一种用于筛选干扰素信号通路负调控因子的报告系统及其构建方法与流程

1.本发明属于生物技术领域，具体涉及一种用于筛选干扰素信号通路负调控因子的报告系 统及其构建方法。


背景技术：

2.干扰素信号通路在抵抗病原微生物侵染、维持细胞稳态和机体健康等方面发挥重要作用， 是天然免疫的重要组成部分。该通路的异常激活引发机体炎症反应和自身免疫疾病的发生， 因此对其的正确调控至关重要。这其中，负调控因子发挥关键作用：通过调节细胞内dna、 rna代谢等活动，维持非感染状态下该通路的沉默。
3.目前，负调控因子的筛选确定主要分两种情况：第一是是基于干扰素通路基因差异表达 的高通量筛选获得的，然后通过功能实验进行鉴定，例如，lnc-lsm3b1等，但这种发现途径 效率低，耗时长，所发现的差异表达基因不一定发挥负调控功能，增大鉴定难度。第二种是 在发现基因的基础上，通过后续研究的验证才被鉴定为具有干扰素通路激活的负调控功能， 如trex1、rnaseh2和samhd1等2，但是，该方法存在成本高，效率底，耗时间长等问 题。因此目前缺乏对新的负调控因子进行有效、高通量的简单筛选系统。
4.鉴于对负调控因子的研究在理论认知和临床应用中的重要作用，和现有功能性筛选方法 的缺点，本技术构建了一种用于筛选干扰素信号通路负调控因子的筛选系统，所述筛选系统 为整合有干扰素启动子启动的抗性基因的报告系统的hela细胞，在此基础上进行全基因组 敲除细胞库构建，在含有干扰素和抗性基因对应抗生素的培养基中培养，如果所述基因敲除 细胞在含抗性基因对应抗生素的培养基中存活，则所述基因敲除细胞为干扰素信号通路负调 控因子编码基因敲除的细胞，即，所述敲除基因判定为干扰素信号通路负调控因子。所述报 告系统能够解决干扰素激活通路中负调控因子的筛选问题。


技术实现要素：

5.针对上述问题，本发明提供了一种用于筛选干扰素信号通路负调控因子的报告系统及其 构建方法，具体包括以下内容：
6.第一方面，本发明提供了一种用于筛选干扰素信号通路负调控因子的报告载体，所述报 告载体包括：含有干扰素启动子和抗性基因的基因组合元件、表达载体、和/或报告基因元件； 所述干扰素启动子位于抗性基因的5’末端，用于启动抗性基因的表达；且所述干扰素启动子 与表达载体基因组转录用启动子方向相反。
7.优选地，所述基因组合元件还含有kozac序列，和/或sv40 poly a信号序列；所述kozac序列3’末端与抗性基因起始密码子5’末端连接；所述sv40 poly a信号序列的5’末端与 抗性基因终止子的3’末端连接。
8.优选地，所述抗性基因为氨基糖苷类抗生素抗性基因。
9.优选地，所述抗生素抗性基因包括新霉素抗性基因(neor)、潮霉素b抗性基因
(hygromycin resistant gene)。
10.优选地，所述干扰素启动子为i型干扰素通路启动子。
11.优选地，所述干扰素启动子为ifn-β启动子，所述ifn-β启动子启动ifn-β基因的转录。
12.优选地，所述ifn-β启动子的基因序列如seq id no.2所示。
13.优选地，所述表达载体为fg12载体，所述基因组合元件插入到fg12载体中。
14.优选地，所述基因组合元件的插入方式为：在含有表达干扰素启动子和抗性基因的基因 组合元件的5’和3’末端分别引入xhoi和xbai序列后，插入到fg12载体中。
15.优选地，所述报告基因为荧光酶报告基因。
16.优选地，所述报告基因包括egfp基因。
17.优选地，所述基因组合元件的基因序列如seq id no.1或seq id no.3所示。
18.第二方面，本发明提供了一种用于筛选干扰素信号通路负调控因子的干扰素通路激活报 告系统，所述报告系统为转染上述第一方面任一所述报告载体的宿主细胞。
19.优选地，所述宿主细胞为含有cgas-sting通路的细胞。
20.优选地，所述宿主细胞为hela细胞。
21.第三方面，本发明提供了一种用于筛选干扰素信号通路负调控因子的筛选系统，所述筛 选系统包括上述第二方面所述的报告系统和靶向敲除所述的报告系统全基因中每个基因的sg rna；或所述筛选系统为分别敲除如权利要求9所述的报告系统中每个基因后获得的基因敲 除细胞库。
22.优选地，所述sgrna选自human_geckov2_library_a；所述全基因组敲除文human_ geckov2_library_a覆盖65384sgrna，源自于张峰2018年刊登的文献genome-scale crispr-cas9 knockout and transcriptional activation screening。
23.第四方面，本发明提供了一种筛选干扰素信号通路负调控因子的方法，所述方法包括以 下步骤：
24.(1)构建上述第三方面所述的基因敲除细胞库；
25.(2)分别取所述基因敲除细胞库中的基因敲除细胞，加入干扰素诱导处理24小时后， 在含抗性基因对应的抗生素的培养基中培养；
26.(3)结果判定：如果所述基因敲除细胞在含抗性基因对应抗生素和干扰素的培养基中存 活，则所述基因敲除细胞为干扰素信号通路负调控因子编码基因敲除的细胞，判定所述敲除 的基因为干扰素信号通路负调控因子。
27.本发明的有益效果是：本发明提供了一种用于筛选干扰素信号通路负调控因子的报告系 统及其构建方法，所述报告系统可用于干扰素信号通路负调控因子的筛选及功能鉴定，有利 于大规模筛选对干扰素通路激活具有负调控功能的基因或药物。
附图说明
28.图1fg12载体上的酶切位点示意图；
29.图2荧光显微镜观察结果图；
30.图3ifnbeta和isg15含量检测结果；
31.图4neor报告系统表达的测试结果；
图5报告系统验证实验结果。
具体实施方式
32.为使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体 实施方式，进一步阐述本发明。但本发明的保护范围并不局限于以下实施例所述。
33.以下实施例中所述的实验细胞、病毒来源：
34.实验中其他试剂如果没有特别说明均为常见的市售试剂；实验中的操作如果没有特别说 明均是本领域知晓的操作方法。
35.下面结合实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步 理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说， 在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干调整和改进。这些都属于本发明的保护范围。
36.实施例1用于筛选干扰素信号通路负调控因子的报告系统的构建
37.1.ifn-β启动子及编码序列的构建
38.根据ncbi数据库，查询到ifn-βdna的序列信息，包括启动子序列和下游部分序列。 其中，序列按照5
’‑3’
的方向进行展示，依次分别为启动子序列，启动子与编码区之间的序列， 编码区序列，具体基因序列如seq id no.2所示。
39.2.用于干扰素信号通路负调控因子的筛选的基因组合元件的构建
40.合成用于干扰素信号通路负调控因子的筛选的基因组合元件，所述基因组合元件按照5
’ꢀ‑3’
的方向依次包括：ifn-β启动子序列、ifn-β启动子其下游至起始密码子前的全部序列、k ozac序列(gccacc)、neor的编码序列、tga终止子、sv40 poly(a)信号序列；所述 基因组合元件的基因序列如seq id no.1所示。
41.在所述基因组合元件的5’和3’末端分别引入酶切位点xbai和xhoi，形成双酶切基因片 段，所述双酶切基因片段按照5
’‑3’
的方向依次包括：酶切位点保护碱基序列aatt、xhoi识别 序列、ifn-β启动子序列、ifn-β启动子其下游至起始密码子前的全部序列、kozac序列(g ccacc)、neor的编码序列、tga终止子、sv40 poly(a)信号序列、xbai识别序列、酶 切位点保护碱基序列ttaa。所述双酶切基因片段的基因序列如seq id no.3所示.
42.3.报告载体的构建
43.将上述2中制备的双酶切基因片段插入到fg12载体上的xbai和xhoi酶切位点(如图1 所示)，实现上述2所述的双酶切基因片段反向插入fg12载体上，构建获得用于干扰素信号 通路负调控因子的筛选的报告载体。
44.4.报告系统的构建及筛选
45.将上述3制备的报告载体在hek293t细胞中进行病毒的包装；收集含有病毒的上清， 感染hela细胞，并进行细胞稀释培养，挑取含有egfp信号的单克隆，命名为hela-ifnb
‑ꢀ
neor；将单克隆hela-ifnb-neor进行扩大培养，通过流式细胞分析和荧光显微镜观察，确 证该细胞系携带fg12载体上的egfp标签。
46.hela-ifnb-neor进行egfp表达分析结果如图2所示，a为将细胞进行胰酶消化，用于 流式细胞分析；b为对a中圈出的细胞进行egfp表达分析，纵轴表示细胞数，横轴表示eg fp强度。c为对该细胞系进行荧光显微镜观察，检测其gfp信号。结果表明，该报告系统上 携
带fg12载体上的egfp标签。
47.5.ifn-β表达水平结果验证
48.对hela-ifnb-neor进行干扰素通路激活分析，检测该细胞对干扰素通路激活的反映情 况：转染表达mavs的质粒和空载体(ev)，24小时后提取总rna进行rt-qpcr，利用rt
ꢀ‑
qpcr对细胞rna进行分析；其中mavs的质粒转染后，细胞表达mavs蛋白，该蛋白的 过表达能够在线粒体上聚集成复合物，激活下游干扰素激活因子的功能，强迫细胞激活干扰 素信号通路。
49.结果如图3所示，其中a为ifn-β表达水平检测结果。结果表明，在ifn-β(图中以if nb表示)都激活的情况下，与普通hela相比较，hela-ifnb-neor中的ifn-β和isg15的 激活程度都相对较弱，提示报告载体与内源ifnb基因竞争干扰素激活启动子。
50.6.neor报告系统表达检测
51.在确证了该细胞系能激活干扰素通路之后，进行neor报告系统表达的测试：将hela 和hela-ifnb-neor细胞分别转染mavs表达质粒，以不进行任何处理为对照，48小时后消 化细胞进行稀释培养，同时培养基中加入2000μg/ml的g-418(新霉素)；之后对存活细胞进 行结晶紫染色。
52.结果如图4所示，其中a为将hela和hela-ifnb-neor细胞进行g-418处理；b为将h ela和hela-ifnb-neor细胞先转染表达mavs的质粒，再进行g-418处理。结果表明，在 对照组中，普通hela和hela-ifnb-neor细胞均被全部杀死(如图4中a所示)；而转染m avs表达质粒后，细胞内的干扰素通路激活，hela-ifnb-neor细胞中，neor的表达也被激 活，从而使得该细胞在同样浓度的g-418存在下，仍然可以存活；而普通hela细胞在mav s表达后不能存活于g-418处理的培养条件下(如图4中b所示)。
53.通过实验比较，hela-ifnb-neor具备对干扰素通路的激活反应，能够在干扰素诱导下启 动表达neor抗性蛋白，存活于含有g-418的培养基中。本筛选用报告系统构建完成。
54.实施例2验证试验
55.为了进一步确证该报告细胞系对干扰素通路激活的响应能够用于负调控因子的筛选，通 过crispr-cas9手段进行adar1基因的敲除。adar1是一种化学修饰双链rna的脱氨酶， 能将腺苷酸修饰为次黄嘌呤，从而破坏存在于双链rna中的a：u配对，抑制细胞对双链r na的识别。adar1能够抑制内源性双链rna被错误识别为病毒双链rna，从而有效保护 了细胞的内环境稳态，对干扰素通路的异常激活起到抑制作用。敲除adar1，能够在干扰素 刺激情况下，激活细胞新一轮的干扰素信号通路，表明细胞的干扰素识别系统在上调表达后 对内源未修饰的双链rna进行了错误识别。
56.通过构建稳定表达靶向adar1基因的sgrna，在hela-ifnb-neor基础上构建其敲除 细胞系。通过rt-qpcr，验证了adar1的rna水平的降低。通过干扰素处理，提高细胞内 干扰素激活系统的表达水平，进而通过g-418药物筛选，得到存活的细胞克隆。存活细胞即 为干扰素通路被激活而导致neor(新霉素抗性基因)表达的细胞。
57.结果如图5所示：其中a为hela-ifnb-neor和hela-ifnb-neor-adar1ko细胞总r na提取，再进行rt-qpcr检测adar1表达水平；b为将hela-ifnb-neor和hela-ifnb
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neor-adar1ko细胞进行干扰素处理，再进行g-418处理。结果表明，在adar1-ko处理 的细胞中，能够看到存活的细胞克隆。
58.上述结果表明，应用本发明所述的干扰素通路激活负调控因子的筛选系统，能够正确实 现干扰素通路激活负调控因子的筛选，具有快速，准确等优点。