一种果蝇幼虫组织器官原位质粒转染方法与流程

技术特征：
1.一种果蝇幼虫组织器官原位质粒转染方法，其特征在于，包括以下步骤：s1果蝇幼虫待转染组织器官的制备：取若干只果蝇幼虫为一组，将果蝇幼虫至于pbst中反复清洗数次，去除体表外污垢和污染物，然后在培养皿中滴入灭菌pbs清洗液，在清洗液中解剖果蝇幼虫，尽量不要破损肠道，导致内容物流出造成污染，截取果蝇幼虫上段，包括眼、翅、腿、平衡棒、脑及中枢神经系统和唾液腺以及它们所依附的表皮；s2转染：将果蝇组织器官转移到96孔培养皿中，加入转染混合液a，在摇床上慢速转染；然后吸净转染混合液a，并使用pbs快速清洗，再加入预培养液b，25℃培养4～6小时；将预培养液b更换为全培养液c，进行培养；s3转染检测：收获经步骤s2转染后的组织器官，用甲醛固定，采用常规免疫荧光染色，观察转染效果；其中，转染混合液a的制备方法按如下比例：向100ul转染混合液母液中加入1ul 5％的洋地黄苷浓储液和200ng待转染质粒，所述转染混合液母液的主体为shields and sang m3 insect medium昆虫培养基，每1ml培养基中添加10ul 200mm的谷氨酰胺、2ul 60％的乳酸钠、10ul 100mm丙酮酸钠，另外每1ml转染混合液母液中还添加1ug胃蛋白酶抑制剂、10ug抑肽酶和1ug亮抑酶肽；预培养液b的制备方法按如下比例：向100ul shields and sang m3 insect medium昆虫培养基中加入200ng待转染质粒；全培养液c的制备方法按如下比例：向主体为shields and sang m3 insect medium昆虫培养基中加入培养液，其中，每900ul培养基中添加10ul 200mm的谷氨酰胺、2ul 60％的乳酸钠、10ul 100mm丙酮酸钠、10ul青霉素和链霉素双抗浓储液和100ul胎牛血清，所述青霉素浓度为10000u/ml，链霉素浓度为10mg/ml。2.根据权利要求1所述的果蝇幼虫组织器官原位质粒转染方法，其特征在于：所述步骤s1中，每组果蝇幼虫数量不超过5只，用pbst反复清洗果蝇幼虫外表3次，在含有灭菌pbs的培养皿中解剖。3.根据权利要求1所述的果蝇幼虫组织器官原位质粒转染方法，其特征在于：所述步骤s2中，解剖后果蝇组织器官使用pbs快速清洗2次，每次清洗过程如下：利用pbs清洗液进行10次逐滴清洗，且每两次清洗并转移组织器官后，对镊子进行火焰消毒并在空气中冷却待用。4.根据权利要求1所述的果蝇幼虫组织器官原位质粒转染方法，其特征在于：所述步骤s2中，转染混合液a的加入量为至少为50ul，在摇床上慢速转染的时间为30min-1h。5.根据权利要求1所述的果蝇幼虫组织器官原位质粒转染方法，其特征在于：所述步骤s2中，全培养液c的使用每12小时换液一次，且换液至少3次，保障全培养液c的培养总时间达到48小时，并于每次换液时用室温pbs至少清洗一次。6.根据权利要求1所述的果蝇幼虫组织器官原位质粒转染方法，其特征在于：所述步骤s2中，混合转染液a与预培养液b中转染arm-gal4 100ng和uas-gpi-gfp 100ng质粒，总转染质粒质量为200ng。

技术总结
本发明公开了一种果蝇幼虫组织器官原位质粒转染方法，涉及生物技术领域。包括以下步骤：S1果蝇幼虫待转染组织器官的制备；S2转染：将果蝇组织器官转移到96孔培养皿中，对依次经孵育转染混合液A执行转染、孵育预培养液B稳定转染和使用全培养液C进行转染后的组织器官常规培养；S3转染检测：收获经步骤S2转染后的组织器官，甲醛固定，采用常规免疫荧光染色，观察转染效果。本发明可以直接转染果蝇幼虫组织器官，48h可观测到果蝇组织器官实现外源基因的转染和成功表达，因技术方案实行12小时换液规则，并且果蝇组织器官培养为25℃，因此微生物污的增殖速度远远达不到污染程度，适用于有菌操作环境。操作环境。操作环境。


技术研发人员：张岩 叶晓蕾 冯颖 林益 林雪
受保护的技术使用者：温州医科大学
技术研发日：2021.09.23
技术公布日：2022/1/14