脂质体纳米颗粒的制作方法

1.本发明涉及用于递送基因组编辑剂的脂质体纳米颗粒、包含用于递送基因组编辑剂的脂质体纳米颗粒的组合物、用于生产用于递送基因组编辑剂的脂质体纳米颗粒的方法、用于对于基因组编辑进行时空控制的方法以及编辑细胞基因组的方法。


背景技术：

2.基因组编辑是允许研究人员直接操作宿主基因组，从而帮助生产用于疾病和生物学研究的动物模型和细胞系，并被认为有利于治疗应用的技术。宿主基因组的直接基因组操作是由通过利用人工改造的核酸酶从基因组插入、置换或去除dna来实现的。人工改造的核酸酶在dna的具体位置产生双链断裂（dsbs）和单链断裂（ssbs），并利用自然发生的dna修复机制以选择性地改变宿主基因组。在dna修复过程中，非同源末端连接（nhej）或同源性指导的重组（homology directed recombination）（hdr）途径用于修复宿主dna，其取决于操作导致对基因破坏和敲除、缺失和插入有效的突变。
3.基因组编辑工具的实例基于来自细菌嗜热链球菌（s. thermophiles）的细菌crispr（成簇的规律间隔的短回文重复序列（clustered regularly interspaced short palindromic repeats））
‑
相关蛋白
‑
9核酸酶（cas9）。所述crispr/cas9系统是一些原核细胞中存在的适应性免疫应答系统，其中crispr系统使用cas9内切核酸酶来识别和破坏进入细胞的外源dna（barrangou, r.等人, science, 2007. 315(5819): p. 1709
‑
1712；jinek, m.等人, science, 2012: p. 1225829）。所述系统的应用已经扩展到各个领域，包括生物学研究（shen, b.等人, cell research, 2013. 23(5): p. 720）、人类医学（veres, a.等人, cell stem cell, 2014. 15(1): p. 27
‑
30）、生物技术（sampson, t.r.和d.s. weiss, bioessays, 2014. 36(1): p. 34
‑
38）和农业（khatodia, s.等人, frontiers in plant science, 2016. 7: p. 506）。
4.尽管诸如crispr
‑
cas9的基因组编辑系统非常有希望，但在其成功应用于人类患者之前仍有几个挑战要处理。虽然新生的基因组编辑技术仍然存在挑战，但将系统安全且有效地体内递送到靶细胞仍然是主要挑战之一。
5.用于将基因组编辑系统可控递送到靶细胞和组织的改进的方法代表了未满足的需要。


技术实现要素：

6.发明人已经发现，可以通过在脂质体载体中将基因组编辑剂递送至细胞来控制通过基因组编辑剂进行的基因组编辑，在所述脂质体载体中已经并入了一种或多种去稳定剂。当暴露于诱导物时，去稳定剂形成活性氧类别，从而导致脂质体去稳定并从脂质体中释放基因组编辑剂。基因组编辑剂的释放因此是通过控制脂质体对诱导物的暴露而可控的。
7.第一方面提供了用于递送基因组编辑剂或其部分的脂质体纳米颗粒，其包含：（a）脂质体载体，包含：
（i）一种或多种形成脂质体的脂质；和（ii）一种或多种当暴露于诱导物时能够形成活性氧类别的去稳定剂；和（b）基因组编辑剂或其部分。
8.第二方面提供了组合物，其包含用于递送基因组编辑剂或其部分的脂质体纳米颗粒，所述脂质体纳米颗粒包含：（a）脂质体载体，包含：（i）一种或多种形成脂质体的脂质；和（ii）一种或多种当暴露于诱导物时能够形成活性氧类别的去稳定剂；和（b）基因组编辑剂或其部分。
9.第三方面提供了用于递送基因组编辑剂或其部分的脂质体系统，包括：（a）脂质体载体，包含：（i）一种或多种形成脂质体的脂质；和（ii）一种或多种当暴露于诱导物时能够形成活性氧类别的去稳定剂；和（b）基因组编辑剂或其部分；其中所述基因组编辑剂或其部分通过暴露于诱导物而从所述脂质体释放。
10.第四方面提供了用于递送crispr复合体或其部分的脂质体纳米颗粒，包含：（a）脂质体载体，包含：（i）一种或多种形成脂质体的脂质；和（ii）一种或多种当暴露于诱导物时能够形成活性氧类别的去稳定剂；和（b）crispr复合体或其部分。
11.第五方面提供了组合物，其包含用于递送crispr复合体或其部分的脂质体纳米颗粒，所述脂质体纳米颗粒包含：（a）脂质体载体，包含：（i）一种或多种形成脂质体的脂质；和（ii）一种或多种当暴露于诱导物时能够形成活性氧类别的去稳定剂；和（b）crispr复合体或其部分。
12.第六方面提供了用于递送crispr复合体或其部分的脂质体系统，包括：（a）脂质体载体，包含：（i）一种或多种形成脂质体的脂质；和（ii）一种或多种当暴露于诱导物时能够形成活性氧类别的去稳定剂；和（b）crispr复合体或其部分；其中所述crispr复合体或其部分通过暴露于辐射而从所述脂质体载体释放。
13.第七方面提供了修饰细胞的基因组的方法，包括将第一方面的脂质体纳米颗粒或第二方面的组合物施用于细胞，并将所述脂质体纳米颗粒暴露于诱导物，以从而使所述脂质体去稳定和释放基因组编辑剂。
14.第八方面提供了修饰细胞的基因组的方法，包括将第四方面的脂质体纳米颗粒或第五方面的组合物施用于细胞，并将所述脂质体纳米颗粒暴露于诱导物，以从而使所述脂质体去稳定和释放crispr复合体或其部分。
15.第九方面提供了制备脂质体纳米颗粒的方法，包括在促进包囊基因组编辑剂或其
部分的脂质体载体的形成的条件下组合一种或多种形成脂质体的脂质、一种或多种当暴露于诱导物时能够形成活性氧类别的去稳定剂和基因组编辑剂或其部分。
16.第十方面提供了制备脂质体纳米颗粒的方法，包括在促进包囊crispr复合体或其部分的脂质体载体的形成的条件下组合一种或多种形成脂质体的脂质、一种或多种当暴露于诱导物时能够形成活性氧类别的去稳定剂和crispr复合体或其部分。
17.第十一方面提供了用于制备第一方面的脂质体纳米颗粒的试剂盒，包括：（i）一种或多种形成脂质体的脂质；（ii）一种或多种当暴露于诱导物时能够形成活性氧类别的去稳定剂；和（iii）任选地，基因组编辑剂或其部分。
18.第十二方面提供了用于制备第四方面的脂质体纳米颗粒的试剂盒，包括：（i）一种或多种形成脂质体的脂质；（ii）一种或多种当暴露于诱导物时能够形成活性氧类别的去稳定剂；和（iii）任选地，crispr复合体或其部分。
19.第十三方面提供了用于制备第一或第四方面的脂质体纳米颗粒的脂质体载体，所述脂质体载体包含：（i）一种或多种形成脂质体的脂质；和（ii）一种或多种当暴露于诱导物时能够形成活性氧类别的去稳定剂。
20.第十四方面提供了控制基因组编辑的方法，包括：（a）施用第一或第四方面的脂质体纳米颗粒；和（b）将诱导物指导至期望释放基因组编辑剂的位置。
21.第十五方面提供了控制基因组编辑的方法，包括：（a）施用第一或第四方面的脂质体纳米颗粒；和（b）将至少100 ev的电磁辐射指导至期望释放基因组编辑剂的位置。
附图说明
22.图1a和b是如本文所述的并入维替泊芬（verteporin）的代表性脂质体样品的实例的tem图像。比例尺（scale bar）为500 nm。
23.图2是显示并入维替泊芬（verteporfin）的脂质体的表征的图（a和b）。（a）是显示脂质体悬浮液的大小分布的图。（b）是显示装载在脂质体内的维替泊芬的吸收和荧光光谱的图。箭标表示维替泊芬的特征峰。
24.图3是显示（a）在有或没有光照射（2、4和6分钟）的情况下脂质体悬浮液在di水中的大小和分布；和（b）在光照射下（2、4和6分钟）、无光和化学破坏后自完整脂质体样品的vp释放概况的图。
25.图4a. 是在如所示的不同处理条件后48小时在hek293细胞中gfp表达水平的共焦图像和定量分析。脂质体的浓度为50
ꢀµ
g/ml。比例尺=30
ꢀµ
m。箱以第一和第三四分位数为界，在中位数处有一条水平线，且须延伸到四分位数的间距的1.5倍。使用t检验分析平均值（n=4）。***，p<0.001，与没有光的脂质体组相比。b. 是显示在指示的hek293细胞处理后gfp和b
‑
肌动蛋白表达的蛋白质印迹。
26.图5是显示由光触发的cas9 sgrna从脂质体释放对gfp荧光强度的空间控制的图
像。指示的点（虚线圆圈）用690 nm led照射4分钟，且48小时后在ivis光谱体内成像系统下对培养皿进行照相。
27.图6是体内定量读出数据检测系统的示意图解。（a）显示了斑马鱼中可视敲除读出数据的概述。（b）是显示在斑马鱼皮肤下形成单层平行纤维的慢肌的斑马鱼横切面的示意表示。（c）是smyhc1:egfp 斑马鱼系在明视野和绿色通道下的共焦部分。比例尺：75 μm。（d）是靶向由慢肌特异性smyhc1启动子驱动的egfp表达的sgrna
‑
cas9复合体的示意表示。
28.图7是斑马鱼中crispr/cas9的光触发的释放的图像和定性和定量评估。（a）是smyhc1
‑
egfp斑马鱼的荧光图像（3dpf）；未注射的阴性对照，在没有光暴露的情况下用cas9和脂质体/crispr复合体共同注射，在有5分钟光暴露的情况下用cas9和脂质体/crispr复合体共同注射，和作为阳性对照的仅用crispr/cas9注射；（b）是显示通过总荧光强度对斑马鱼图像中敲除率的定性评估的图。（c）是显示在单细胞分辨率下通过敲除的慢肌纤维数目定量斑马鱼中crispr/cas9
‑
介导的敲除率的图。比例尺：500 μm，主图像和100 μm，部分放大的图像。
29.图8是光暴露时间对crispr/cas9的可控释放的影响的图像和定性和定量评估。（a）是在没有光暴露的情况下；1分钟；2分钟和5分钟用cas9和脂质体/crispr复合体共同注射的smyhc1
‑
egfp斑马鱼（3dpf）的荧光图像。（b）是显示光暴露时间对斑马鱼胚胎中crispr/cas9
‑
介导的敲除效率的影响的定性评估的图；且（c）是显示光暴露时间对斑马鱼胚胎中crispr/cas9
‑
介导的敲除效率的影响的定量评估的图。比例尺：500 μm，主图像和100 μm，部分放大的图像。
30.图9是显示（a）通过计数如图像中所示的不同处理下每个胚胎的敲除慢肌纤维的数目对在斑马鱼中通过光触发的crispr释放的cas9
‑
介导的敲除进行的定量评估；和（b）通过计数不同照射时间点每个胚胎的敲除慢肌纤维的数目对光暴露时间对crispr/cas9的可控释放的影响的图。
31.图10是显示评估光和脂质体对斑马鱼胚胎的毒性的图。（a）是显示用不同的crispr/cas9到脂质体浓度注射的3dpf斑马鱼存活的图；且（b）是暴露于不同的光持续时间的斑马鱼胚胎的存活率的图。
32.图11是显示斑马鱼胚胎存活和敲除率（%）的图。（a）是显示暴露于不同持续时间的光（0
ꢀ‑ꢀ
60分钟）的斑马鱼胚胎的存活的图和（b）是显示用不同crispr/cas9与脂质体比率（1:0
ꢀ‑ꢀ
1:5）注射的斑马鱼胚胎的百分比存活和敲除的图。
33.图12是显示如所示的不同处理条件后tnfaip3与gapdh的相对基因表达的图（从左到右：对照；对照 tnfγ；装载了crispr的商业脂质体；装载了crispr的自制脂质体；自制的脂质体 4 gy；装载了crispr的自制脂质体 4 gy；仅4 gy）。
34.图13是：（a）sgrna（3 μg/ml）和sgrna与vp的混合物（3 μg/ml sgrna和16 μg/ml维替泊芬）在不同时间点光照射后的琼脂糖凝胶电泳结果的图。从右到左泳道：对照、混合物、2分钟、4分钟和6分钟；以及（b）hek293细胞在与脂质体温育2小时和在690 nm照射4分钟后的生存力。脂质体的浓度为25、50和100 μg/ml。生存力表示为相对于对照细胞的平均百分比和标准差（n=4）。
35.图14是下述的3d透视（rendered）共焦图像：（a）对照转基因smyhc1:egfp胚胎显示作为单层的表达egfp的个别慢肌纤维；和（b）用靶向egfp的crispr指导rna注射的转基因胚
胎显示来自慢肌纤维的绿色荧光信号的丧失。
36.图15是cas9蛋白的实例的氨基酸序列。
具体实施方式
37.本公开内容涉及用于递送基因组编辑剂的脂质体纳米颗粒。基因组编辑剂是：分子或分子复合体，其能够在体内产生细胞的dna，例如细胞的基因和/或基因组中的缺失、插入和/或突变；或编码分子或分子复合体的dna，所述分子或分子复合体能够在体内产生细胞的dna，例如细胞的基因和/或基因组中的缺失、插入和/或突变。在基因组编辑剂包含不止一种组分的实施方案中，基因组编辑剂的一部分是基因组编辑剂的组分。
38.基因组编辑剂的实例是crispr复合体，一般由crispr指导rna和内切核酸酶例如cas9内切核酸酶组成。crispr复合体基于原核免疫系统，所述原核免疫系统通过贮存侵入噬菌体的片段来起作用。在后来细菌被噬菌体的感染中，与特殊化的rna和细胞核酸酶复合的包含由贮存的噬菌体dna编码的序列的rna在后来的感染中靶向并切割噬菌体dna。crispr复合体将原核免疫系统的切割功能和与所期望的核苷酸序列互补的序列相组合，以将切割功能靶向所期望的核苷酸序列，以从而切割所期望的序列。将crispr复合体引入组织或细胞中允许细胞基因组的定向体内基因组编辑。
39.在本公开内容之前，已经使用病毒载体和常规脂质体将基因组编辑剂递送到细胞中。使用病毒载体和常规脂质体以将基因组编辑剂例如crispr复合体递送到组织或细胞中导致crispr以不可控制的方式释放。这可以导致在非预期细胞或组织中发生基因组编辑。由于crispr的基因组编辑能力能够改变基因组（与改变从基因组产生的mrna不同），所以这种非预期的基因组编辑可导致不能接受的结果，特别是在临床背景中。
40.发明人已经发现，通过使用其中已并入了诱导型去稳定剂的脂质体，可以以可控方式将基因组编辑剂例如crispr复合体或其部分有效递送至细胞。
41.因此，在一个方面，提供了用于递送基因组编辑剂的脂质体纳米颗粒，其包含：（a）脂质体载体，包含：（iii）一种或多种形成脂质体的脂质；和（iv）一种或多种当暴露于诱导物时能够形成活性氧类别的去稳定剂；和（b）基因组编辑剂或其部分。
42.在一个实施方案中，基因组编辑剂是成簇的规律间隔的短回文重复序列（crispr）复合体或crispr复合体的部分。
43.如本文所述的，包囊crispr复合体并包含维替泊芬作为去稳定剂的脂质体纳米颗粒在暴露于光辐射时产生活性氧类别。活性氧类别导致脂质体脂质氧化，从而导致脂质体去稳定和crispr复合体的释放。因此，将去稳定剂例如维替泊芬并入脂质体中允许包囊的基因组编辑剂例如crispr复合体通过暴露于诱导物例如光辐射而从脂质体载体中可控地释放。
44.因此，本文所述的脂质体纳米颗粒有助于使用辐射例如x射线、γ辐射或光作为在感兴趣的部位触发crispr复合体的释放的诱导物在体内定向可控释放crispr复合体有效负载。在这方面，脂质体本身不需要靶向预期的crispr活性的部位，而是诱导物（例如x射线辐射、γ射线辐射或光）靶向所述部位以诱导crispr复合体或其部分的释放。
45.因此，本文所述的脂质体纳米颗粒允许通过将脂质体与靶向分子缀合或仅使用非靶向的脂质体在预期的细胞或组织中定向释放基因组编辑剂，即使不可能将脂质体颗粒本身靶向预期的细胞或组织。这种方法将在预期的细胞或组织不具有已知靶向部分的情况下或者当靶向不能被容易地接近或不能被容易地与周围区域区分的区域中的细胞或组织时特别有利。
46.脂质体纳米颗粒的脂质体载体包含一种或多种形成脂质体的脂质。脂质体载体是能够包囊试剂的脂质体。形成脂质体的脂质可以是能够形成脂质体的任何合适的脂质。脂质体通常由溶解的脂质分子的自组装形成，每个脂质分子都含有亲水的头部基团和疏水的尾部。这些脂质呈现缔合，其产生低自由能的熵有利状态，从而在一些情况下形成双分子脂质小叶。这种小叶特征在于疏水性烃尾部彼此面对，且亲水性头部基团面向外部以与水溶液缔合。这里，双层形成在能量方面仍然不利，这是因为分子的疏水部分仍然与水接触，通过形成的双层膜本身弯曲以形成具有封闭边缘的小泡来克服的问题。这种自由能驱动的自组装是稳定的，并已被用作用于专门针对给定系统的需要人工改造脂质体的强有力的机制。脂质体中使用的脂质分子是具有经由主链接头如甘油连接的头部基团和疏水性烃尾部的保守实体。阳离子脂质通常通过极性头部基团中存在的一种或多种胺获得正电荷。带阳电的胺的存在促进了与阴离子例如在dna中发现的那些的结合。如此形成的脂质体是范德瓦尔斯力的能量贡献和部分决定了脂质体的形状的与dna静电结合的结果。由于dna的聚阴离子特性，阳离子（和中性）脂质一般用于基因递送，而阴离子脂质体的使用已完全限于其他治疗用大分子的递送（balazs和godbey，2011）。
47.阳离子脂质的实例包括n
‑
[1
‑
(2,3
‑
二油基氧基)丙基]
‑
n,n,n
‑
三甲基氯化铵（dotma）、[1,2
‑
双(油酰氧基)
‑3‑
(三甲基铵)丙烷]（dotap）、3β[n
‑
(n',n'
‑
二甲氨基乙烷)
‑
氨基甲酰基]胆固醇（dc
‑
chol）和双十八烷基酰氨基甘氨酰精胺（dogs）。二油酰基磷脂酰乙醇胺（dope），一种中性脂质，由于其在低ph的膜去稳定作用可与阳离子脂质一起使用，这帮助内溶酶体（endolysosomal）逃逸。
[0048]
合适的脂质的实例包括1,2
‑
二油酰基
‑
sn
‑
甘油
‑3‑
磷酸胆碱（dopc）和1,2
‑
二
‑
(9z十八烯酰基)
‑3‑
三甲基铵
‑
丙烷（dotap）或1,2
‑
二油酰
‑
sn
‑
甘油
‑3‑
磷酸乙醇胺（dope），n
‑
[1
‑
(2,3
‑
二油基氧基)丙基]
‑
n,n,n
‑
三甲基氯化铵（dotma），氢化大豆l
‑
α
‑
磷脂酰胆碱（hspc）和 1,2
‑
二油酰基
‑
sn
‑
甘油
‑3‑
磷酸乙醇胺
‑
n
‑
(己酰胺)（pe
‑
nh2）。
[0049]
在一个实施方案中，一种或多种形成脂质体的脂质包含dopc和dotap。
[0050]
在一些实施方案中，脂质体载体进一步包含胆固醇。
[0051]
脂质体载体包含一种或多种当暴露于诱导物时能够形成活性氧类别的去稳定剂。一般，一种或多种去稳定剂并入脂质体脂质双层中。如本文所用的，“当暴露于诱导物时能够形成活性氧类别的去稳定剂”是当并入脂质体的脂质双层并暴露于诱导物时产生活性氧类别（ros）（1o
‑2）的化合物或分子。活性氧类别一般引起脂质体的脂质的氧化，从而导致脂质体去稳定。
[0052]
在一个实施方案中，去稳定剂是无机纳米颗粒或金属纳米颗粒。合适的金属纳米颗粒包括金、银和铋，其可以增强x射线或γ射线辐射以及来自x射线或γ射线辐射的能量转移。在一实施方案中，金属纳米颗粒是金纳米颗粒。
[0053]
在一个实施方案中，去稳定剂是光敏剂。合适的光敏剂包括维替泊芬（vp）、玫瑰
红、氨基酮戊酸、光福啉（photofrin）、5
‑
氨基酮戊酸和原卟啉ix。
[0054]
在一个实施方案中，去稳定剂是vp。vp（商品名维速达尔（visudyne））是苯并卟啉（benzoporphyrin）衍生物，传统上用作用于光动力疗法的光敏剂，以消除与诸如湿型黄斑变性的状况有关的眼内异常血管。
[0055]
如本文所述的，当光敏剂用作去稳定剂时，可见光或电离辐射可用作诱导物。
[0056]
在一些实施方案中，一种或多种去稳定剂是光敏剂并且诱导物是可见光。
[0057]
在一个实施方案中，一种或多种去稳定剂是光敏剂并且诱导物是电离辐射，例如x射线辐射或γ射线辐射。
[0058]
在一些实施方案中，一种或多种去稳定剂是金属纳米颗粒和光敏剂的组合。例如，当暴露于x射线辐射或γ射线辐射时，金纳米颗粒和vp在使脂质体去稳定中有效。
[0059]
基因组编辑剂一般被脂质体包囊。在一个实施方案中，基因组编辑剂是crispr复合体或其部分。crispr复合体可以是本领域已知的任何crispr复合体。用于基因组编辑包括dna的切割、dna的缺失、dna的插入和dna的突变的crispr复合体是本领域已知的并且描述于例如wo 2014/204729；wo2014/204726；wo 2015/071474；wo 2017/064546中。crispr复合体和用于制备crispr复合体的试剂盒可从例如new england biolabs, inc.商购获得。
[0060]
crispr复合体一般包含指导rna和修饰多肽（例如，crispr相关蛋白）。指导rna将crispr相关蛋白（cas）（例如，位点定向修饰多肽，如cas9）的活性指导至靶dna内的具体所期望的靶序列。如本文所用的，“指导rna”包含dna
‑
靶向序列和蛋白质结合序列（例如，tracrrna）。一般，指导rna包含dna靶向序列和tracrrna。tracr rna包含与修饰多肽有关的序列。
[0061]
指导rna的dna
‑
靶向序列包含与靶dna中的靶序列互补的核苷酸序列。指导rna的dna
‑
靶向序列与靶dna杂交以从而指导结合的修饰蛋白接近靶序列以允许切割。因此，dna
‑
靶向序列的核苷酸序列决定了指导rna和靶dna将相互作用的靶dna内的位置。可以修饰（例如，通过重组dna技术）指导rna的dna
‑
靶向序列以与靶dna内的任何所期望的序列杂交。一般，靶dna序列与pam序列（ngg）相邻。
[0062]
dna
‑
靶向序列一般具有约20个核苷酸至约22个核苷酸的长度。在各种实施方案中，与靶dna的靶序列互补的dna
‑
靶向序列长度为14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26或27个核苷酸。
[0063]
指导rna的蛋白质结合序列与位点定向修饰多肽相互作用。一般，修饰多肽是核酸酶，更一般是内切核酸酶。指导rna经由上述dna
‑
靶向序列将结合的修饰多肽指导至靶dna内的具体核苷酸序列。指导rna的蛋白质结合序列包含两段彼此互补的核苷酸（crrna和tracrrna内的序列）。蛋白质结合区段的互补核苷酸杂交以形成双链rna双链体（dsrna），和在指导rna是单分子的实施方案中，茎环结构。指导rna的蛋白质结合序列长度为约20（例如19）个核苷酸，其包含约4个核苷酸的短序列和约12个核苷酸的重复茎环。
[0064]
在一些实施方案中，指导rna可由两个rna分子形成。一般，指导rna是单分子（单指导rna（sgrna））。
[0065]
如上文所述的，crispr复合体包含指导rna和修饰蛋白。一般，修饰蛋白是核酸酶，更一般是内切核酸酶。核酸酶可以是适合供crispr使用的任何核酸酶。一般，核酸酶是crispr相关蛋白（cas）。脂质体一般包含crispr相关（cas）蛋白，作为crispr复合体的部分。
cas蛋白是修饰蛋白，其由指导rna指导至靶并切割靶dna。合适的cas蛋白的实例包括cas9和cas12a，或其变体。在一些实施方案中，cas蛋白是cas9或其变体。cas9的变体是本领域已知的并且描述于例如wo 2016/196655中。cas9 的变体也可从例如new england biolabs, inc.商购获得。
[0066]
如本文所用的，crispr复合体的部分是单独不形成完整crispr复合体的crispr复合体的组分。crispr复合体的组分的实例是cas蛋白或指导rna。预计在一些实施方案中，crispr复合体的不同部分可被包装入单独的脂质体颗粒并递送至相同细胞以允许在所述细胞内形成功能性crispr复合体。
[0067]
本领域技术人员将理解，脂质体内的基因组编辑剂可以是指导rna和cas蛋白（或编码cas蛋白的rna），或能够表达指导rna和cas蛋白的dna。
[0068]
在各种实施方案中，基因组编辑剂或其部分包含：（a）指导rna；（b）cas蛋白，一般是cas 9蛋白或其变体；（c）指导rna和cas蛋白（例如cas9）；（d）编码指导rna的dna序列；（e）编码cas蛋白（例如cas 9）的dna或rna序列；（f）编码指导rna和cas蛋白的dna序列；（g）指导rna和编码cas蛋白的dna序列。
[0069]
在一个实施方案中，基因组编辑剂或其部分是crispr复合体或其部分。
[0070]
在一个实施方案中，crispr复合体或其部分包含指导rna和cas蛋白。
[0071]
在一个实施方案中，crispr复合体或其部分在没有指导rna的情况下包含cas蛋白。
[0072]
在一个实施方案中，crispr复合体或其部分在没有cas蛋白的情况下包含指导rna。
[0073]
一般，cas蛋白是cas9或其变体。
[0074]
在一些实施方案中，crispr复合体或其部分可进一步包含阳离子聚合物。阳离子聚合物可以是选自聚
‑
l
‑
赖氨酸、聚酰胺型胺、聚[2
‑
(n,n
‑
二甲氨基)乙基甲基丙烯酸酯]、壳聚糖、聚
‑
l
‑
鸟氨酸、环糊精、组蛋白、胶原蛋白、葡聚糖和聚乙烯亚胺的一种或多种聚合物。
[0075]
脂质体表面可以进一步用靶向材料修饰，以使得脂质体进入主体的靶区域或靶细胞内的增强的摄取成为可能。所述材料可以是抗原、抗体、抗体片段、肽、激素、细胞因子、配体和受体。例如，由于在许多癌细胞上超表达的叶酸受体，脂质体叶酸缀合物已被用于使脂质体为肿瘤细胞特异性的。缀合可以使用在例如gabizon等人, 1999, bioconjugate chemistry, 1999. 10(2): p.289
‑
298中描述的方法合成。
[0076]
如本文所用的，诱导物是导致去稳定剂产生活性氧类别的试剂。在一些实施方案中，诱导物是辐射。诱导物可以是导致去稳定剂产生活性氧类别的任何形式的辐射。一般，诱导物是电磁辐射。本领域技术人员将理解，与脂质体纳米颗粒一起使用的诱导物将取决于所使用的去稳定剂。在去稳定剂是光敏剂的实施方案中，诱导物可以是光或高能电磁辐射。在诱导物是光的实施方案中，光可以是uv光的可见光。光一般具有在350nm至400nm和
400nm至800nm，更一般600nm至800nm或670nm至700nm的范围内的波长。在一些实施方案中，光的波长为约690nm。在一些实施方案中，波长为约405nm。
[0077]
在一些实施方案中，电磁辐射是电离辐射。一般，电离辐射具有大于100 ev的能量。电离辐射的实例是x射线辐射或γ射线辐射。在一些实施方案中，一般其中去稳定剂是金属纳米颗粒，或金属纳米颗粒和光敏剂，电磁辐射是高能电磁辐射。高能电磁辐射一般具有高于约5 kev的能量，例如，约320 kv.或约6 mev的能量。在各种实施方案中，高能电磁辐射在约5kev至约7 mev、约50 kev至约6 mev、约100 kev至约6 mev、约200 kev至约6 mev、约300 kev至约6 mev的范围内。
[0078]
还提供了包含本文所述的脂质体纳米颗粒的组合物。在一些实施方案中，组合物是包含本文所述的脂质体纳米颗粒和药学上可接受的载体的药物组合物。用药物载体配制脂质体的方法是本领域已知的，并且描述于例如 goodman & gillman's: the pharmacological basis of therapeutics（第11版，mcgraw
‑
hill professional，2005）中。
[0079]
可接受的载体、稀释剂和佐剂对接受者是无毒的并且优选在所使用的剂量和浓度是惰性的，并且包括缓冲剂例如磷酸盐、柠檬酸盐或其他有机酸；抗氧化剂，如抗坏血酸；低分子量多肽；蛋白质，例如血清清蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，例如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂如edta；糖醇，如甘露糖醇、木糖醇、赤藓糖醇、麦芽糖醇（maltitol）或山梨糖醇；淀粉，阿拉伯胶（acacia），橡胶，藻酸盐，明胶，磷酸钙，硅酸钙，纤维素，甲基纤维素，微晶纤维素，聚乙烯吡咯烷酮，水，羟基苯甲酸甲酯，羟基苯甲酸丙酯，滑石，硬脂酸镁。
[0080]
可以通过静脉内、腹膜内、皮下、肌内、鼻内或鞘内注射向主体施用试剂。适合于静脉内、腹膜内、皮下、肌内、鼻内或鞘内使用的组合物包括无菌水溶液或分散体和用于临时制备无菌可注射溶液或分散体的无菌粉末。药学上可接受的载体可以是含有例如水、乙醇、多元醇（例如，甘油、丙二醇、液体聚乙二醇等）、它们的合适混合物的溶剂或分散介质。
[0081]
一个方面提供了制备脂质体纳米颗粒的方法，包括在促进包囊crispr复合体或其部分的脂质体载体形成的条件下组合一种或多种形成脂质体的脂质、一种或多种去稳定剂和crispr复合体或其部分。
[0082]
在一些实施方案中，方法包括在氯仿中组合一种或多种形成脂质体的脂质、一种或多种去稳定剂和任选的胆固醇以形成双层膜。然后借助与水性液体如例如hepes和pbs的剧烈混合破坏膜以形成脂质体载体。独立地，crispr复合体或其部分一般与阳离子聚合物如pei组合以形成复合材料。将复合材料和脂质体载体温育以允许将复合材料并入脂质体载体中。在一些实施方案中，在水性液体中的复合材料与脂质体膜组合且在膜和复合材料剧烈混合后形成脂质体纳米颗粒。
[0083]
另一个方面提供了修饰细胞基因组的方法，例如修饰细胞中的基因和/或基因表达，包括向细胞施用第一方面的脂质体纳米颗粒或第二方面的组合物，和将脂质体暴露于辐射，以从而使脂质体去稳定并释放crispr复合体或其部分。可以以crispr能够修饰基因的任何方式修饰基因。基因组可以通过例如dna序列的缺失、dna序列的插入或dna序列的突变来修饰。
endolysosomal escape and gene silencing in pc12 cells. molecular therapy
‑
nucleic acids, 2017. 7: p. 366
‑
377；wenjie, c.等人, photoresponsive endosomal escape enhances gene delivery using liposome
‑
polycation
‑
dna (lpd) nanovector. journal of materials chemistry b, 2018）。此外，在脂质体制剂中并入胆固醇（chol）可以提高对在生理环境中脂质体聚集的抗性，保护它们免于蛋白质结合和机械断裂并延长它们的半衰期（yang, s.
‑
y.等人, comprehensive study of cationic liposomes composed of dc
‑
chol and cholesterol with different mole ratios for gene transfection. colloids and surfaces b: biointerfaces, 2013. 101 : p. 6
‑
13）。
[0091]
在这里，我们通过将cas9蛋白和grna复合体（cas9 rnps）递送到斑马鱼胚胎中并确立最佳转染条件，进一步证明了相同脂质体制剂的体内转染功效。我们使用我们实验室确立的以前的方法制备了光触发的脂质体制剂。我们将脂质体与cas9 rnp复合，并将混合溶液显微注射到表达egfp基因的胚胎中，继之以在690 nm处光照射6分钟。为了确立基因敲除的简单和定量的读出数据，我们集中于斑马鱼躯干中的大慢肌细胞。斑马鱼慢肌是单层平行纤维，其在皮肤下把鱼包起来，从而使它们为通过荧光显微术的快速且准确的定量所能接近。为了测试这种方法的可行性，我们使用在慢肌smyhc1启动子控制下表达egfp的双转基因斑马鱼品系。为了评价sgrna的效率，我们靶向egfp中的区域，并确认了于受精后 72小时（hpf）个体慢肌细胞中egfp荧光的丧失。
[0092]
材料和方法：脂质（dotap和dope）购自avanti polar lipids（alabaster, al, 美国）。维替泊芬、胆固醇（chol）和氯仿购自 merck australia。dulbecco氏改良eagle氏培养基、胎牛血清、胰蛋白酶、optimem、dulbecco氏磷酸缓冲盐水、truecut cas9 v2、gfp sgrna和lipofectamine购自thermofisher australia。zyppy质粒小量制备试剂盒（plasmid miniprep kit）购自zymo research。megashortscript t7试剂盒和mirvana mirna分离试剂盒购自invitrogen australia。体内实验中使用的cas9蛋白购自toolgen, inc.。
[0093]
脂质体制剂制备脂质体制剂基于具有少量修改的我们以前的方法（deng, w.等人, nature communications. 2018. 9(1): p. 2713）制备。简而言之，将摩尔比为1:1:1的dotap、dope和chol的脂质组分与在500 μl氯仿中的维替泊芬（16 μm）混合，或将摩尔比为1:0.94:1:0.06的dotap、dope、chol和维替泊芬与500 μl氯仿混合。然后在氩气流下蒸发混合物溶剂。薄脂质膜在试管壁周围形成，并通过剧烈搅拌30分钟，用hepes缓冲液（40 mm，ph 7.4）或di水水合，直至悬浮液均化为止。使水合的悬浮液处于室温达2小时，以允许脂质完全水合。水合的脂质体悬浮液在微型挤出机（mini
‑
extruder）中通过200 nm聚碳酸酯膜挤出11次。所得悬浮液在氩气下于4℃贮存。为了制备并入了cas9 grna rnp的脂质体，将脂质膜完全重悬浮在含有 grna（0.01 μm）和cas9 蛋白（0.1 mg ml
‑1）的500 μl di水溶液中，继之以上述水合程序。
[0094]
为了确定装载在脂质体内的vp的包囊量，我们将triton x
‑
100（0.1%）添加到如所制备的脂质体溶液中，从而导致vp释放。vp荧光（激发/发射：425/690 nm）记录在fluorolog
‑
tau
‑
3系统上，并与相应的vp标准曲线进行比较。
[0095]
表征
脂质体样品的ζ电势和大小分布使用zetasizer 3000hsa通过dls确定。在于25℃平衡2分钟后，每个样品一式三份进行测量，且数据作为平均值
ꢀ±ꢀ
标准差（sd）进行收集。在对脂质体样品进行透射电镜术（tem）成像之前，使用负染色方法制备tem载网样品。简而言之，将铜载网放置在一滴10 μl脂质体悬浮液上，从而允许载网吸收样品3分钟，继之以用2%（w/v）磷钨酸再染色3分钟。在将样品风干过夜后，然后在具有100 kv的加速电压的tem（philips cm 10）下观察载网样品。使用olympus megaview g10照相机拍摄图像并使用item软件进行处理。
[0096]
脂质体和纯vp的吸收和荧光光谱分别用uv
‑
vis分光计（cary 5000, varian inc.）和fluorolog
‑
tau3系统（horiba scientific）以425 nm氙灯激发测量。
[0097]
光照射下体外vp释放概况和脂质体的血清稳定性的评估将100 μl脂质体悬浮液在pbs（ph 7.4）中稀释并通过于690 nm的led光照射（0.15 mw/cm2）激活2分钟、4分钟和6分钟。然后将样品在d
‑
管透析器（d
‑
tube dialyzer）（merck millipore）中透析。这些设备在摇床（80 rpm）中在具有12 ml pbs的50 ml离心管中保持 24 小时。在不同的时间点（0小时、1小时、3小时、6小时和 24小时），取pbs的等分部分用于释放的vp的荧光表征。通过用0.1% triton x
‑
100破坏脂质体来测量总vp荧光。不同时间点的vp释放百分比（r
vp
（%））计算如下：其中f
t
和f0分别表示在不同时间点和在没有照射的情况下释放的vp的荧光强度。f
max
指通过添加0.1% triton x
‑
100破坏脂质体后vp的总荧光强度。
[0098]
hek293细胞中脂质体的细胞摄取在细胞实验中使用基因组中含有gfp基因的转基因hek293（thermo fisher via mta）。它们在含有10%胎牛血清和1%抗生素的dmem中生长。将细胞（1
×
105个细胞/孔）附着至玻璃底培养皿，并于37℃温育24小时。去除培养基后，将细胞与细胞培养基中的脂质体悬浮液（50 μg/ml）温育1小时、2小时和4小时。然后用 pbs（1
×
，ph 7.4）洗涤细胞 3 次以去除游离脂质体。为了评估脂质体的细胞摄取活性，在成像前将细胞用 draq5
™
（5 μm, ab108410, abcam）染色10分钟。使用olympus fv3000共焦激光扫描显微术系统对细胞进行成像。405 nm和640 nm的激光源分别用于vp和draq5
™
的激发。
[0099]
经由光触发的脂质体的体外gfp基因转染的评估转染前，将hek293以 1
×
105个细胞/孔的密度接种在玻璃底培养皿上，继之以过夜温育。将并入了cas9 grna rpn的脂质体悬浮液（50 μg/ml）添加到每个孔中。2小时温育后，用新鲜培养基置换旧培养基，继之以690 nm的led灯（0.15 mw/cm2）分别照射2分钟、4分钟和6分钟。处理后，将细胞再温育48小时。来自细胞的gfp荧光信号在fv3000共焦激光扫描显微镜下成像。488 nm的激光用于gfp激发。通过使用imagej软件进行来自细胞的gfp荧光强度的定量分析。不同实验条件下的gfp敲除功效表示为相对于没有任何处理的对照细胞的平均百分比和标准差（n=4）。对于来自脂质体的crispr释放的空间控制的成像，培养皿在处理后在48小时在 ivis光谱体外成像系统（spectrum in vivo imaging system）（perkinelme，美国）下拍摄。gfp荧光成像的激发/发射波长为465 nm/560 nm。
[0100]
脂质体和光对细胞的毒性测定以及单线态氧对sgrna的影响
对于脂质体和光毒性实验，将hek293细胞（1
‑4×
10
4 ml
‑1）在96
‑
孔平板中在具有10% fbs的培养基中生长24小时，继之以与脂质体悬浮液温育2小时以及以后的光照射。处理后，去除旧培养基并向细胞添加新鲜培养基。在24小时时，通过mts测试（promega co.，美国）根据制造商的说明确定脂质体和光对细胞的细胞毒性并与没有任何处理的对照细胞进行比较。然后将细胞生存力计算为未处理的对照样品吸光度的百分比。后者设置为100%。
[0101]
对于单线态氧对sgrna的影响的评估，将sgrna和维替泊芬的混合溶液（3 μg/ml sgrna和16 μg/ml维替泊芬）分别暴露于不同时间点（0、2、4和6分钟）的光照射。处理后，将10 ul每种样品与2 ul 6
×
加样染料（thermo fisher）混合，用于在装载了1
×ꢀ
sybr gold（thermo fisher）的2.5%琼脂糖凝胶（sigma
‑
aldrich，澳大利亚）上的凝胶电泳。凝胶电泳在1
×ꢀ
tbe缓冲液（10.8 g tris碱、5.5 g硼酸、4 ml 0.5 m edta、1 l d/d 水，ph 8.4）中于110v进行50分钟。使用bio
‑
rad gel doc xr 系统在uv光下拍摄凝胶图像。
[0102]
蛋白质印迹分析处理后，根据制造商的规程，将hek293细胞用pbs洗涤两次，并用补加了蛋白酶抑制剂混合物（thermo fisher scientific）的ripa缓冲液（thermo fisher scientific）裂解。总蛋白被提取并装载到bis
‑
tris蛋白凝胶（thermo fisher scientific）的孔中。分离后，蛋白质被转移到pvdf膜（thermo fisher scientific）。膜于4℃用bsa封闭缓冲液（thermo fisher scientific）封闭过夜，并与gfp多克隆抗体（a11122，life technologies australia pty ltd，1:1000稀度）于室温温育1小时。用tbst洗涤3次后，将膜与相应的hrp
‑
缀合的第二抗体（1:1000稀度）于室温温育1小时。用tbst洗涤3次后，将膜使用增强的化学发光试剂在chemidoc
™ꢀ
mp成像系统（bio
‑
rad laboratories, inc.，美国）上显像。
[0103]
斑马鱼胚胎斑马鱼胚胎和成体根据斑马鱼设施sops进行维持和处理，经macquarie university的animal research ethics committee批准，并依照animal research act, 1985和animal research regulation, 2010。成体斑马鱼在标准条件下维持。acta1:ebfp2;smyhc1:egfp系通过杂交tg(acta1:ebfp2)pc5（cole等人，2011, plos, 9(10): e1001168）和tg(smyhc1:egfp)（elworthy等人，2008, development, 135(12):2115
‑
2126）品系获得。
[0104]
靶位点选择对于初始筛选，根据schier等人2014在与序列gn18gngg匹配的egfp基因的早期5'区域内手动选择crispr sgrna靶位点。为避免任何脱靶（off
‑
targets），使用bowtie和bowtie2方法以及不耐受靶位点前十个3'碱基中任何错配的预定义的特异性规则在blastn（zv9）中检查这些位点的唯一性。
[0105]
sgrna的产生为了产生用于sgrna转录的模板，将含有无pam的20碱基靶位点的靶基因特异性互补寡核苷酸彼此退火，然后克隆到含有t7启动子序列和tracrrna尾的质粒（p
×
330，addgene）中。使用zyppy质粒小量制备试剂盒（zymo research）纯化所得到的sgrna模板。
[0106]
为了制备crispr sgrna，模板dna（来自上述步骤）首先通过bamhi消化线性化，然后使用qiaprep柱进行纯化。crispr sgrna使用megashortscript t7试剂盒（invitrogen）通过体外转录产生。体外转录后，使用mirvana mirna分离试剂盒（invitrogen）纯化sgrna
（~140个核苷酸长）。所得到的sgrna的大小和质量由通过3%（wt/vol）低范围琼脂糖凝胶的电泳确认。重组cas9蛋白获自toolgen, inc.。
[0107]
脂质体
‑
cas9 rnps显微注射到斑马鱼胚胎中在注射日，注射混合物如下制备：表1：对于初始筛选，收集了斑马鱼tab wt胚胎。将注射组分混合并于室温温育5分钟形成复合体，然后贮存在冰上。使用标准斑马鱼注射规程将注射mastermix装载入针并显微注射到受精卵中。目的是将2nl注射混合物递送到单个细胞（不是卵黄）中。注射的卵在100mm塑料培养皿中的1
×
卵水中生长，并保持在28℃的培养箱中。胚胎密度不超过每个培养皿中25mm卵水中不止60个胚胎。一些未注射的胚胎（对照组）保持来自相同的窝并于28℃生长。胚胎长到48
‑
72hpf。
[0108]
体内重组分析在24hpf、48hpf和72hpf的结尾拣出具有发育缺陷的胚胎。只保留形态看起来正常的胚胎。约70
‑
80%的胚胎在72hpf时看起来是正常的。在72hpf时，随机选择16个胚胎并使用tricane进行麻醉。麻醉的鱼被封固在玻璃底35mm培养皿中的1%低熔点琼脂糖上。使用leica dmi3000倒置显微镜对封固的胚胎的躯干进行egfp信号的筛选。
[0109]
基因型分型高分辨解链（hrm）分析用于crispr
‑
cas9诱导的体细胞突变的快速和有效鉴定。hrm是基于荧光的测定，其测量于不同温度的dsdna的量，从而揭示感兴趣的pcr产物的解链温度（tm）。虽然由纯合dna样品产生的同源双链体产物将具有特定的tm，但由杂合个体产生的异源双链体产物将具有额外的tm，通常低得多的tm特征。正是这种异源双链体特征促进了突变等位基因的鉴定。为了鉴定crispr
‑
cas9注射的胚胎中的体细胞诱变，使用hotshot方法从8个胚胎的集合体中提取基因组dna（gdna）。使用hrm测定分析所得到的gdna。通过聚合酶链反应（pcr）进一步对来自hrm测定的成功命中进行基因型分型。
[0110]
显微术图像在leica dmi3000倒置显微镜和zeiss共焦显微镜上拍摄。将鱼胚胎包埋在35mm玻璃底培养皿中的1%低熔点琼脂糖上。切片使用zerene stacker软件进行焦点堆栈（focus
‑
stacked）。使用imaris软件产生和分析鱼胚胎的虚拟横切面。
[0111]
结果：脂质体的表征图1显示了装载有维替泊芬的脂质体的典型tem图像。平均大小为约167.5 /
‑
1.9 nm。脂质体的大小分布和ζ电势（图2a和图3a）通过动态光散射进行证实。表面电荷被测定为28 /
‑ꢀ
1.1 mv。
[0112]
装载在脂质体内的维替泊芬的吸收和荧光光谱在图2b中显示，其中清楚地观察到vp的特征峰，如图2b中所示的。在dls实验和vp释放测量中分别研究了光照射后制备的脂质体的结构破坏和释放行为。图3b显示了在没有和有光照射的情况下脂质体溶液的大小分布。与在没有光照射的情况下的脂质体相比，2分钟照射后脂质体的平均大小减小。然而，这两种样品的大小分布相似（0.4386对0.4573）。脂质体的良好分离的峰在4分钟和6分钟后出现，第一个单独峰代表脂质体的较小大小，且第二个表示脂质体聚集体的。结果揭示了在4分钟和6分钟光照射后，大部分脂质体被破坏成小块，而一些块形成聚集体。图3b显示了在有和没有光照射的情况下自脂质体样品中的vp释放的比例。在光触发的情况下和2分钟光照射下的脂质体之间观察到相似的vp释放概况，从而表明2分钟照射不明显影响脂质体结构。对比起来，在4分钟和6分钟光照射后3小时，vp的释放显著加速，累积释放达到与从由triton x
‑
100完全破坏的脂质体释放的相似量的vp。研究结果表明，在较长的照射时间（在所述研究中为4分钟及以上）的情况下，从vp产生了足够量的ros，从而氧化不饱和的脂质双层并诱导自脂质体的vp释放。
[0113]
脂质体的细胞摄取活性和体外gfp基因敲除的评估为了研究脂质体的细胞摄取，用脂质体处理hek293细胞1小时、2小时和4小时。2小时温育后观察到比处理1小时的细胞更高的来自vp的红色荧光信号。4小时温育后，与2小时温育时间段相比，来自vp的红色信号没有显著变化。然而，由于非特异性结合，在其他区域中也观察到一些簇（数据未显示）。因此，我们为hek293细胞选择了2小时的温育时间。
[0114]
使用共焦荧光成像和蛋白质印迹测定两者评估了crispr/cas9从光触发的脂质体释放后hek293细胞中的gfp击倒效率（图4a和4b）。当细胞仅用脂质体处理时，与没有任何处理的对照组相比，观察到稍微较低的gfp荧光强度（比对照低约5%），从而表明脂质体制剂在与细胞温育期间的稳定性。在光照射的情况下，crispr/cas9复合体从脂质体释放并敲除gfp，从而导致其荧光信号明显降低。与没有光照射的情况下的脂质体转染的细胞相比，6分钟照射后达到最低的gfp表达水平（52.8%对94.8%）。为了比较起见，我们还通过采用lipofectamine 2000试剂作为递送载体测试了gfp基因敲除功效。在处理后48小时在hek293细胞中观察到降低的gfp荧光强度。尽管通过使用商业的lipofectamine观察到类似的gfp转染效果，但通过使用我们的光触发的脂质体实现了按需（on
‑
demand）基因释放。
[0115]
为了显示crispr释放的空间控制的独特应用，我们通过使用ivis成像系统对整个培养皿进行了成像。crispr释放对gfp基因敲除的空间控制在图5中显示。在光和脂质体
‑
crispr联合处理的条件下，与细胞的未照射的区域相比，在光暴露点内的gfp荧光强度明显降低。我们还检查了用单独的脂质体配制的crispr、单独的光照射以及具有空脂质体和光的组合处理的细胞的荧光强度。这些条件没有显示出显著的光触发的基因敲除效果。研究结果表明，通过将递送载体与光组合，空间可控的方式将是可能的。
[0116]
单线态氧对hek293细胞中sgrna和脂质体的毒性的评估
我们首先通过用光照射对sgrna和vp的混合物溶液进行照射检查了单线态氧对sgrna的作用。如图13a中所示的，与对照相比，没有观察到明显的rna损伤。单线态氧的短生存期阻止其移动更大的距离，因此其主要在产生它的光敏剂分子附近导致局部化的纳米大小的损伤。在所述研究中，由装载在脂质双层中的vp产生的单线态氧主要使不饱和的脂质去稳定，并从而诱导crispr剂释放。这样，单线态氧对sgrna的不利影响将被减至最小。我们还评估了在处理后24小时纯脂质体和与光的组合条件在hek293细胞中的毒性。与对照组相比，用最多到100 μg/ml的脂质体浓度和与光照射的组合处理的细胞的生存力中未观察到显著变化（图13b）。这些结果提示，在体外条件下，我们在当前研究中具有光设置的脂质体样品可能不影响hek293细胞的生存力。
[0117]
用于快速定量体内敲除效率的可视报道系统为了评估体内crispr/cas9的光敏脂质体递送的效率，我们在斑马鱼中开发了定量可视报道系统。我们确立了基因敲除策略，其中在稳定的转基因斑马鱼的慢肌纤维中特异性表达的egfp被crispr/cas9敲除（图6a）。慢缩肌纤维形成与斑马鱼的长轴平行排列的直接在皮肤下的单个浅层（图6b）。我们使用了转基因斑马鱼系（smyhc1:egfp），其中慢肌特异性smyhc1启动子驱动在慢缩肌纤维的egfp表达（图6c）。为了产生高效的dsb，我们使用报道系统筛选了8个靶向egfp的sgrnas，并选择了显示最高程度切割效率（88.24%）的sgrna（表2）。为了评估可视报道系统的效率，我们将靶向egfp基因座的sgrna与cas9蛋白共同注射到单细胞斑马鱼胚胎中（图6d）。我们观察到横过个别慢缩肌纤维中绿色荧光信号的丧失，从而显示egfp表达的丧失，而在没有egfp sgrna的情况下注射的对照组没有显示出绿色荧光信号的任何丧失（图14a和b）。这允许在体内以单细胞分辨率对敲除效率的快速可视定量。
[0118]
表2光触发的脂质体对egfp基因的体内敲除的评估在确认体外crispr转染后，我们测试了我们是否可以证明通过使用光触发的脂质体在斑马鱼中可控释放crispr/cas9对egfp的靶向敲除。为了确定光触发的基因组编辑的效果，我们将cas9蛋白和包囊维替泊芬和egfp sgrna的脂质体共同注射到转基因smyhc1:egfp斑马鱼胚胎中。注射的胚胎随机分为两组；没有光暴露或在690 nm处光暴露5分钟。我们使用上述可视报道系统来评价体内光控基因组编辑的效率。最初的定性评估显示肌肉纤维中绿色荧光信号的较大丧失，从而提示crispr/cas9的光触发的释放（图7a、b）。阴性对照组没有显示绿色荧光信号的任何丧失，从而强调了测定的特异性。因此，我们继续定量每个胚胎躯干中敲除的慢肌纤维总数目（每组n = 80个胚胎；图7c和14b）。与阴性对照相比，没
有光暴露导致绿色纤维适度但显著的丧失（图7c；
‑
ve对照，0
±
0；光（
‑
），53.15
±
35.38，p<0.0001，具有多重比较的单因素方差分析）。比较起来，与无光对照组相比，暴露于光激活的胚胎显示绿色纤维数目的引人注目地显著减少，从而意味着体内egfp的光触发的敲除（图7c；光（
‑
），53.15
ꢀ±ꢀ
35.38；光（ ），308.37
ꢀ±ꢀ
40.21，p<0.0001）。与在没有脂质体的情况下注射了egfp和cas9的阳性对照组相比，暴露于光激活的胚胎显示出类似水平的绿色慢肌纤维数目的减少。我们进一步观察到，我们的定量模型的结果与总荧光强度结果一致（图7b、c）。
[0119]
为了最优化斑马鱼中crispr/cas9的光触发的释放，我们首先使用可视报道系统作为测试台比较了不同的光暴露时间。用脂质体纳米颗粒和cas9蛋白共同注射的胚胎经受了五种不同照射时间之一，1分钟、2分钟、5分钟、15分钟、60分钟。定性评估暗示光暴露时间之间的差异，从而提示对光的更长暴露导致更高的敲除率（图8a、b）。单纤维分析的定量分析表明，较长的光暴露时间导致绿色慢肌纤维的较高丧失。（图8c；无光，27.84
ꢀ±ꢀ
9.81；光（1分钟），113.12
ꢀ±ꢀ
14.77，光（2分钟），300.67
±ꢀ
30.16 光（5分钟），326.12
ꢀ±ꢀ
36.55；n =每组60个胚胎）。然而，在长于5分钟的光照射，我们没有观察到绿色荧光信号丧失的任何显著差异（图9b；光（5分钟），326.12
±
36.55；光（60分钟），332.65
±
33.60，p=0.43）。最多到5分钟的光照射不影响胚胎存活，但更长暴露于红光导致降低的胚胎生存力。在60分钟光照射时，36%的斑马鱼形态看起来正常的斑马鱼胚胎保持活着（图10a）。
[0120]
紧接着，我们研究了脂质体纳米颗粒浓度对crispr sgrna的光触发的释放的影响。我们还通过测量注射了不同脂质体浓度的斑马鱼胚胎的孵化率确定了脂质体浓度对胚胎毒性的作用。虽然较高浓度的脂质体导致斑马鱼胚胎中增加的死亡率（图10b），但crispr的光触发的释放效率保持未受影响（图11b）。
[0121]
讨论和结论通过crispr基因编辑操作任何基因组序列的能力已为生物学研究和医学应用创造了种种机会。然而，基因编辑的进一步改进需要开发最佳的递送载体。非病毒递送特别有利，这是因为其避免了插入错误并且允许对递送的剂量、持续时间和特异性的紧密控制。这里研究的脂质体平台能够通过将安全水平的690 nm光（0.15 mw/cm2）应用到组织表面的外部光束以空间和时间上可控的方式同时释放可控量的cas9核酸酶和匹配量的grna。虽然触发我们的脂质体所需的光只能穿透组织最多到几毫米，但为癌症光动力疗法开发的光学纤维方法使这些脂质体也可能应用于深层组织。
[0122]
crispr试剂的光触发的脂质体释放为要在空间和时间上局部化的基因编辑提供了以前达不到的选择；这种四维控制对于新的研究应用和crisr
‑
cas9技术的进一步临床转化将是重要的。
[0123]
在临床前背景中用于crispr转染的脂质纳米颗粒和常规基于脂质体的递送具有缺点。在通过内吞途径内化后，这些载体中的大多数变得截留在内/溶酶体中，在那里酶促降解可能导致crispr组分在它们能够被释放以执行其基因编辑作用之前失活。因此，通过基于脂质的纳米颗粒进行有效的cirspr/cas9转染需要确保货物的快速内/溶酶体逃逸。我们的光可触发的脂质体克服了内/溶酶体截留的问题，这是因为，正如我们较早所确立的，被光照射激活的vp产生足够的单线态氧，以不仅使脂质体去稳定，而且使脂质体和内/溶酶体膜去稳定。
[0124]
我们的脂质体递送限定量的完整cas9的能力代表了所述制剂对于有效和无毒基因编辑的关键优点。cas9蛋白是大的（~160 kda），且这阻止了它直接递送至细胞（glass等人, trends in biotechnology, 2018, 36(2): p. 173
‑
185）。我们发现我们的脂质体包囊使得能够将cas9蛋白直接递送至细胞，并可能部分保护其免于降解。crispr中的这种直接核酸酶递送提供了在没有蛋白质表达过程的情况下的直接功能和最快速的治疗活性，这是因为没有细胞翻译或转录。直接递送纯化的核酸酶蛋白或cas9蛋白
‑
grna复合体更加重要，这是因为其产生高水平的基因编辑[56]。这与这里报道的与对照组相比在用光触发脂质体处理的hek293细胞中（最多到52%）和在斑马鱼胚胎（最多到77%）中观察到的高效率的egfp敲除的结果一致（图 4、5和7）。我们的结果证实，光触发的crispr/cas9释放不损害靶基因座中的基因组编辑活性。经由脂质体的瞬时蛋白质递送也限制了核酸酶活性的持续时间，从而潜在减少脱靶（off
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target）编辑，这是因为核酸酶具有较少的用于混杂作用的机会。因此，我们的方法可能在确保crispr
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cas9工具的精确性和安全性中发挥重要作用。脂质体还使得能够将grna直接递送至细胞，这并不简单，这是因为grna的长磷酸主链太带阴电，以致于不能被动穿过膜。此外，脂质体可以帮助grna避免核酸酶降解。我们在这项工作中发现，我们的脂质体包囊为crispr试剂提供了足够的保护，以获得在hek293细胞和斑马鱼胚胎中的细胞进入，和接着从内体中逃逸以在保持功能的同时进入细胞质。我们还观察到在未暴露于光的对照中仅适度的脂质体内容物泄漏。这试验性地解释了细胞内容物可能损害脂质体膜的完整性。在当前的实验条件下，脂质体纳米颗粒在hek293细胞和斑马鱼胚胎两者中均显示出最小的细胞毒性（图13）。
[0125]
图4中显示的数据将我们的光触发的脂质体递送与使用lipofectamine递送的crispr进行了比较，lipofectamine是一种用于核酸和基因编辑蛋白的可商购获得的脂质体递送载体。lipofectamine利用脂质在水溶液中自发形成纳米颗粒的能力，以保护它们的疏水尾部免受溶剂。通过简单的混合，可以将有效负载包囊在脂质纳米颗粒中。lipofectamine含有与带阴电的核酸分子复合的阳离子脂质，且这降低了带阴电的细胞膜的静电排斥作用。这额外地保护核酸免受核酸酶，并允许它们被靶细胞吸收。lipofectamine以前已与crispr系统一起用于各种应用目的，包括产生免疫缺陷模型（horii, t.等人, generation of an icf syndrome model by efficient genome editing of human induced pluripotent stem cells using the crispr system. 2013. int. j. mol. sci. 14(10): p. 19774
‑
19781）、多重基因组编辑（sakuma, t.等人, multiplex genome engineering in human cells using all
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in
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one crispr/cas9 vector system. 2014. sci rep 4: p. 5400）和囊性纤维化和膀胱癌的基因治疗（schwank, g.等人, functional repair of cftr by crispr/cas9 in intestinal stem cell organoids of cystic fibrosis patients. 2013. cell stem cell 13(6): p. 653
‑
658；liu, y.等人, synthesizing and gate genetic circuits based on crispr
‑
cas9 for identification of bladder cancer cells. 2014. nature communications 5: p. 5393）。发现经由我们的光触发的脂质体和lipofectamine的体外crispr转染效率是可比较的（图4中52%对50%的gfp水平降低）。然而，与lipofectamine不同的是，我们的脂质体可以由光触发，从而允许基因编辑的空间和时间控制，并且它们用不同的感兴趣的配体进行功能化是可行的。
[0126]
这里报道的光可触发的crispr递送载体是生物相容的，并且完全由临床批准的组分使用简单的合成方法制备。所述设计避免了在将来按比例增大过程中对许多制造步骤的需要。从商业和监管观点看，整个基因治疗产品可以包装在单个载体中也是重要的。体内基因编辑得益于组织特异性靶向（例如使用cas9的组织特异性启动子），以防止不期望的脱靶基因编辑事件。脂质体的靶向递送是充分确立的，且这种分子靶向也直接适用于这里研究的携带crispr的脂质体。脂质体也非常适合于多种组分的共同递送，且这是非常相关的，这是因为新的crispr改进可能需要同时递送多种功能实体。脂质体完全不含dna，且这将有助于避免dna毒性和刺激免疫应答。通过最优化制剂和通过合适的施用途径，可以在具体疾病状况中实现有利的生物分布（biodistribution）。
[0127]
实施例2
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经由x射线触发的脂质体系统的crispr/cas基因编辑的空间和时间控制当将光触发的脂质体应用于深层肿瘤治疗时，光触发方式具有有限的组织穿透深度（几mm）。由于这种适度的穿透深度的结果，可见光可能不能激活深深地位于体内的光敏剂并产生足量的单线态氧（1o2）或其他活性氧类别（ros）以释放治疗效果所需的脂质体货物。凭借其优秀的组织穿透深度，用于脂质体触发的x射线辐射提供了一种替代方法，以产生经由诸如伽玛刀（gamma
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knife）的标准放射治疗方法（begg, a.c.等人, nature reviews cancer, 2011. 11 (4): p. 239
‑
253）的空间靶向（例如至肿瘤部位）和一旦它们位于靶部位就触发的包囊的内容物从脂质体的释放两者。重要的是，x射线脂质体触发可以与放射治疗同时使用，放射治疗是癌症的常见治疗方式。
[0128]
我们以前表明，通过低剂量x射线辐射（2
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4 gy剂量）可以充分激活维替泊芬，以触发药物从含有维替泊芬的脂质体膜中的不稳定性中释放（deng, w.等人, controlled gene and drug release from a liposomal delivery platform triggered by x
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ray radiation. 2018. nature communications, 9(1): p. 2713）。 我们通过使用装载有维替泊芬、金纳米颗粒和化学疗法药物阿霉素（dox）的x射线触发的脂质体，在携带异种移植模式的癌症的balb/c nu/nu小鼠模型中证明了体内治疗效果。
[0129]
我们将crispr/cas9装载到x射线触发的脂质体中，所述脂质体装载了维替泊芬、金纳米颗粒和靶向tnfaip3基因的crispr/cas9，并评估了其在人胚胎肾细胞（hek293）中对a20敲除的能力。装载有维替泊芬和金的脂质体如deng等人(2018) nature communications, 第9卷, 文章编号2713中所描述的制备。由tnfaip3基因编码的a20作为nf
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κb信号传导的负调节剂促进微生物耐受性：一种用于激活先天和适应性免疫应答的进化上古老的且中心的途径。我们通过使用x射线触发的crispr脂质体对a20敲除的结果示于图12中。在如所示的这些处理之后，tnfaip3基因表达水平（相对于gapdh）改变为不同的水平。与阳性对照（商业脂质体 crispr，绿色矩形）相比，装载有crispr的x射线触发的脂质体（紫色矩形）后基因表达也明显降低。我们还检查了其他处理条件，包括单独的空脂质体、单独的具有crispr的脂质体、单独的x射线，这些条件没有有效地影响基因敲除。这些结果表明，脂质体可以被x射线辐射破坏，以将crispr/cas9释放到深层组织的靶细胞中。