给药，例如通过转染的方式。同样，可通过本领域已知的任何合适途径向受试者给药，所述途径包括但不仅限于：口服或胃肠外途径，包括静脉内给药、肌肉内给药、皮下给药、经皮给药、气道给药(气雾剂)、肺部给药、鼻部给药、直肠给药和局部给药(包括口腔含化给药和舌下给药)。
52.本发明所述的sarna或药物组合物的使用剂量可为本领域常规的剂量，所述剂量可以根据各种参数、尤其是受试者的年龄、体重和性别来确定。可在细胞培养或实验动物中通过标准药学程序测定毒性和疗效，例如测定ld
50
(使50％的群体致死的剂量)和ed
50
(在量反应中指能引起50％最大反应强度的剂量，在质反应中指引起50％实验对象出现阳性反应时的剂量)。毒性和疗效之间的剂量比为治疗指数，可以用ld
50
/ed
50
的比值来表示。优选显示出高治疗指数的sarna或药物组合物。可基于由细胞培养分析和动物研究得到的数据得出人用剂量的范围。
53.在给予本发明所述的药物组合物时，例如，对于雄性或雌性、6-12周龄、体重18-25g的c57bl/6j或c3h/hencrlvr小鼠，以所述药物组合物中的sarna的量计：(i)对于sarna与药学上可接受的载体形成的药物组合物，其sarna用量可以为0.001-50mg/kg体重，优选为0.01-10mg/kg体重，更优选为0.05-5mg/kg体重，最优选为0.1-3mg/kg体重。在给予本发明所述的sarna时，可参考上述用量。
54.实施例
55.接下来通过实施例对本发明进行更详细的说明，但本发明不限于这些实施例。除非特别说明，所用到的试剂、培养基均为市售商品，所用到的核酸电泳、实时pcr等操作均按常规方案进行。例如，可按molecular cloning(cold spring harbor laboratory press(1989))所记载的进行。
56.材料
57.rna寡核苷酸：上海吉玛制药技术有限公司。rna寡核苷酸干粉使用depc水溶解，贮存浓度100μm，使用浓度20μm。
58.hsp70抗体(ab89827)：abcam，英国。
59.celltiteraqueous单溶液细胞增殖检测试剂盒(g3582)：promega公司，美国。
60.annexin v-fitc/pi凋亡检测试剂盒(40303es60)：上海翊圣生物科技有限公司。
61.h9c2细胞系：购自北京协和医学院细胞资源中心。
62.大鼠h9c2心肌细胞系的培养、传代、转染和缺氧处理
63.1)细胞培养：培养基为dmem高糖培养基(10％胎牛血清、100u/ml青霉素及100μg/ml链霉素)；培养条件为37℃、5％co2。
64.2)细胞传代：细胞汇合密度达到80％时，弃去培养基，10cm培养皿中加入37℃预热的胰酶1.0ml，将培养皿置于温箱中2min，取出后培养皿中加入培养基(fbs 10％、37℃预热)5ml中和胰酶，将全部细胞悬液转移至15ml离心管，离心(室温300g、5min)，弃去上清，加入3ml培养基重悬混匀后平均种于三个新的10cm皿中，每皿定容11ml。
65.3)细胞转染：细胞于转染前24h接种于6孔板中，密度2
×
105/孔。24h后弃去含血清培养基，更换为opti-mem无血清培养基。sarna使用lipofectamine
tm 2000(invitrogen)转染，sarna(20μm)与lipofectamine
tm
2000(4μl/孔)在室温下混合后静置20min，加入opti-mem无血清培养基200μl混匀，加入6孔板中，每孔定容至2ml。转染后24h，在每孔中加入dmem完全培养基2ml，继续培养48h进行下一步检测。
66.4)细胞缺氧处理：细胞置于缺氧培养箱(37℃、1％o2、5％co2)。promega mts(cell titeraqueous one)检测细胞活度
67.1)融化试剂：室温避光静置90min或37℃避光水浴加热10min以完全溶解试剂溶液。
68.2)加样：弃去96孔板中原有的培养基，重新在每孔中加入100μl培养基，再加20μl该试剂。
69.3)孵育：在37℃、5％co2的环境下孵育2h。
70.4)酶标仪检测：490nm读取吸光度值。
71.annexinv-fitc/pi检测细胞凋亡
72.1)收集细胞：细胞从缺氧箱中取出后，细胞培养基中的死亡细胞不可丢弃，需收集后离心(4℃、400g、5min)，与消化下的存活细胞混合后共同染色；培养皿中的存活细胞按照常规方式进行胰酶消化(忌过度消化)，离心(4℃、400g、5min)收集细胞。
73.2)4℃预冷的pbs洗涤细胞2次，每次均需离心(4℃、400g、5min)。至少收集1～5
×
105细胞。
74.3)吸弃pbs，加入100μl 1
×
binding buffer(4℃)重悬细胞。
75.4)加入5μl annexin v-fitc和10μl pi staining solution，轻轻混匀。
76.5)避光、室温反应10～15min。
77.6)加入400μl 1
×
binding buffer，混匀后放置于冰上，样品在1h内用流式细胞仪检测。
78.实施例1dusp12基因sarna的筛选及预激活后的抗心肌细胞肥大作用
79.《1-1》靶基因的选择
80.因较高的发病率、严重的临床预后和有限的治疗手段，心肌肥厚成为重大的公共卫生问题。根据既有研究的报道：ccr9通过上调心肌细胞pi3k/akt通路中相关蛋白的磷酸化水平而促进心肌肥厚的进展；特异性pi3k抑制剂ly294002也正是通过抑制pi3k介导的akt激活过程进而抑制心肌肥厚的进展。除此之外，mapk通路、nf-κb通路调控心肌肥厚的进展也是基于多个信号分子级联磷酸化的变化，在该过程中蛋白激酶与磷酸酶的双向作用具有非常重要的作用。因此，本研究设想可以通过改变磷酸酶的表达水平，进而改变mapk或
pi3k/akt通路中相关效应蛋白的磷酸化水平，最终调控心肌肥厚的进展。
81.双特异性磷酸酶12(dual-specificity phosphatase 12，dusp12)作为dusp磷酸酶家族中的非典型酪氨酸磷酸酶，由两个主要的结构域构成：催化结构域和锌指蛋白连接结构域。dusp12的催化结构域可同时去除同一底物上丝氨酸/苏氨酸和酪氨酸的磷酸化修饰，抑制pi3k/akt和mapk通路中大量蛋白的激活，进而在人类疾病进展过程中发挥重要作用。鉴于pi3k/akt和mapk通路的激活在心肌肥厚进展过程中的重要作用以及dusp12的生理学功能，推测dusp12可抑制心肌肥厚进展。
82.目前已有报道表明dusp12具有较好的抗心肌肥厚作用。因而，本实施例以dusp12为研究靶点，设计dusp12启动子靶向sarna，期望通过对其进行干预来逆转心肌肥厚。本研究设想sarna对dusp12的预激活可能会调动细胞内的抗肥厚信号通路，从而，当处于外界的肥厚病理刺激条件时，会影响心肌细胞肥厚相关分子标志物的表达水平(图1)。
83.《1-2》sarna的设计
84.根据既有研究的报道，sarna的靶位点一般位于靶基因转录起始位点(transcription starting site，tss)上游几百bp以内的范围，该范围内的sarna可以有较好的激活效果。然而新近研究证明，即使是在远离tss的启动子区域，sarna依旧可以发挥较好的靶基因激活作用。鉴于此，本研究将启动子区的检索范围确定为tss上游2000bp以内，并根据该段2000bp的dna序列设计sarna序列。
85.sarna设计原则：利用invitrogen的sirna设计软件(block-it
tm rnai designer)，基于设计位点远离高dna甲基化区域如cpg位点、cpg岛、高gc含量序列等原则，选择了4条sarna进行后续研究。
86.表1.针对dusp12基因的sarna位置及序列
87.sarnalocationsense sequence(5
’-3’
)seq id no.1-1291cccauuggauccuucuguu12-1053gcaccaaagacacucguau23-967gguguucagauuucuccuu34-706gcaggacaccauuguagau4
88.注：表中只列出sarna正义链序列(与mrna序列一致的链)，方向为5
’-3’
；sarna位置表示其正义链5’端在dusp12基因启动子上的位置，将dusp12转录起始位点定义为 1。
89.《1-3》dusp12启动子靶向sarna激活效果的检测
90.选择大鼠h9c2心肌细胞系作为研究对象，以20nm的工作浓度分别进行nc序列(无作用的阴性sarna对照)和表1中4条sarna的转染。通过检测dusp12 mrna水平反映sarna的激活效果。
91.由图2可以看出，大鼠h9c2心肌细胞系转染sarna后，sarna 1、sarna 2和sarna4均有较好的激活效果，dusp12 mrna水平出现高达2倍以上的上调改变，而sarna 3并没有显示出激活效果。
92.《1-4》dusp12启动子靶向sarna显著下调心肌肥厚相关分子标志物表达
93.基于实施例《1-3》中sarna的激活效率检测，选择sarna 1、sarna2和sarna 4进行下一步的功能检测实验。
94.首先给予h9c2细胞系sarna 1、sarna 2和sarna 4转染处理，72h后再给予细胞24h
的angii刺激。通过心肌肥厚分子标志物的检测发现：
95.转染nc序列(无作用的阴性sarna对照)的细胞经过angii刺激后，anp表达水平显著上调；但在sarna 1、sarna 2和sarna 4转染的细胞中，anp表达水平明显下调(图3)。
96.与anp表达趋势一致，转染nc序列(无作用的阴性sarna对照)的细胞经过angii刺激后，β-mhc表达水平显著上调；但在sarna 1、sarna 2和sarna4转染的细胞中，β-mhc表达水平明显下调(图4)。
97.综上，本实施例结合rnaa领域的相关前期研究，设计了dusp12启动子靶向sarna，发现在h9c2细胞系中，dusp12启动子靶向sarna可以在mrna水平激活dusp12表达。进而，功能验证结果提示，dusp12启动子靶向sarna的转染可以抑制心肌肥厚相关分子标志物的表达上调，从而证实本发明的sarna具有保护心肌细胞免受应激损伤(例如防止心肌细胞因遭受心肌肥厚刺激(例如angii刺激)而引起的损伤)、在心肌肥厚逆转的过程中发挥作用的潜能。
98.实施例2hspa1a基因sarna的筛选及预激活后的抗缺氧损伤作用
99.《2-1》靶基因的选择
100.冠状动脉粥样硬化性心脏病即冠心病(coronary atherosclerotic heart disease，chd)是由于冠状动脉粥样硬化导致冠脉管腔狭窄或阻塞，从而致使心肌缺血缺氧而引起的心脏疾病。在我国，冠心病的发病率呈现快速上升的趋势，已是构成我国城乡居民疾病死亡率的第一大病种，严重危害着国民健康，并对国家经济造成严重影响。但是，与目前高发病率、高患病率和高死亡率形成鲜明对比的是目前有限的治疗方式和远不能令人满意的治疗效果。冠心病主要的治疗方式包括药物治疗、介入治疗和外科治疗。其主要原理均为改善心肌血供并挽救濒死心肌。限于治疗原理的单一，冠心病治疗手段一直未能出现本质突破，进而无法改善冠心病的治疗效果。若在恢复心肌血供的同时使用其它手段提高心肌细胞对缺氧的耐受能力，则既可以增加冠脉闭塞后存活心肌细胞的数量，又为冠脉再血管化治疗争取了时间。因而，寻找合适的可提高心肌抗缺血缺氧能力的干预靶点以及干预手段是冠心病治疗的当务之急。
101.既往研究提示，热休克蛋白家族a(hsp70)成员1a(heat shock protein family a(hsp70)member 1a，hspa1a)在心肌细胞应激过程中被首次发现，后续功能研究也较多集中在心肌损伤方面。另外，作为一种易诱导蛋白，应激性刺激可明显提高hspa1a的表达水平。同时，在“缺血预处理”中，hspa1a的功能也得到了深入探索。hspa1a的以上功能特性使得hspa1a与sarna的作用机制能够较好契合：通过识别特定基因的启动子序列，sarna可诱导“rna介导的转录激活复合体”的组装和迁移，锚定在靶基因启动子区域后进一步招募dna解旋酶和rna聚合酶，在转录水平激活靶基因表达；另外，基于sarna的特殊热力学特性，sarna对靶基因的激活效果可持续相对较长的时间，增加了sarna应用于心肌缺血缺氧治疗的可能性。因而，本实施例以hspa1a为研究靶点，设计hspa1a启动子靶向sarna。本研究设想hspa1a启动子靶向sarna可通过预先激活hspa1a的表达而保护心肌细胞免遭缺氧损伤。
102.《2-2》sarna的设计
103.采用与实施例1中相同的方式，根据hspa1a基因tss上游2000bp的dna序列设计sarna序列，选择了4条sarna进行后续研究。
104.表2.针对hspa1a基因的sarna位置及序列
105.sarnalocationsense sequence(5
’-3’
)seq id no.a-1768ggguauguccuacauacaa5b-1394ccacagaaagucucaguau6c-660gguagacucuucaaagcuu7d-549gcagcaguaucacgccuuu8
106.注：表中只列出sarna正义链序列(与mrna序列一致的链)，方向为5
’-3’
；sarna位置表示其正义链5’端在hspa1a基因启动子上的位置，将hspa1a转录起始位点定义为 1。
107.《2-3》hspa1a启动子靶向sarna激活效果的检测
108.选择大鼠h9c2心肌细胞系作为研究对象，以20nm的工作浓度分别进行nc序列(无作用的阴性sarna对照)和表2中4条sarna的转染。通过检测hspa1a mrna水平反映sarna的激活效果。
109.由图5a可以看出，大鼠h9c2心肌细胞系转染工作浓度为20nm的sarna后，sarna d有较好的激活效果，hspa1amrna水平出现2倍以上的上调改变，而其余3条sarna则并没有显示出激活效果。
110.进而，以50nm的工作浓度对大鼠h9c2心肌细胞系进行转染。
111.类似地，由图5b可以看出，4条sarna中sarna d有较好的激活效果，hspa1a mrna水平出现2倍以上的上调改变，而其余3条sarna仍然没有显示出激活效果。
112.基于sarna的激活效率检测，选择sarna d进行后续实验。
113.《2-4》h9c2细胞缺氧模型中sarna心肌保护功能的检测—mts检测
114.选择大鼠h9c2心肌细胞系作为研究对象，按照20nm、40nm、60nm和80nm的工作浓度进行nc序列(无作用的阴性sarna对照)和sarna d的转染。转染72h后，将细胞置于37℃，1％o2，5％co2的缺氧环境中进行24h缺氧处理，进而通过mts检测心肌细胞活度。
115.qrt-pcr检测不同浓度sarna d对靶基因hspa1a的激活效果结果提示：无论在何种工作浓度(20nm～80nm)下，sarna d均有较好的激活效果，hspa1a mrna水平出现2倍以上的上调改变(图6a)。
116.细胞活度检测结果提示：缺氧24h后，与normal组(未缺氧)细胞相比，nc组和sarna d转染组细胞活度均出现了一定的下降，但与nc组相比，sarna d转染组细胞的活度显著上升(图6b)。该结果提示，就mts检测而言，在缺氧刺激之前对h9c2细胞预先转染hspa1a启动子靶向sarna，可以保护心肌细胞免受缺氧刺激的损伤，并显著减少心肌细胞的死亡，该保护作用的持续时程至少为24h。
117.《2-5》h9c2细胞缺氧模型中sarna心肌保护功能的检测—流式细胞学检测
118.本实施例通过annexinv-fitc/pi染色法结合流式细胞学计数判定心肌细胞的存活和凋亡/坏死状况。
119.选择大鼠h9c2心肌细胞系作为研究对象，按照20nm、40nm、60nm和80nm的工作浓度进行nc序列(无作用的阴性sarna对照)和sarna d的转染。转染72h后，将细胞置于37℃，1％o2，5％co2的缺氧环境中进行24h缺氧处理，进而通过annexinv-fitc/pi染色法结合流式细胞学计数判定心肌细胞的存活状况。
120.细胞活度检测结果提示：缺氧24h后，nc组、sarna d 20nm、sarna d 40nm、sarna d 60nm和sarna d 80nm组中正常细胞所占的比例分别为：61.5％、71.6％、71.0％、71.1％和
69.6％，sarna d转染组正常细胞所占的比例较nc组有显著上升；另外，nc组、sarna d 20nm、sarna d 40nm、sarna d 60nm和sarna d 80nm组中早期凋亡细胞的比例分别为：6.77％、4.65％、5.66％、5.44％和6.19％，晚期凋亡细胞的比例分别为：24.8％、15.7％、19.2％、18.9％和20.4％，sarna d转染组早期凋亡和晚期凋亡细胞所占的比例较nc组有显著下降(图7a-图7f)。与mts检测结果类似，该结果提示，就annexinv-fitc/pi染色法结合流式细胞学计数检测而言，在缺氧刺激之前对h9c2细胞预先转染hspa1a启动子靶向sarna，可以保护心肌细胞免受缺氧刺激的损伤，并显著减少心肌细胞的死亡，该保护作用的持续时程至少为24h。
121.以上结果说明，通过在缺氧前给予hspa1a启动子靶向sarna转染处理，可以保护心肌细胞免受缺氧刺激的损伤并抑制心肌细胞凋亡。具体而言，本发明的sarna可诱导hspa1a表达显著上调，保护心肌细胞免受应激损伤(例如防止心肌细胞因遭受缺氧刺激而引起的损伤)，具有较强的心肌细胞保护作用。
122.《2-6》sarna心肌保护作用机制的初步探索
123.根据前文hspa1a相关的机制研究，在调控细胞凋亡方面，hspa1a可通过线粒体-细胞色素c-caspase9途径、jnk、faf1-fas等多条信号通路的共同作用保护心肌细胞和非心肌细胞免遭应激性刺激的损伤。
124.本实施例中，选择大鼠h9c2心肌细胞系作为研究对象，按照20nm、40nm、60nm和80nm的工作浓度进行nc序列(无作用的阴性sarna对照)和sarna d的转染。转染72h后，通过westernblot检测hspa1a蛋白表达水平的改变和jnk磷酸化水平的改变。
125.实验结果提示：首先，sarna对hspa1a的激活在蛋白水平上得到了再次的确证(图8a和图8b)；另外，hspa1a的表达上调抑制了jnk的磷酸化，进而抑制了jnk激活介导的心肌细胞凋亡(图8c)。
126.本领域技术人员将会理解，为了实现与本发明相同的目的，可容易地将在以上描述中所公开的概念和具体实施方式用作基础来修改或设计出其它实施方式。本领域技术人员还将理解的是，此类等同实施方式并未背离在所附权利要求中请求保护的本发明的精神和范围。