可用于治疗医学病症的新型吗啡喃的制作方法

可用于治疗医学病症的新型吗啡喃
1.相关申请的交叉引用
2.本技术要求于2019年3月29日提交美国专利和商标局的美国临时专利申请号62/826,188的优先权，其全部内容出于各种目的通过整体引用并入本文。
技术领域
3.本公开总体上涉及可用于治疗医学病症的新型吗啡喃。


背景技术：

4.κ阿片受体(kor)存在于身体的许多部位，诸如大脑、脊髓以及中枢和外周末梢。kor像其他两种阿片受体μ阿片受体(mor)和δ阿片受体(dor)一样在信号转导中发挥着重要的作用。激动剂诱导的kor激活引起抑制腺苷酸环化酶和钙通道活性，同时刺激钾通道活性(参见law py,wong yh,loh hh；《阿片受体信号传导的分子机制和调节(molecular mechanisms and regulation of opioid receptor signaling)》《药理学和毒理学年度评论(annu rev pharmacol toxicol)》2000；40:389
‑
430)。
5.多种生理过程与kor的激活有关，诸如镇痛、止痒活性物质(参见inan s,cowan a.《κ阿片受体激动剂抑制氯喹诱导的小鼠抓挠(kappa opioid agonists suppress chloroquine
‑
induced scratching in mice)》.《欧洲药理学杂志(eur j.pharmacol)》2004；502,233
‑
7)以及多尿(参见barber a,gottschlich r.《选择性非肽类κ阿片受体激动剂的新进展(novel developments with selective non
‑
peptidic kappa
‑
opioid receptor agonists)》.《临床研究性药物的专家意见(exp opinion investigational drugs)》.1997；6:1351
‑
68；dehaven
‑
hudkins dl,dolls r.e.；《作为新型镇痛剂的外周限制性阿片类激动剂(peripherally restricted opioid agonists as novel analgesic agents)》.《当今制药(curr pharm des)》2004；10:743
‑
57)、炎症、免疫系统调节等，这为kor治疗许多医学病症(诸如疼痛、抑郁、自身免疫性病症和神经系统疾病)提供了巨大的潜力。
6.许多kor选择性激动剂被设计为潜在的镇痛剂，试图避免与传统阿片类镇痛剂相关联的副作用，诸如呼吸抑制、依赖性、成瘾和便秘。已经在临床试验中测试了一些kor，但由于多尿、镇静和烦躁等副作用或缺乏疗效而失败。一些实例包括：螺朵林甲磺酸(参见wadenberg ml,《螺朵林性质综述：一种有效且具有选择性的κ
‑
阿片受体激动剂(a review of the properties of spiradoline:a potent and selective kappa
‑
opioid receptor agonist)》.《中枢神经药物评论(cns drug rev.)》2003,夏季,9(2):187
‑
98)，用于潜在镇痛剂的依那朵林(参见walsh sl.,strain ec,abreu m.e.bigelow g.e.；《依那朵林，一种具有选择性的κ阿片类激动剂：与人类布托啡诺和氢吗啡酮的比较(enadoline,a selective kappa opioid agonist:comparison with butorphanol and hydromorphone in humans)》.《精神病药理学(psychopharmacology)》2001,157,151
‑
162)以及adl
‑
10
‑
0101。
7.cr
‑
845是目前处于镇痛剂和止痒剂临床试验中的另一种kor激动剂。trk
‑
820最初是作为潜在的镇痛剂开发的，但作为止痒剂取得了成功，并在日本获得了监管部门的批准。
8.kor激动剂也被开发用于其他适应症，诸如作为肠易激综合征和消化不良的潜在治疗剂的非多托秦，以及作为肠易激综合征和功能性消化不良的潜在疗法的阿西马朵林。
9.所需要的是这样一种新型的阿片类κ激动剂，其具有治疗各种与kor相关的医学病症而没有副作用的潜在治疗价值。


技术实现要素：

10.在本公开的各个方面之中的是包含式(i)的化合物：
[0011][0012]
其中：
[0013]
r为氢、烷基、取代的烷基、环烷基、烷基环烷基、烯基、取代的烯基、芳基、取代的芳基、烷芳基或取代的烷芳基；
[0014]
r1和r2独立地为氢、卤素、羟基、烷氧基、芳氧基、氨基、胺基、硝基、烷基或取代的烷基；
[0015]
r3为氢、羟基、烷氧基、芳氧基、卤素、氨基或硫醇基；
[0016]
r7和r8独立地为氢、卤素、羟基、烷氧基、氨基、胺基、硫醇基、烷基或取代的烷基；
[0017]
r
10
为氢、羟基、烷氧基、酮基、醚基、酯基、氨基或胺基；
[0018]
r
14
为氢、羟基或烷氧基；
[0019]
r
20
、r
21
、r
22
、r
23
和r
24
独立地为氢、卤素、烷基、取代的烷基、烯基、取代的炔基、芳基、取代的芳基、烷芳基、取代的烷芳基、杂环、取代的杂环、烷基杂环或取代的烷基杂环；
[0020]
r
25
为氢、卤素、烷基、取代的烷基、烯基、取代的炔基、芳基、取代的芳基、烷芳基、取代的烷芳基、杂环、取代的杂环、烷基杂环、取代的烷基杂环或不存在；
[0021]
x为氮、氧或硫；并且
[0022]
虚线代表可选的双键。
[0023]
在另一方面，本公开提供包含任何式(i)的化合物和至少一种药学上可接受的赋
形剂的药物组合物。
[0024]
在另一方面，本公开提供了一种用于治疗κ阿片受体相关疾病或病症的方法。所述方法包括：向有此需要的个体给药包含式(i)的化合物的组合物。
[0025]
下面更详细地描述本发明的其他特征和迭代。
附图说明
[0026]
图1是化合物5a的响应曲线，其测量％效应对提供ec
50
的浓度(nm)的对数。
具体实施方式
[0027]
本公开提供了包含式(i)的化合物、包含任何式(i)的化合物和至少一种药学上可接受的赋形剂的药物组合物以及用于治疗κ阿片受体相关疾病或病症的方法。已显示本文公开的化合物对κ阿片受体具有选择性，因此将提供用于治疗κ阿片受体相关疾病或病症的疗法。
[0028]
(i)包含式(i)的化合物
[0029]
本公开的一个方面提供了包含式(i)的化合物：
[0030][0031]
其中：
[0032]
r为氢、烷基、取代的烷基、环烷基、烷基环烷基、烯基、取代的烯基、芳基、取代的芳基、烷芳基或取代的烷芳基；
[0033]
r1和r2独立地为氢、卤素、羟基、烷氧基、芳氧基、氨基、胺基、硝基、烷基或取代的烷基；
[0034]
r3为氢、羟基、烷氧基、芳氧基、卤素、氨基或硫醇基；
[0035]
r7和r8独立地为氢、卤素、羟基、烷氧基、氨基、胺基、硫醇基、烷基或取代的烷基；
[0036]
r
10
为氢、羟基、烷氧基、酮基、醚基、酯基、氨基或胺基；
[0037]
r
14
为氢、羟基或烷氧基；
[0038]
r
20
、r
21
、r
22
、r
23
和r
24
独立地为氢、卤素、烷基、取代的烷基、烯基、取代的炔基、芳
基、取代的芳基、烷芳基、取代的烷芳基、杂环、取代的杂环、烷基杂环或取代的烷基杂环；
[0039]
r
25
为氢、卤素、烷基、取代的烷基、烯基、取代的炔基、芳基、取代的芳基、烷芳基、取代的烷芳基、杂环、取代的杂环、烷基杂环、取代的烷基杂环或不存在；
[0040]
x为氮、氧或硫；并且
[0041]
虚线代表可选的双键。
[0042]
在一些实施方式中，r可以为氢、烷基、取代的烷基、烷基环烷基、烯基、取代的烯基、芳基、取代的芳基、烷芳基或取代的烷芳基。在其他实施方式中，r可以为氢、甲基、烯丙基、环丙基甲基或环丁基甲基。在特定实施方式中，r可以为环丙基甲基或1
‑
羟基环丙基甲基。
[0043]
在一些实施方式中，r1和r2可以独立地为氢、卤素、羟基、烷氧基、芳氧基、氨基、胺基、硝基、烷基或取代的烷基。在其他实施方式中，r1和r2可以独立地为氢、羟基、甲氧基、甲基或氯。在一些实施方式中，r1和r2可以为氢。
[0044]
在一些实施方式中，r3可以为氢、羟基、烷氧基、芳氧基、卤素、氨基或硫醇基。
[0045]
在其他实施方式中，r3可以为羟基、甲氧基、乙氧基、异丙氧基或苯氧基。在特定实施方式中，r3可以为羟基。
[0046]
在一些实施方式中，r7和r8可以独立地为氢、卤素、羟基、烷氧基、氨基、胺基、硫醇基、烷基或取代的烷基。在其他实施方式中，r7和r8可以独立地为氢、氯代、羟基、氨基、甲氧基或甲基。在一些实施方式中，r7和r8可以为氢。
[0047]
在一些实施方式中，r
10
可以为氢、羟基、烷氧基、酮基、醚基、酯基、氨基或胺基。在其他实施方式中，r
10
可以为氢、羟基、甲氧基或胺基。在特定实施方式中，r
10
可以为氢。
[0048]
在一些实施方式中，r
14
可以为氢、羟基或烷氧基。在其他实施方式中，r
14
可以为氢或羟基。在特定实施方式中，r
14
可以为氢。
[0049]
在一些实施方式中，r
20
、r
21
、r
22
、r
23
和r
24
可以独立地为氢、卤素、烷基、取代的烷基、烯基、取代的炔基、芳基、取代的芳基、烷芳基、取代的烷芳基、杂环、取代的杂环、烷基杂环或取代的烷基杂环，其中杂环选自：呋喃基、苯并呋喃基、噁唑基、异噁唑基、噁二唑基、苯并噁唑基、苯并噁二唑基、吡咯基、吡唑基、咪唑基、三唑基、四唑基、吡啶基、嘧啶基、吡嗪基、哒嗪基、吲哚基、异吲哚基、吲哚嗪基、苯并咪唑基、吲唑基、苯并三唑基、四唑并哒嗪基、咔唑基、嘌呤基、喹啉基、异喹啉基、噻吩基、苯酚基或咪唑并吡啶基。在其他实施方式中，r
20
、r
21
、r
22
、r
23
和r
24
中的至少一个可以为芳基、取代的芳基、烷芳基、取代的烷芳基、杂环、取代的杂环、烷基杂环或取代的烷基杂环，其中杂环定义如上。在另一个实施方式中，r
20
、r
21
、r
22
和r
23
中的一个是杂环或取代的杂环并且其余选自氢或卤素，并且r
24
可以为氢，其中杂环定义如上。在特定实施方式中，r
20
、r
21
、r
23
和r
24
可以为氢，并且r
22
可以为呋喃基、噻吩基或4
‑
羟基苯酚基。
[0050]
在另一个实施方式中，r
25
可以为氢、卤素、烷基、取代的烷基、烯基、取代的炔基、芳基、取代的芳基、烷芳基、取代的烷芳基、杂环、取代的杂环、烷基杂环、取代的烷基杂环或不存在，其中杂环定义如上。在一些实施方式中，r
25
可以为氢、烷基或取代的烷基。在替代性实施方式中，r
25
可以为c1‑
c4烷基或取代的c1‑
c4烷基。在特定实施方式中，r
25
可以为甲基。
[0051]
在一个实施方式中，x可以为氮、氧或硫。在其他实施方式中，x可以为氮或氧。在特定实施方式中，x可以为氮。
[0052]
在其他实施方式中，虚线可以代表可选的双键。在特定实施方式中，虚线可以代表单键。
[0053]
在示例性实施方式中，r可以为环丙基甲基或1
‑
羟基环丙基甲基；r3可以为羟基；r1、r2、r7、r8、r
10
、r
14
、r
20
、r
21
、r
23
和r
24
可以为氢；r
22
可以为呋喃基、噻吩基或4
‑
羟基苯基；并且r
25
可以为甲基，如下所示。
[0054][0055]
一般而言，本文详述的吗啡喃和去甲吗啡喃包括包含如下图解的吗啡喃结构的任何化合物，其中吗啡喃中的r为烷基、取代的烷基、烷基环烷基、烯基、取代的烯基、芳基、取代的芳基、烷芳基或取代的烷芳基，而去甲吗啡喃中的r为氢。出于例示的目的，核心吗啡喃结构的环原子编号如下所示：
[0056][0057]
吗啡喃化合物具有不对称中心。特别地，核心吗啡喃化合物可以具有至少四个手性碳(在上图中用星号表示)；即c
‑
5、c
‑
13、c
‑
14和c
‑
9。
[0058]
包含式(i)的化合物可以具有相对于偏振光的旋转的(
‑
)或( )取向。更具体地，吗啡喃或去甲吗啡喃的每个手性中心可以具有r或s构型。本文所述的化合物可以具有至少四个手性中心，即碳c
‑
5、c
‑
9、c
‑
13和c
‑
14。在每个手性中心，碳原子的立体化学独立地为r或s。c
‑
5、c
‑
9、c
‑
13和c
‑
14的构型分别可以为rrrr、rrrs、rrsr、rsrr、srrr、rrss、rssr、ssrr、srrs、srsr、rsrs、rsss、srss、ssrs、sssr或ssss，前提是c
‑
15原子和c
‑
16原子均位于分子的
α面上或均位于分子的β面上。
[0059]
包含式(i)的化合物的c
‑
6上的基团作为α异构体或β异构体存在。任何这些化合物的α异构体与β异构体之比可以为约0:100至约100:0。
[0060]
包含式(i)的化合物的环丙基环上的碳以r或s构型存在。
[0061]
包含式(i)的化合物可以是游离形式或盐。当化合物为盐形式时，该盐优选为药学上可接受的盐。药学上可接受的盐可以包括但不限于：盐酸盐、氢溴酸盐、磷酸盐、硫酸盐、甲磺酸盐、醋酸盐、甲酸盐、酒石酸、酒石酸氢盐、硬脂酸盐、邻苯二甲酸盐、氢碘酸盐、乳酸盐、一水合物、粘酸盐、硝酸盐、磷酸盐、水杨酸盐、苯丙酸盐、异丁酸盐、次磷酸盐、马来酸盐、苹果酸盐、柠檬酸盐、异柠檬酸盐、琥珀酸盐、乳酸盐、葡糖酸盐、葡糖醛酸盐、丙酮酸盐、草酸盐、富马酸盐、丙酸盐、天冬氨酸盐、谷氨酸盐、苯甲酸盐、对苯二甲酸盐等。在其他实施方式中，药学上可接受的盐包括碱金属或碱土金属离子盐。特别地，使用钠盐、钾盐或其他药学上可接受的无机盐。盐形式可以是非晶形的或各种聚合物形式，包括水合物，或与醇或其他溶剂的溶剂化物。
[0062]
(ii)药物组合物
[0063]
本公开还提供了一种药物组合物，其含有包含式(i)的化合物和至少一种药学上可接受的赋形剂。
[0064]
(a)包含式(i)的化合物
[0065]
在部分(i)中更详细地描述了包含式(i)的化合物。
[0066]
(b)赋形剂
[0067]
本公开的药物组合物包含至少一种药学上可接受的赋形剂。合适的赋形剂的非限制性实例可以包括：稀释剂、粘合剂、填充剂、缓冲剂、ph改性剂、崩解剂、分散剂、稳定剂、防腐剂和着色剂。赋形剂的量和类型可以根据已知的药物科学原理来选择。
[0068]
在一个实施方式中，赋形剂可以包括至少一种稀释剂。合适的稀释剂的非限制性实例可以包括：微晶纤维素(mcc)、纤维素衍生物、纤维素粉末、纤维素酯类(即，醋酸和丁酸混合酯类)、乙基纤维素、甲基纤维素、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、玉米淀粉、磷酸化玉米淀粉、预胶化玉米淀粉、大米淀粉、马铃薯淀粉、木薯淀粉、淀粉
‑
乳糖、淀粉
‑
碳酸钙、羟基乙酸淀粉钠、葡萄糖、果糖、乳糖、一水合乳糖、蔗糖、木糖、乳糖醇、甘露醇、麦芽糖醇、山梨糖醇、木糖醇、麦芽糖糊精和海藻糖。
[0069]
在另一个实施方式中，赋形剂可以包括粘合剂。合适的粘合剂可以包括但不限于：淀粉类、预胶化淀粉类、明胶、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、乙基纤维素、聚丙烯酰胺类、聚乙烯噁唑烷酮、聚乙烯醇类、c12
‑
c18脂肪酸醇、聚乙二醇、多元醇类、糖类、寡糖类、多肽类、寡肽类以及它们的组合。
[0070]
在另一个实施方式中，赋形剂可以包括填充剂。合适的填充剂可以包括但不限于：碳水化合物、无机化合物和聚乙烯吡咯烷酮。作为非限制性实例，填充剂可以为：二碱式和三碱式硫酸钙、淀粉、碳酸钙、碳酸镁、微晶纤维素、二碱式磷酸钙、碳酸镁、氧化镁、硅酸钙、滑石、改性淀粉类、乳糖、蔗糖、甘露醇或山梨糖醇。
[0071]
在又一个实施方式中，赋形剂可以包括缓冲剂。缓冲液可以包括磷酸盐类、碳酸盐类、柠檬酸盐类等。合适的缓冲剂的代表性实例可以包括但不限于：mops、hepes、taps、bicine、tricine、tes、pipes、mes、tris缓冲液或缓冲盐水盐类(例如，tris缓冲盐水或磷酸
盐缓冲盐水)。
[0072]
在各种实施方式中，赋形剂可以包括ph改性剂。作为非限制性实例，ph改性剂可以为碳酸钠或碳酸氢钠。
[0073]
在另一个替代性实施方式中，赋形剂还可以包括防腐剂。合适防腐剂的非限制性实例可以包括抗氧化剂，诸如α
‑
生育酚或抗坏血酸盐，或edta(乙二胺四乙酸)、egta(乙二醇四乙酸)、bha(丁基羟基茴香醚)、bht(丁基羟基甲苯)等。
[0074]
在进一步的实施方式中，赋形剂可以包括崩解剂。合适的崩解剂可以包括但不限于：淀粉类，诸如玉米淀粉、马铃薯淀粉、其预胶化和改性的淀粉类；甜味剂；粘土，诸如膨润土；微晶纤维素；藻酸盐类；羟基乙酸淀粉钠；树胶类，诸如琼脂、瓜尔豆胶、槐豆胶、刺梧桐胶、果胶和黄芪胶。
[0075]
在又一个实施方式中，赋形剂可以包括分散增强剂。合适的分散剂可以包括但不限于：淀粉、藻酸、聚乙烯吡咯烷酮类、瓜尔豆胶、高岭土、膨润土、纯化木纤维素、羟基乙酸淀粉钠、同晶形硅酸盐和微晶纤维素。
[0076]
在进一步的实施方式中，赋形剂可以包括润滑剂。合适润滑剂的非限制性实例可以包括：矿物质，诸如滑石或二氧化硅；以及脂肪类，诸如植物硬脂、硬脂酸镁或硬脂酸。
[0077]
在又一个实施方式中，可能期望提供着色剂。合适的颜色添加剂可以包括但不限于：食品、药物和化妆品色素(fd&c)、药物和化妆品色素(d&c)或外用药物和化妆品色素(ext.d&c)。
[0078]
组合物中的一种或多种赋形剂的重量分数可以为该组合物的总重量的约99％或更少、约95％或更少、约90％或更少、约85％或更少、约80％或更少、约75％或更少、约70％或更少、约65％或更少、约60％或更少、约55％或更少、约50％或更少、约45％或更少、约40％或更少、约35％或更少、约30或更少、约25％或更少、约20％或更少、约15％或更少、约10％或更少、约5％或更少、约2％、或约1％或更少。
[0079]
药物组合物可以与一种或多种赋形剂混合以形成固体、液体或乳膏剂型。配制固体、液体或乳膏剂型的方法是本领域已知的。
[0080]
(iii)制备包含式(i)的化合物的工艺
[0081]
在又一方面，本公开提供了制备包含式(i)的化合物的工艺。所述工艺开始于将吗啡喃或去甲吗啡喃上的6
‑
酮基位置转化为α异构体或β异构体中对应的氨基、羟基或硫醇基。这些工艺是本领域公开的和已知的。
[0082]
该工艺的下一步包括：使氨基、羟基或硫醇基与酰基接触以形成酰胺、酯或硫酯。这些工艺可以使用酰基偶联剂、质子受体和至少一种溶剂。这些工艺可以在各种温度和压力下进行。许多工艺是技术人员已知的以及本领域公开的。
[0083]
(iv)治疗κ阿片受体相关疾病或病症的方法
[0084]
在又一方面，本公开提供了一种治疗κ阿片受体相关疾病或病症的方法，其中所述方法包括：向有此需要的受试者给药包含式(i)的化合物的药物组合物。
[0085]
不受任何理论的束缚，认为包含式(i)的化合物主要作为激动剂介导κ阿片受体活性。认为该位置处的结合可治疗疼痛、瘙痒、成瘾、抑郁、压力、焦虑、自身免疫性病症、心肌梗塞、炎症、水肿、呕吐或神经系统疾病。
[0086]
可以通过多种途径将化合物给药于受试者。例如，可以通过以下方式给药包含式
(i)的化合物：经由固体或液体剂型(片剂、囊形片、缓释胶囊粉、溶液、或者水性或非水性液体中的悬浮液)口服给药，肠胃外(即，皮下、皮内、静脉内(即，作为载体中的溶液、悬浮液或乳剂)、肌肉内、颅内或腹膜内)给药，或局部(即，经皮或经粘膜，包括但不限于口腔、直肠、阴道和舌下)给药。在一个实施方式中，可以将化合物在盐水中或与如上所述的药学上可接受的赋形剂一起给药。可以将该化合物作为主要治疗剂或作为辅助治疗剂在局部干预(手术、放射、局部化学治疗)之后或结合至少一种其他化学治疗剂进行给药。
[0087]
合适的受试者可以包括但不限于：人类以及伴侣动物，诸如猫、狗、啮齿动物和马；研究动物，诸如兔、羊、猪、狗、灵长类动物、小鼠、大鼠和其他啮齿动物；农业动物，诸如奶牛、牛、猪、山羊、羊、马、鹿、鸡和其他家禽；动物园动物；以及灵长类动物，诸如黑猩猩、猴和大猩猩。受试者可以是任何年龄而不受限制。在优选的实施方式中，受试者可以是人类。
[0088]
通常，将以包括预防量或更低剂量(例如，当与另一种药剂组合时)的治疗有效量给药包含式(i)的化合物。如本文所用，“有效量”是指化合物的剂量足以提供足够高的循环浓度以赋予其接受者有益效果。考虑到期望的剂量、副作用和患者的病史，技术人员可以确定准确的给药量。
[0089]
通常，包含式(i)的化合物具有小于约10nm的ec
50
的κ受体结合亲和力。在各种实施方式中，包含式(i)的化合物具有小于约10nm、或小于8nm、或小于约4nm、或小于约1nm的ec
50
。i
[0090]
一般而言，式(i)的化合物在flipr钙测定中在全细胞中具有小于10nm的ec
50
。在各种实施方式中，包含式(i)的化合物具有小于约10nm、或小于8nm、或小于约4nm、或小于约3nm的ec
50
。
[0091]
定义
[0092]
本文所述的化合物具有不对称中心。可以以旋光或外消旋的形式分离本发明的含有不对称取代的原子的化合物。结构的所有手性、非对映异构、外消旋的形式和所有几何异构形式都是预期的，除非具体指出具体的立体化学或异构形式。
[0093]
术语“酰基”在本文中单独使用或作为另一个基团的一部分使用时，表示通过从有机羧酸的基团cooh中除去羟基而形成的部分，例如rc(o)
‑
，其中r为r1、r1o
‑
、r1r2n
‑
或r1s
‑
，r1为烃基、杂取代的烃基或杂环，并且r2为氢、烃基或取代的烃基。
[0094]
术语“酰氧基”在本文中单独使用或作为另一个基团的一部分使用时，表示通过氧键(o)键合的上述酰基，例如，rc(o)o
–
，其中与术语“酰基”相结合来定义r。
[0095]
如本文所用，术语“烷基”描述这样的基团，所述基团优选为在主链中含有1至8个碳原子且至多20个碳原子的低级烷基。它们可以是直链或支链或环状的，并且包括甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、己基等。
[0096]
如本文所用，术语“烯基”描述这样的基团，所述基团优选为在主链中含有2至8个碳原子且至多20个碳原子的低级烯基。它们可以是直链或支链或环状的，并且包括乙烯基、丙烯基、异丙烯基、丁烯基、异丁烯基、己烯基等。
[0097]
如本文所用，术语“炔基”描述这样的基团，所述基团优选为在主链中含有2至8个碳原子且至多20个碳原子的低级炔基。它们可以是直链或支链的，并且包括乙炔基、丙炔基、丁炔基、异丁炔基、己炔基等。
[0098]
术语“芳族”在本文中单独使用或作为另一个基团的一部分使用时，表示可选地取
代的同素环或杂环共轭平面环或包含离域电子的环系统。这些芳族基团优选为在环部分含有5至14个原子的单环(例如，呋喃或苯)、双环或三环基团。术语“芳族”包括以下定义的“芳基”。
[0099]
术语“芳基”或“ar”在本文中单独使用或作为另一个基团的一部分使用时，表示可选地取代的同素环芳族基团，优选为在环部分中含有6至10个碳的单环或双环基团，诸如苯基、联苯基、萘基、取代的苯基、取代的联苯基或取代的萘基。
[0100]
术语“碳环(carbocyclo)”或“碳环(carbocyclic)”在本文中单独使用或作为另一个基团的一部分使用时，表示可选地取代的芳族或非芳族的同素环或环系统，其中环中所有的原子都是碳，其中优选为每个环中有5个或6个碳原子。示例性的取代基包括以下基团中的一个或多个：烃基、取代的烃基、烷基、烷氧基、酰基、酰氧基、烯基、烯氧基、芳基、芳氧基、氨基、酰胺基、缩醛基、氨基甲酰基、碳环、氰基、酯基、醚基、卤素、杂环、羟基、酮基、缩酮基、磷基、硝基和硫代。
[0101]
术语“卤素”或“卤代”在本文中单独使用或作为另一个基团的一部分使用时是指氯、溴、氟和碘。
[0102]
术语“杂原子”是指除碳和氢以外的原子。
[0103]
术语“杂芳族”在本文中单独使用或作为另一个基团的一部分使用时，表示在至少一个环中具有至少一个杂原子且优选为在每个环中具有5个或6个原子的可选地取代的芳族基团。杂芳族基团优选为在环中具有1个或2个氧原子和/或1至4个氮原子，并且通过碳键合到分子的其余部分。示例性基团包括：呋喃基、苯并呋喃基、噁唑基、异噁唑基、噁二唑基、苯并噁唑基、苯并噁二唑基、吡咯基、吡唑基、咪唑基、三唑基、四唑基、吡啶基、嘧啶基、吡嗪基、哒嗪基、吲哚基、异吲哚基、吲哚嗪基、苯并咪唑基、吲唑基、苯并三唑基、四唑并哒嗪基、咔唑基、嘌呤基、喹啉基、异喹啉基、咪唑并吡啶基等。示例性取代基包括以下基团中的一个或多个：烃基、取代的烃基、烷基、烷氧基、酰基、酰氧基、烯基、烯氧基、芳基、芳氧基、氨基、酰胺基、缩醛基、氨基甲酰基、碳环、氰基、酯基、醚基、卤素、杂环、羟基、酮基、缩酮基、磷基、硝基和硫代。
[0104]
术语“杂环(heterocyclo)”或“杂环(heterocyclic)”在本文中单独使用或作为另一个基团的一部分使用时，表示在至少一个环中具有至少一个杂原子以及优选为在每个环中具有5个或6个原子的可选地取代的、完全饱和或不饱和的、单环或双环的、芳族或非芳族基团。杂环基团优选为在环中具有1个或2个氧原子和/或1至4个氮原子，并通过碳或杂原子与分子的其余部分键合。示例性杂环基团包括如上所述的杂芳族化合物。示例性的取代基包括以下基团中的一个或多个：烃基、取代的烃基、烷基、烷氧基、酰基、酰氧基、烯基、烯氧基、芳基、芳氧基、氨基、酰胺基、缩醛基、氨基甲酰基、碳环、氰基、酯基、醚基、卤素、杂环、羟基、酮基、缩酮基、磷基、硝基和硫代。
[0105]
如本文所用，术语“烃”和“烃基”描述仅由元素碳和氢组成的有机化合物或自由基。这些部分包括烷基、烯基、炔基和芳基部分。这些部分还包括被其他脂族或环状烃基取代的烷基、烯基、炔基和芳基部分，诸如烷芳基、烯芳基和炔芳基。除非另有说明，否则这些部分优选为包含1至20个碳原子。
[0106]
如本文所用，术语“氧保护基团”表示能够保护氧原子(并因此形成受保护的羟基)的基团，其中可以在采用保护的反应之后除去保护基团，而不会干扰分子的其余部分。示例
性氧保护基团包括：醚基(例如，烯丙基、三苯甲基(三苯甲游基或tr)、对甲氧基苄基(pmb)、对甲氧基苯基(pmp))、缩醛基(例如，甲氧基甲基(mom)、β
‑
甲氧基乙氧基甲基(mem)、四氢吡喃基(thp)、乙氧基乙基(ee)、甲硫基甲基(mtm)、2
‑
甲氧基
‑2‑
丙基(mop)、2
‑
三甲基甲硅烷基乙氧基甲基(sem))、酯基(例如，苯甲酸盐(bz)、烯丙基碳酸盐、2,2,2
‑
三氯乙基碳酸盐(troc)、2
‑
三甲基甲硅烷基乙基碳酸盐)、甲硅烷基醚基(例如，三甲基甲硅烷基(tms)、三乙基甲硅烷基(tes)、三异丙基甲硅烷基(tips)、三苯基甲硅烷基(tps)、叔丁基二甲基甲硅烷基(tbdms)、叔丁基二苯基甲硅烷基(tbdps)等)。各种氧保护基团及其合成可见于《格林氏有机合成中的保护基(greene’s protective groups in organic synthesis)》,第4版.p.g.m.wuts和t.w.greene著,john wiley&sons,inc.,2007。
[0107]
本文所述的“取代的烃基”部分是被至少一个碳以外的原子取代的烃基部分，其包括碳链原子被杂原子(诸如氮、氧、硅、磷、硼或卤素原子)取代的部分以及碳链包含额外的取代基的部分。这些取代基包括：烷基、烷氧基、酰基、酰氧基、烯基、烯氧基、芳基、芳氧基、氨基、酰胺基、缩醛基、氨基甲酰基、碳环、氰基、酯基、醚基、卤素、杂环、羟基、酮基、缩酮基、磷基、硝基和硫代。
[0108]
在介绍本发明的要素或其一个或多个优选实施方式时，冠词“一个(a)”、“一个(an)”、“该(the)”和“所述(said)”旨在表示存在一个或多个要素。术语“包含(comprising)”、“包括(including)”和“具有(having)”旨在是包括性的，并且意味着除了所列要素之外可能还有其他要素。
[0109]
已经详细描述了本发明，显而易见的是，在不脱离所附权利要求中限定的本发明的范围的情况下，可以进行修改和变化。
[0110]
实例
[0111]
包括以下实例以说明本发明的某些实施方式。本领域技术人员应当理解，实例中公开的技术代表本发明人发现的在本发明的实践中发挥良好作用的技术。然而，本领域技术人员根据本公开应当理解，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，可以对所公开的具体实施方式进行许多改变并且仍然获得相似或相似的结果，因此，所阐述的所有事项均应被解释为具有例示性的而非限制性的含义。
[0112]
实例1：6β
‑
n
‑
methylnaltrexamine(4)的制备
[0113][0114]
6β
‑
n
‑
苄基
‑
n
‑
methylnaltrexamine(3)的制备
[0115]
向纳曲酮(2)(9.15g，26.8mmol)在250ml甲苯中的搅拌溶液中加入n
‑
苄基甲胺(3.6ml，28mmol)和对甲苯磺酸一氢化物(51mg，0.268mmol)。反应烧瓶配备有dean
‑
stark分水器并回流17小时。除去甲苯并将粗产物溶解在75ml甲醇中。然后将nabh3cn(2.1g，32.7mmol)加入到所得溶液中并将混合物在0℃下搅拌。搅拌2h后，lc
‑
ms指示反应完成。溶液在旋转蒸发器上浓缩。向残余物中加入乙酸乙酯，然后加入饱和碳酸氢钠溶液。分离有机相，并将水相用乙酸乙酯萃取两次。将合并的有机层依次用饱和碳酸氢钠水溶液、饱和nacl水溶液洗涤，用无水硫酸钠干燥，然后真空浓缩得到残余物。将残余物在硅胶上用己烷/乙酸乙酯作为流动相进行色谱分析，得到9.2g非晶形固体形式的化合物(3)。
[0116]
6β
‑
n
‑
methylnaltrexamine(4)的制备
[0117]
向parr瓶中加入6β
‑
n
‑
苄基
‑
n
‑
methylnaltrexamine(3)(4.3mmol)、10％钯碳(用约50％水润湿，190mg)和冰醋酸(30ml)。将parr瓶与parr加氢装置相连，并且用氮气冲洗三次，然后用氢气冲洗三次。使混合物在室温和35psi氢气压力下反应24小时。取出反应等分试样并且lc
‑
ms指示反应完成。从parr加氢装置中移除parr瓶，并将反应混合物通过硅藻土过滤。浓缩滤液。向残余物中加入水(15ml)，然后使用29％氨将ph调节至9。将所得混合物用1:9甲醇/氯仿萃取，合并有机萃取液，并用无水硫酸钠干燥。真空浓缩干燥的有机溶液，在硅胶柱上用甲醇/dcm/et3n混合物作为流动相纯化残余物，浓缩收集的级分，并进行真空干燥，得到1.2g产物。lc
‑
ms上m h

＝357.47；1h nmr(cdcl3)δppm 6.65(1h,d,j＝8.0hz),6.54(1h,d,j＝8.0hz),4.53(1h,d,j＝8.0hz),3.05
‑
2.97(2h,m),2.64
‑
2.54(3h,m),2.49(s,3h),2.36(d,2h,j＝4hz),2.22
‑
2.13(m,2h),1.95
‑
1.92(1h,m),1.67
‑
1.60(2h,m),1.45
‑
1.40(2h,m),0.84
‑
0.81(1h,m),0.52(2h,d,j＝8hz),0.12
‑
0.11(2h,m)。
[0118]
实例2：化合物5(a)和5(b)的制备
[0119][0120]
17
‑
环丙基甲基
‑
4,5α
‑
环氧
‑
3,14β
‑
二羟基
‑
6β
‑
((1s,2s)
‑
n
‑
甲基
‑2‑
(3
‑
呋喃基)
‑
环丙烷羧酰胺)吗啡喃盐酸盐(5a)的制备
[0121]
向6β
‑
n
‑
methylnaltrexamine(4)(0.5g，1.4mmol)、(1s,2s)
‑2‑
(3
‑
呋喃基)环丙烷
‑1‑
羧酸(0.22g，1.4mmol)、dmf(5.0ml)的混合物中加入hatu(1
‑
[双(二甲氨基)亚甲基]
‑
1h
‑
1,2,3
‑
三唑并[4,5
‑
b]吡啶鎓3
‑
氧化六氟磷酸盐)(0.53g，1.4mmol)和三乙胺(0.39ml，2.8mmol)。将所得黄色溶液在室温下在氮气下搅拌两小时，此时lc
‑
ms指示反应完成。向反应溶液中加入乙酸乙酯(70ml)。将所得溶液用卤水洗涤，然后用无水硫酸钠干燥。在旋转蒸发器上浓缩干燥的有机相。在硅胶上纯化残余物，用et3n/meoh/ch2cl2的混合物洗脱。在真空下浓缩收集的所需级分。将获得的油产物溶解在乙酸乙酯中并将该溶液在冰浴中冷却。向冷却的溶液中加入等量的1.0n hcl的乙醚溶液。在真空下浓缩所得混合物以得到0.4g灰白色固体。lc
‑
ms上m h

＝491.37。
[0122]
17
‑
环丙基甲基
‑
4,5α
‑
环氧
‑
3,14β
‑
二羟基
‑
6β
‑
((1r,2r)
‑
n
‑
甲基
‑2‑
(3
‑
呋喃基)
‑
环丙烷羧酰胺)吗啡喃盐酸盐(5b)的制备
[0123]
向6β
‑
n
‑
methylnaltrexamine(4)(0.5g，1.4mmol)、(1r,2r)
‑2‑
(3
‑
呋喃基)环丙烷
‑1‑
羧酸(0.22g，1.4mmol)、dmf(5.0ml)的混合物中加入hatu(0.53g，1.4mmol)和三乙胺(0.39ml，2.8mmol)。将所得黄色溶液在室温下在氮气下搅拌两小时，此时lc
‑
ms指示反应完成。向反应溶液中加入乙酸乙酯(70ml)，并将所得溶液用卤水洗涤。将有机相用无水硫酸钠干燥。将干燥的有机相在旋转蒸发器上浓缩得到残余物。在硅胶上纯化残余物，用et3n/meoh/ch2cl2的混合物洗脱。在真空下浓缩收集的所需级分。将获得的油产物溶解在乙酸乙酯中，并将所得溶液在冰浴中冷却。向该溶液中加入等量的1.0n hcl乙醚溶液。在真空下浓缩所得混合物得到0.5g灰白色固体形式的化合物(3)。lc
‑
ms上m h

＝491.36。
[0124]
实例3：6α
‑
n
‑
methylnaltrexamine(6)的制备
[0125][0126]
向纳曲酮hcl(2)(10.g，26.5mmol)和thf(150ml)的混合物中加入menh2溶液(2.0n，15ml，30mmol)。将所得混合物在室温下在氮气下搅拌30分钟。然后，在两小时后加入nahb(oac)3(12.3g，56.2mmol)。然后，通过缓慢加入1％hcl溶液(60ml)淬灭反应。将该溶液在室温下搅拌15分钟，并用nahco3粉末将ph值调节至8.5。分离顶部有机相；将水相用meoh/
ch2cl2萃取。将合并的有机萃取液用无水硫酸钠干燥。在真空下浓缩干燥的有机溶液。在硅胶柱上进一步纯化残余物，用meoh/ch2cl2/et3n洗脱。获得灰白色固体形式的产物，lc
‑
ms上m h

＝357.20。
[0127]
实例4：化合物7(a)和7(b)的制备。
[0128][0129]
17
‑
环丙基甲基
‑
4,5α
‑
环氧
‑
3,14β
‑
二羟基
‑
6α
‑
((1s,2s)
‑
n
‑
甲基
‑2‑
(3
‑
呋喃基)
‑
环丙烷羧酰胺)吗啡喃盐酸盐(7a)的制备
[0130]
向6α
‑
n
‑
methylnaltrexamine(6)(0.5g，1.4mmol)、(1s,2s)
‑2‑
(3
‑
呋喃基)环丙烷
‑1‑
羧酸(0.22g，1.4mmol)、dmf(5.0ml)的混合物中加入hatu(0.53g，1.4mmol)和三乙胺(0.39ml，2.8mmol)。将所得黄色溶液在室温下在氮气下搅拌两小时，此时lc
‑
ms指示反应完成。向反应溶液中加入乙酸乙酯(70ml)。将所得溶液用卤水洗涤，并将有机相用无水硫酸钠干燥。在真空下浓缩干燥的有机相并且在硅胶上纯化残余物，用et3n/meoh/ch2cl2的混合物洗脱。在真空下浓缩收集的所需级分。将获得的油产物溶解在乙酸乙酯中并在冰浴中冷却。向冷却的溶液中加入等量的1.0n hcl的乙醚溶液。在真空下浓缩所得混合物以得到0.3g灰白色固体。lc
‑
ms上m h

＝491.24。
[0131]
17
‑
环丙基甲基
‑
4,5α
‑
环氧
‑
3,14β
‑
二羟基
‑
6α
‑
((1r,2r)
‑
n
‑
甲基
‑2‑
(3
‑
呋喃基)
‑
环丙烷羧酰胺)吗啡喃盐酸盐(7b)的制备
[0132]
向6α
‑
n
‑
methylnaltrexamine(6)(0.5g，1.4mmol)、(1r,2r)
‑2‑
(3
‑
呋喃基)环丙烷
‑1‑
羧酸(0.22g，1.4mmol)、dmf(5.0ml)的混合物中加入hatu(0.53g，1.4mmol)和三乙胺(0.39ml，2.8mmol)。将所得黄色溶液在室温下在氮气下搅拌两小时，此时lc
‑
ms指示反应完成。向反应溶液中加入乙酸乙酯(70ml)。将所得溶液用卤水洗涤，并将有机相用无水硫酸钠干燥。将干燥的有机相在旋转蒸发器上浓缩，并且在硅胶上纯化残余物，用et3n/meoh/ch2cl2的混合物洗脱。在真空下浓缩收集的所需级分。将获得的油产物溶解在乙酸乙酯中并在冰浴中冷却。向冷却的溶液中加入等量的1.0n hcl的乙醚溶液。在真空下浓缩所得混合物以得到0.35g灰白色固体。lc
‑
ms上m h

＝491.38。
[0133]
实例5：17
‑
(1
‑
羟基环丙烷甲基)
‑
4,5α
‑
环氧
‑
6β
‑
甲胺基
‑
3,14β
‑
二羟基吗啡喃(12)的合成
[0134][0135]
17
‑
(1
‑
乙酰氧基环丙烷羧酰胺)
‑3‑
苯甲酸基
‑
4,5α
‑
环氧
‑6‑
氧代
‑
14β
‑
羟基吗啡喃(9)的合成
[0136]
在氮气下向三颈反应烧瓶中放入起始物料(8)(14.0g，37.1mmol)，然后加入二氯甲烷(150ml)和三乙胺(22.40g，221mmol)；将所得混合物在冰浴中冷却，向冷反应物中加入酰氯(17.6g，122.1mmol)。加完后，移除冰浴；将反应物在室温下搅拌4小时；lc
‑
ms分析指示反应完成；将反应物置于冰浴中，然后缓慢加入水(200ml)淬灭反应；用稀氯化氢将反应混合物的ph值调节至4
‑
5。分离有机相，将水相用二氯甲烷(250ml x3)萃取。将合并的有机萃取液用无水硫酸钠干燥。过滤后，在真空下浓缩干燥的有机相；得到10.18g深黄色固体，lc
‑
ms上[m h]

＝504.6。
[0137]
17
‑
(1
‑
乙酰氧基环丙烷羧酰胺)
‑3‑
苯甲酸基
‑
4,5α
‑
环氧
‑
6β
‑
苄基(甲基)氨基
‑
14β
‑
羟基吗啡喃(10)的合成
[0138]
向三颈反应烧瓶中放入中间体(9)(5.0g，9.9mmol)和苯(100ml)；向所得溶液中加入苯甲酸(1.21g，9.9mmol)和苄基甲胺(2.41g，19.8mmol)。将所得混合物加热回流，共沸蒸馏24小时。然后，将反应物冷却至室温。向反应物中加入甲醇(20ml)，然后加入氰基硼氢化钠(0.94g，15.0mmol)。将反应物在室温下搅拌2小时。lc
‑
ms分析指示反应完成。向反应物中加入水(20ml)和饱和碳酸氢钠溶液(100ml)。将产物用乙酸乙酯(3x100ml)萃取。将合并的有机萃取物用卤水(200ml)洗涤并用无水硫酸钠干燥。过滤后，在真空下浓缩干燥的有机溶液；在硅胶柱上用乙酸乙酯/己烷/甲醇/三乙胺的混合物进一步纯化粗物料。在真空下浓缩收集的级分，得到6.0g油物料，lc
‑
ms上[m h]

＝609.7。
[0139]
17
‑
(1
‑
羟基环丙烷甲基)
‑3‑
苯甲酸基
‑
4,5α
‑
环氧
‑
6β
‑
苄基(甲基)氨基
‑
14β
‑
羟基吗啡喃(11)的合成
[0140]
在氮气下在三颈反应烧瓶中放入中间体(10)(6.0g，9.86mmol)和thf。向所得溶液中加入lialh4(1.50g，39.5mmol)，将反应物加热回流2
‑
4小时；lc
‑
ms分析指示反应完成。将反应物冷却至室温，然后将反应物倒入冰/水混合物(150ml)中；然后向混合物中加入20％氢氧化钠溶液(2ml)，接着加入乙酸乙酯(150ml)。分离有机相，并将水相用乙酸乙酯(2x150ml)萃取。将合并的有机萃取物通过硅藻土过滤；分离有机滤液并用无水硫酸钠干燥。过滤后，在真空下浓缩干燥的有机相。在硅胶柱上用乙酸乙酯/己烷/甲醇/三乙胺的混
合物进一步纯化粗物料，在真空下浓缩收集的级分，得到3.16g油物料；lc
‑
ms上[m h]

＝553.7。1h nmr(400mhz,cdcl3):0.43
‑
0.48(2h,m),0.82
‑
0.87(2h,m),1.30
‑
1.70(4h,m),1.95
‑
2.8(1h,m),2.15
‑
2.32(2h,m),2.35(3h,s),2.53(1h,d,j＝12.8hz),2.60
‑
2.70(2h,m),2.75(1h,d,j＝12.8hz),2.72
‑
2.82(1h,m),2.97
‑
3.8(2h,m),3.72(1h,d,j＝13.6hz),3.81(1h,d,j＝13.6hz),4.77(1h,d,j＝7.6hz),5.22(2h,s),6.53(1h,d,j＝8.0hz),6.73(1h,d,j＝8.0hz),7.15
‑
7.51(10h)。
[0141]
17
‑
(1
‑
羟基环丙烷甲基)
‑
4,5α
‑
环氧
‑
6β
‑
甲胺基
‑
3,14β
‑
二羟基吗啡喃(12)的合成
[0142]
向加氢反应烧瓶中加入中间体(11)(3.16.0g，5.72mmol和甲醇(30ml)，然后加入邻苯二甲酸(1.9g，11.4mmol)和10％pd/c(2.36g)。反应在氢气氛下在室温下进行24小时。lc
‑
ms分析指示反应完成。将反应物通过硅藻土过滤，并将滤液在真空下浓缩，得到3.38g灰色固体。lc
‑
ms上[m h]

＝373.5。
[0143]
实例6：17
‑
(1
‑
羟基环丙烷甲基)
‑
4,5α
‑
环氧
‑
6α
‑
甲氨基
‑
3,14β
‑
二羟基吗啡喃(15)的制备
[0144][0145]
17
‑
(1
‑
乙酰氧基环丙烷羧酰胺)
‑3‑
苯甲酸基
‑
4,5α
‑
环氧
‑
6α
‑
苄基(甲基)氨基
‑
14β
‑
羟基吗啡喃(13)的合成
[0146]
向三颈圆底烧瓶中加入中间体(9)(3.0g，5.96mmol)和甲醇(10ml)，然后加入30％甲胺的甲醇溶液(2.4g，23.1mmol)和乙酸(0.1ml)。将所得混合物在室温下搅拌2小时，然后将反应物置于冰浴中。加入氰基硼氢化钠(1.5g，23.9mmol)。移除冰浴并将反应物在室温下搅拌24小时。lc
‑
ms分析指示反应完成。向反应物中加入水(50ml)，然后加入乙酸乙酯(150ml)。用饱和碳酸氢钠溶液将混合物的ph调节至约为8。分离有机相并用乙酸乙酯(150ml x2)萃取水相。将合并的有机萃取液用无水硫酸钠干燥。在真空下浓缩干燥的有机萃取物，得到3.15g固体。lc
‑
ms上[m h]

＝519.6。
[0147]
17
‑
(1
‑
羟基环丙烷甲基)
‑3‑
苯甲酸基
‑
4,5α
‑
环氧
‑
6α
‑
甲氨基
‑
14β
‑
羟基吗啡喃(14)的合成
[0148]
在氮气下在三颈反应烧瓶中放入中间体(13)(3.15g，6.07mmol)和thf(30ml)。向
所得溶液中加入lialh4((0.69g，18.2mmol)；将反应物加热回流2
‑
4小时；lc
‑
ms分析指示反应完成。将反应物冷却至室温，然后倒入冰/水混合物(100ml)中。然后向混合物中加入20％氢氧化钠溶液(1.5ml)，接着加入乙酸乙酯(100ml)。分离有机相，并将水相用乙酸乙酯(2x100ml)萃取。将合并的有机萃取液通过硅藻土过滤，分离有机滤液，并用无水硫酸钠干燥。过滤后，将干燥的有机相在真空下浓缩得到油1.98g；lc
‑
ms上[m h]

＝463.6。
[0149]
17
‑
(1
‑
羟基环丙烷甲基)
‑
4,5α
‑
环氧
‑
6α
‑
甲氨基
‑
3,14β
‑
二羟基吗啡喃的(15)合成
[0150]
在氮气下向加氢反应烧瓶中放入中间体(14)(3.16.0g，5.72mmol)和甲醇(30ml)，然后加入邻苯二甲酸(1.42g，8.54mmol)和10％pd/c(1.78g)。然后在氢气氛下在室温下进行反应24小时。lc
‑
ms分析指示反应完成。将反应物通过硅藻土过滤并在真空下浓缩得到2.72g灰色固体。lc
‑
ms上[m h]

＝373.5。
[0151]
实例7：化合物16(a)和16(b)的制备
[0152][0153]
17
‑
(1
‑
羟基环丙基甲基)
‑
4,5α
‑
环氧
‑
3,14β
‑
二羟基
‑
6α
‑
((1s,2s)
‑
n
‑
甲基
‑2‑
(3
‑
呋喃基)
‑
环丙烷羧酰胺)吗啡喃三氟乙酸盐(16a)的制备
[0154]
在室温下在氮气下向三颈反应烧瓶中加入(1s,2s)
‑2‑
(3
‑
呋喃基)环丙烷
‑1‑
羧酸(20mg，0.134mmol)、中间体(15)(50mg，0.134mmol)和thf(1.0ml)；搅拌溶解固体后，加入depbt(3
‑
(二乙氧基磷酰氧基)
‑
1,2,3
‑
苯并三嗪
‑
4(3h)
‑
酮)(80mg,0.268mmol)和三乙胺(27mg,0.268mmol)。将反应物在室温下搅拌过夜。lc
‑
ms分析指示反应完成。在真空下除去溶剂。向残余物中加入二氯甲烷(2.0ml)。将所得溶液用5％nahso4水溶液(2.0ml x3)、5％nahco3水溶液(2.0ml x3)和卤水(2.0ml x3)洗涤。将有机相用无水硫酸钠干燥并过滤。然后在真空下浓缩滤液。在反相lc上用流动相(a：0.01％tfa/h2o，b：100％acn)进一步纯化残余物。合并收集的级分，并在冻干后获得10mg白色粉末产物，产率＝14.7％。lc
‑
ms上[m h]

＝507.6。
[0155]
17
‑
(1
‑
羟基环丙基甲基
‑
4,5α
‑
环氧
‑
3,14β
‑
二羟基
‑
6α
‑
((1r,2r)
‑
n
‑
甲基
‑2‑
(3
‑
呋喃基)
‑
环丙烷羧酰胺)吗啡喃三氟乙酸盐(16b)的制备
[0156]
在室温下在氮气下向三颈反应烧瓶中加入(1r,2r)
‑2‑
(3
‑
呋喃基)环丙烷
‑1‑
羧酸(20mg，0.134mmol)、中间体(15)(50mg，0.134mmol)和thf(1.0ml)；搅拌溶解固体后，加入depbt(80mg，0.268mmol)和三乙胺(27mg，0.268mmol)。将反应物在室温下搅拌过夜。lc
‑
ms分析指示反应完成并且在真空下除去溶剂。向残余物中加入二氯甲烷(2.0ml)。将所得溶液用5％nahso4水溶液(2.0ml x3)、5％nahco3水溶液(2.0m x3l)和卤水(2.0ml x3)洗涤。将有机相用无水硫酸钠干燥并过滤。然后在真空下浓缩滤液，在制备型lc上用流动相(a：0.01％tfa/h2o，b：100％acn)进一步纯化残余物。合并收集的级分；冻干后获得白色粉末形式的产
物：14mg，产率＝20.6％。lc
‑
ms上m h

＝507.6。
[0157]
实例8：化合物17(a)和17(b)的制备
[0158][0159]
17
‑
(1
‑
羟基环丙基甲基)
‑
4,5α
‑
环氧
‑
3,14β
‑
二羟基
‑
6β
‑
((1s,2s)
‑
n
‑
甲基
‑2‑
(3
‑
呋喃基)
‑
环丙烷羧酰胺)吗啡喃三氟乙酸盐(17a)的制备
[0160]
在室温下在氮气下向三颈反应烧瓶中加入(1s,2s)
‑2‑
(3
‑
呋喃基)环丙烷
‑1‑
羧酸(20mg，0.134mmol)、中间体(12)(50mg，0.134mmol)和thf(1.0ml)；搅拌溶解固体后，加入depbt(80mg，0.268mmol)和三乙胺(27mg，0.268mmol)。将反应物在室温下搅拌过夜。lc
‑
ms分析指示反应完成。在真空下除去溶剂。向残余物中加入二氯甲烷(2.0ml)，将所得溶液用5％nahso4水溶液(2.0ml x3)、5％nahco3水溶液(2.0ml x3)和卤水(2.0ml x3)洗涤。将有机相用无水硫酸钠干燥。然后在真空下浓缩滤液并且在制备型lc上用流动相(a：0.01％tfa/h2o，b：100％ac)进一步纯化残余物。合并收集的级分；冻干后得到14mg白色粉末形式的产物，产率＝20.6％。lc
‑
ms上[m h]

＝507.6。
[0161]
17
‑
(1
‑
羟基环丙基甲基)
‑
4,5α
‑
环氧
‑
3,14β
‑
二羟基
‑
6β
‑
((1r,2r)
‑
n
‑
甲基
‑2‑
(3
‑
呋喃基)
‑
环丙烷羧酰胺)吗啡喃三氟乙酸盐(17b)的制备
[0162]
在室温下在氮气下向三颈反应烧瓶中加入(1r,2r)
‑2‑
(3
‑
呋喃基)环丙烷
‑1‑
羧酸(20mg，0.134mmol)、中间体(12)(50mg，0.134mmol)和thf(1.0ml)；搅拌溶解固体后，加入depbt(80mg，0.268mmol)和三乙胺(27mg，0.268mmol)。将反应物在室温下搅拌过夜。lc
‑
ms分析指示反应完成。在真空下除去溶剂。向残余物中加入二氯甲烷(2.0ml)，将所得溶液用5％nahso4水溶液(2.0ml x3)、5％nahco3水溶液(2.0ml x3)和卤水(2.0ml x3)洗涤。将有机相用无水硫酸钠干燥并过滤。然后在真空下浓缩滤液并且在制备型lc上用流动相(a：0.01％tfa/h2o，b：100％acn)进一步纯化残余物。合并收集的级分；冻干后获得白色粉末形式的产物，产生白色粉末，21mg，产率＝30.9％。lc
‑
ms上[m h]

＝507.6。
[0163]
实例9：化合物18(a)和18(b)的制备。
[0164][0165]
17
‑
(1
‑
羟基环丙基甲基)
‑
4,5α
‑
环氧
‑
3,14β
‑
二羟基
‑
6α
‑
((1s,2s)
‑
n
‑
甲基
‑2‑
(3
‑
噻吩基)
‑
环丙烷羧酰胺)吗啡喃三氟乙酸盐(18a)的制备
[0166]
在室温下在氮气下向三颈反应烧瓶中加入(1s,2s)
‑2‑
(3
‑
噻吩基)环丙烷
‑1‑
羧酸(22.5mg，0.134mmol)、中间体(15)(50mg，0.134mmol)和thf(1.0ml)；搅拌溶解固体后，加入depbt(80mg，0.268mmol)和三乙胺(27mg，0.268mmol)。将反应物在室温下搅拌过夜。lc
‑
ms分析指示反应完成并且在真空下除去溶剂。向残余物中加入二氯甲烷(2.0ml)，并且将所得溶液用5％nahso4水溶液(2.0ml)、5％nahco3水溶液(2.0ml)和卤水(2.0ml x3)洗涤。将有机相用无水硫酸钠干燥并过滤。然后在真空下蒸发滤液，并且在制备型lc上用流动相(a：0.01％tfa/h2o，b：100％acn)进一步纯化残余物。合并收集的级分；冻干后得到15mg白色粉末形式的产物，产率＝21.4％。lc
‑
ms上[m h]

＝523.7。
[0167]
17
‑
(1
‑
羟基环丙基甲基)
‑
4,5α
‑
环氧
‑
3,14β
‑
二羟基
‑
6α
‑
((1r,2r)
‑
n
‑
甲基
‑2‑
(3
‑
呋喃基)
‑
环丙烷羧酰胺)吗啡喃三氟乙酸盐(18b)的制备
[0168]
在室温下在氮气下向三颈反应烧瓶中加入(1r,2r)
‑2‑
(3
‑
噻吩基)环丙烷
‑1‑
羧酸(22.5mg，0.134mmol)、中间体(15)(50mg，0.134mmol)和thf(1.0ml)；搅拌溶解固体后，加入depbt(80mg，0.268mmol)和三乙胺(27mg，0.268mmol)。将反应物在室温下搅拌过夜。lc
‑
ms分析指示反应完成。在真空下除去溶剂。向残余物中加入二氯甲烷(2.0ml)，将所得溶液用5％nahso4水溶液(2.0ml)、5％nahco3水溶液(2.0ml)和卤水(2.0ml x3)洗涤。将有机相用无水硫酸钠干燥并过滤。然后在真空下蒸发过滤的有机相。在制备型lc上用流动相(a：0.01％tfa/h2o，b：100％acn)进一步纯化残余物。合并收集的级分；冻干后得到6.5mg白色粉末形式的产物，产率＝9.3％。lc
‑
ms上[m h]

＝523.7。
[0169]
实例10：化合物19(a)和19(b)的制备
[0170][0171]
17
‑
(1
‑
羟基环丙基甲基)
‑
4,5α
‑
环氧
‑
3,14β
‑
二羟基
‑
6β
‑
((1s,2s)
‑
n
‑
甲基
‑2‑
(3
‑
噻吩基)
‑
环丙烷羧酰胺)吗啡喃三氟乙酸盐(19a)的制备
[0172]
在室温下在氮气下向三颈反应烧瓶中加入(1s,2s)
‑2‑
(3
‑
噻吩基)环丙烷
‑1‑
羧酸(22.5mg，0.134mmol)、中间体12(50mg，0.134mmol)和thf(1.0ml)；搅拌溶解固体后，加入depbt(80mg，0.268mmol)和三乙胺(27mg，0.268mmol)。将反应物在室温下搅拌过夜。lc
‑
ms分析指示反应完成。在真空下除去溶剂。向残余物中加入二氯甲烷(2.0ml)。将所得溶液用5％nahso4水溶液(2.0ml)、5％nahco3水溶液(2.0ml)和卤水(2.0ml x3)洗涤。将有机相用无水硫酸钠干燥并过滤。然后在真空下浓缩滤液。在反相lc上用流动相(a：0.01％tfa/h2o，b:100％acn)进一步纯化残余物。合并收集的级分；冻干后得到13mg白色粉末形式的产物，产率＝18.5％。lc
‑
ms上[m h]

＝523.7。
[0173]
17
‑
(1
‑
羟基环丙基甲基)
‑
4,5α
‑
环氧
‑
3,14β
‑
二羟基
‑
6β
‑
((1r,2r)
‑
n
‑
甲基
‑2‑
(3
‑
噻吩基)
‑
环丙烷羧酰胺)吗啡喃三氟乙酸盐(19b)的制备
[0174]
在室温下在氮气下向三颈反应烧瓶中加入(1r,2r)
‑2‑
(3
‑
噻吩基)环丙烷
‑1‑
羧酸(22.5mg，0.134mmol)、中间体12(50mg，0.134mmol)和thf(1.0ml)；搅拌溶解固体后，加入depbt(80mg，0.268mmol)和三乙胺(27mg，0.268mmol)。将反应物在室温下搅拌过夜。lc
‑
ms分析指示反应完成。在真空下除去溶剂。向残余物中加入二氯甲烷(2.0ml)，将所得溶液用5％nahso4水溶液(2.0ml x3)、5％nahco3水溶液(2.0ml x3)和卤水(2.0ml x3)洗涤。将有机相用无水硫酸钠干燥并过滤。然后在真空下蒸发滤液。在制备型lc上用流动相(a：0.01％tfa/h2o，b：100％acn)进一步纯化残余物。合并收集的级分；冻干后得到14mg白色粉末形式的产物，产率＝20.0％。lc
‑
ms上[m h]

＝523.7。
[0175]
实例11：化合物20(a)和20(b)的制备。
[0176][0177]
17
‑
(1
‑
羟基环丙基甲基)
‑
4,5α
‑
环氧
‑
3,14β
‑
二羟基
‑
6α
‑
((1s,2s)
‑
n
‑
甲基
‑2‑
(3
‑
(4
‑
羟基苯基)
‑
环丙烷羧酰胺)吗啡喃三氟乙酸盐(20a)的制备
[0178]
在室温下在氮气下向三颈反应烧瓶中加入(1s,2s)
‑2‑
(3
‑
噻吩基)环丙烷
‑1‑
羧酸(23.9mg，0.134mmol)、中间体(15)(50mg，0.134mmol)和thf(1.0ml)；搅拌溶解固体后，加入depbt(80mg，0.268mmol)和三乙胺(27mg，0.268mmol)。将反应物在室温下搅拌过夜。lc
‑
ms分析指示反应完成。在真空下除去溶剂。向残余物中加入二氯甲烷(2.0ml)，将所得溶液用5％nahso4水溶液(2.0ml)、5％nahco3水溶液(2.0ml)和卤水(2.0ml x3)洗涤。将有机相用无水硫酸钠干燥并过滤。然后在真空下浓缩滤液并且在制备型lc上用流动相(a：0.01％tfa/h2o，b：100％acn)进一步纯化获得的残余物。合并收集的级分；冻干后得到16mg白色粉末形式的产物，产率＝22.4％。lc
‑
ms上[m h]

＝533.6。
[0179]
17
‑
(1
‑
羟基环丙基甲基)
‑
4,5α
‑
环氧
‑
3,14β
‑
二羟基
‑
6α
‑
((1r,2r)
‑
n
‑
甲基
‑2‑
(3
‑
(4
‑
羟基苯基)
‑
环丙烷羧酰胺)吗啡喃三氟乙酸盐(20b)的制备
[0180]
在室温下在氮气下向三颈反应烧瓶中加入(1r,2r)
‑2‑
(3
‑
(4
‑
羟基苯基)环丙烷
‑1‑
羧酸(23.9mg，0.134mmol)、中间体(15)(50mg，0.134mmol)和thf(1.0ml)；搅拌溶解固体后，加入depbt(80mg，0.268mmol)和三乙胺(27mg，0.268mmol)。将反应物在室温下搅拌过夜。lc
‑
ms分析指示反应完成。在真空下除去溶剂。向残余物中加入二氯甲烷(2.0ml)，将所得溶液用5％nahso4水溶液(2.0ml x2)、5％nahco3水溶液(2.0ml x2)和卤水(2.0ml x3)洗涤。将有机相用无水硫酸钠干燥并过滤。然后在真空下浓缩滤液。在反相lc上用流动相(a：0.01％tfa/h2o，b：100％acn)进一步纯化残余物。合并收集的级分；冻干后得到13mg白色粉末形式的产物，产率＝18.2％。lc
‑
ms上[m h]

＝533.6。
[0181]
实例12：化合物21(a)和21(b)的制备。
[0182][0183]
17
‑
(1
‑
羟基环丙基甲基)
‑
4,5α
‑
环氧
‑
3,14β
‑
二羟基
‑
6β
‑
((1s,2s)
‑
n
‑
甲基
‑2‑
(3
‑
(4
‑
羟基苯基)
‑
环丙烷羧酰胺)吗啡喃三氟乙酸盐(21a)的制备
[0184]
在室温下在氮气下向三颈反应烧瓶中加入(1s,2s)
‑2‑
(3
‑
(4
‑
羟基苯基)环丙烷
‑1‑
羧酸(23.9mg，0.134mmol)、中间体(12)(50mg，0.134mmol)和thf(1.0ml)；搅拌溶解固体后，加入depbt(80mg，0.268mmol)和三乙胺(27mg，0.268mmol)。将反应物在室温下搅拌过夜。lc
‑
ms分析指示反应完成。在真空下除去溶剂。向残余物中加入二氯甲烷(2.0ml)，将所得溶液用5％nahso4水溶液(2.0ml)、5％nahco3水溶液(2.0ml)和卤水(2.0ml x3)洗涤。将有机相用无水硫酸钠干燥并过滤。然后在真空下蒸发滤液，在制备型lc上用流动相(a：0.01％tfa/h2o，b：100％acn)进一步纯化残余物。合并收集的级分；冻干后得到11mg白色粉末形式的产物，产率＝15.4％。lc
‑
ms上[m h]

＝533.6。
[0185]
17
‑
(1
‑
羟基环丙基甲基)
‑
4,5α
‑
环氧
‑
3,14β
‑
二羟基
‑
6β
‑
((1r,2r)
‑
n
‑
甲基
‑2‑
(3
‑
(4
‑
羟基苯基)
‑
环丙烷羧酰胺)吗啡喃三氟乙酸盐(21b)的制备
[0186]
在室温下在氮气下向三颈反应烧瓶中加入(1r,2r)
‑2‑
(3
‑
(4
‑
羟基苯基)环丙烷
‑1‑
羧酸(23.9mg，0.134mmol)、中间体(12)(50mg，0.134mmol)和thf(1.0ml)；搅拌溶解固体后，加入depbt(80mg，0.268mmol)和三乙胺(27mg，0.268mmol)。将反应物在室温下搅拌过夜。lc
‑
ms分析指示反应完成。在真空下除去溶剂。向残余物中加入二氯甲烷(2.0ml)，将所得溶液用5％nahso4水溶液(2.0ml x3)、5％nahco3水溶液(2.0ml x3)和卤水(2.0ml x3)洗涤。将有机相用无水硫酸钠干燥并过滤。然后在真空下蒸发滤液。在制备型lc上用流动相(a：0.01％tfa/h2o，b：100％acn)进一步纯化残余物。合并收集的级分；冻干后得到10mg白色粉末形式的产物，产率＝14.0％。lc
‑
ms上[m h]

＝533.6。
[0187]
实例13：化合物23(a)和23(b)的制备。
[0188][0189]
17
‑
环丙基甲基
‑
10
‑
氧代
‑
4,5α
‑
环氧
‑
3,14β
‑
二羟基
‑
6β
‑
((1s,2s)
‑
n
‑
甲基
‑2‑
(3
‑
(4
‑
羟基苯基)
‑
环丙烷羧酰胺)吗啡喃盐酸盐(23a)的制备
[0190]
向中间体(22)(根据文献方法《化学与药学通报(chem.pharm.bull.)2004,52(6),
664
‑
669》制备)(0.5g，1.4mmol)、(1s,2s)
‑2‑
(3
‑
呋喃基)环丙烷
‑1‑
羧酸(0.22g，1.4mmol)、dmf(5.0ml)的混合物中加入hatu(1
‑
[双(二甲氨基)亚甲基]
‑
1h
‑
1,2,3
‑
三唑并[4,5
‑
b]吡啶鎓3
‑
氧化六氟磷酸盐)(0.53g，1.4mmol)和三乙胺(0.39ml，2.8mmol)。将所得黄色溶液在室温下在氮气下搅拌直至lc
‑
ms分析指示反应完成。向反应溶液中加入乙酸乙酯(70ml)。将所得溶液用卤水洗涤，用无水硫酸钠干燥，然后过滤。在真空下浓缩干燥的有机相。在硅胶上纯化残余物，用et3n/meoh/ch2cl2的混合物洗脱。在真空下浓缩收集的所需级分。将获得的油产物溶解在乙酸乙酯中并将该溶液在冰浴中冷却。向冷却的溶液中加入等量的1.0n hcl的乙醚溶液。在真空下浓缩所得混合物以得到0.14g灰白色固体。lc
‑
ms上[m h]

＝505.37。
[0191]
17
‑
环丙基甲基
‑
10
‑
氧代
‑
4,5α
‑
环氧
‑
3,14β
‑
二羟基
‑
6β
‑
((1r,2r)
‑
n
‑
甲基
‑2‑
(3
‑
(4
‑
羟基苯基)
‑
环丙烷羧酰胺)吗啡喃盐酸盐(23b)的制备
[0192]
向中间体(22)(根据文献方法《化学与药学通报(chem.pharm.bull.)2004,52(6)664
‑
669》)(0.5g，1.4mmol)、(1r,2r)
‑2‑
(3
‑
呋喃基)环丙烷
‑1‑
羧酸(0.22g，1.4mmol)、dmf(5.0ml)的混合物中加入hatu(1
‑
[双(二甲氨基)亚甲基]
‑
1h
‑
1,2,3
‑
三唑并[4,5
‑
b]吡啶鎓3
‑
氧化六氟磷酸盐)(0.53g，1.4mmol)和三乙胺(0.39ml，2.8mmol)。将所得黄色溶液在室温下在氮气下搅拌直至lc
‑
ms分析指示反应完成。向反应溶液中加入乙酸乙酯(70ml)。将所得溶液用卤水洗涤，用无水硫酸钠干燥，然后过滤。在真空下浓缩干燥的有机相。在硅胶上纯化残余物，用et3n/meoh/ch2cl2的混合物洗脱。在真空下浓缩收集的所需级分。将获得的油产物溶解在乙酸乙酯中并将该溶液在冰浴中冷却。向冷却的溶液中加入等量的1.0n hcl的乙醚溶液。在真空下浓缩所得混合物以得到0.25g灰白色固体。lc
‑
ms上[m h]

＝505.38。
[0193]
实例14：阿片受体结合测定
[0194]
阿片受体结合亲和力的测量是在由hek293细胞(人类胚胎肾细胞系)制备的膜上使用放射性配体结合测定法进行的，这些细胞针对重组人类μ、δ或κ阿片受体异源性表达。
[0195]
用于阿片受体结合研究的测定缓冲液是用于kor的50mm tris.hcl(ph 7.4)、用于mor的50mm tris.hcl(ph 7.4)和5mm mgcl2、以及用于dor的50mm tris.hcl(ph 7.4)和10mm mgcl2加1mm edta。洗涤缓冲液含有ph为7.4的50mm tris.hcl。
[0196]
将阿片受体结合亲和力与三种已知的标准物进行比较：纳曲吲哚，u
‑
50488(反式
‑
( )
‑
3,4
‑
二氯
‑
n
‑
甲基
‑
n
‑
[2
‑
(1
‑
吡咯烷基)环己基]苯基乙酰胺，参见m.doi,t.ishida和m,inoue；《k
‑
激动剂的结构(structure of k
‑
agonist)》,u
‑
50488《晶体学报(acta cryst.)》(1990).c46,676
‑
678)，以及damgo(d
‑
ala2 mephe4,gly(ol)5]脑髓苷，参见allan d.blake,george bot,john c.freeman,和terry《小鼠m阿片受体的差异阿片激动剂调节(differential opioid agonist regulation of the mouse m opioid receptor)》*《生物化学杂志(the journal of biological chemistry)》第272卷,第2号,1月10日刊,第782
–
790页,1997)。
[0197]
以[3h]damgo的最终浓度0.5nm、[3h]二丙诺啡的最终浓度0.5nm以及[3h]dadle的最终浓度0.5nm制备放射性配体，其分别用作μ、κ和δ受体的竞争性放射性配体。
[0198]
用阿片受体转染的hek293细胞的细胞膜的制备量分别为每孔20ug mor、6.7ug kor和6.7ug dor。在存在单一浓度的放射性配体的情况下，将含有感兴趣受体的这些膜与浓度增加的测试化合物一起温育。使用固定浓度的放射性配体并制备测试化合物的系列稀
释液。
[0199]
测试开始于10um的测试化合物至4倍连续稀释，用于8点检测。根据板图将1μl化合物/高对照/低对照转移到96孔板，然后将100μl膜储备溶液分配到板中，加入100μl放射性配体溶液。在室温下以300rpm温和搅动进行1小时温育。然后，在室温下用每孔50μl 0.3％聚乙烯亚胺浸泡unifilter
‑
96gf/c滤板至少0.5小时，并使用filtermate
tm
收集器将反应混合物过滤通过板，然后将每个板用冷洗缓冲液洗涤四次。然后将滤板在50℃下干燥1小时。干燥后，将过滤器密封在聚乙烯中并加入50μl perkin elmer microscint20混合物，并在perkin elmer microbeta2计数器中计数放射性。
[0200]
在存在50
‑
100倍过量冷配体的情况下，通过减去结合cpm值来确定特异性结合。使用中的饱和度分析非线性曲线拟合程序拟合数据。使用以下等式计算抑制：
[0201]
％抑制＝(1
‑
(测定孔
‑
平均_lc)/(平均_hc
‑
平均_lc))*100％
[0202]
使用graphpad prism 5.0对结合数据进行分析，并且通过从剂量反应曲线的非线性回归生成ic
50
。使用模型“log(抑制剂)与响应
‑‑
可变斜率”来拟合数据。该数据如表1所示。
[0203]
表1
[0204][0205]
如上表数据所指示的，化合物5a、5b、7a、7b、18a、19a和21a的ic
50
优于u
‑
50488。
[0206]
实例15：全细胞中的flipr钙测定
[0207]
flipr钙测定用于测量阿片配体在受体结合后诱导功能反应的能力。
[0208]
mor、dor和kor是g蛋白偶联受体(gpcr)，其在细胞信号传导中起重要作用。受体被配体激活，然后触发细胞内的g蛋白激活。激活的g蛋白会诱导细胞内信使的各种级联反应，包括钙通量。基于功能性细胞的测定评估了通过使用荧光钙敏感报告染料检测到的细胞内钙水平的变化。进行钙动员测定的基本系统包括flipr钙测定试剂盒和flipr系统，它们用于观察细胞内钙水平的变化并确定用重组人类μ、δ或κ阿片受体转染的hek293细胞中的剂量反应。
[0209]
用于测定的细胞在含有10％fbs、300ug/ml g418、2ug/ml杀稻瘟素、1％glutamax
和1％青霉素/链霉素(hyclone
‑
sv30010)的88％dmem培养基中生长。对测定板(greiner
‑
781946)的每个孔在20ul培养基中接种20000个细胞，并且在培养箱中用5％co2将细胞保持处于37℃ 20小时。然后以5倍系列稀释制备化合物以获得10个剂量，并将每个浓度的500nl转移到化合物板。然后将30ul测定缓冲液(20mm hepes和1x hbss)加入到化合物板的每个孔中；将板以1500rpm的速度旋转15秒。然后将20ul 2x fluo
‑
4directtm免洗上样缓冲液(invitrogen
‑
f10471)轻轻分配到测定板的每个孔中，并以1000rpm的速度旋转15s，在37℃下温育50min。将测定板从培养箱中取出并在室温下放置10min。然后将测定板、化合物板和吸头盒直接放入flipr系统中。将10ul化合物从化合物板转移到flipr tetra荧光成像读板机中的测定板，并且该板用于140次；然后计算从读数1到140的“最大值
‑
最小值”以生成用于％效应计算的最终信号；使用prism曲线拟合方程“log(激动剂)与响应
‑‑
可变斜率”分析数据。表2示出了这些测定的结果。
[0210]
表2
[0211][0212]
从表2中可以看出，与u
‑
69596以及化合物5b、7a和7b相比，化合物5a提供了改进的细胞测定。化合物5a的响应曲线如图1所示。