基于低温超微粉碎耦合pH法提取菜籽饼粕高蛋白的方法与流程

基于低温超微粉碎耦合ph法提取菜籽饼粕高蛋白的方法
技术领域
1.本发明属于农副产品加工技术领域，尤其涉及一种基于低温超微粉碎耦合ph法提取菜籽饼粕高蛋白的方法。


背景技术：

2.油菜籽，十字花科(cruciferae)芸薹属(brassica)作物油菜的种子，世界第三大植物油原料。我国作为油菜的主产国之一，以甘蓝型为主栽品种，其含油率约35％～45％。饼粕作为油菜籽榨油的主要副产物根据制油工艺不同可分为浸提菜籽饼粕和压榨菜籽饼粕，两者主要在残油率、蛋白含量及硫甙含量三方面有所差异，其中压榨粕蛋白质量较好、硫甙含量较低，但残油率高，一般为7％～15％，甚至高达20％，受产业链条的经济效益影响，目前市场上仍以浸提菜籽饼粕为主。据usda统计数据，2019～2020交易年度全球菜籽饼粕产量约0.39亿吨，其中我国菜籽饼粕消费总量达0.11亿吨，消费量巨大。菜籽饼粕其粗蛋白含量较高，氨基酸组成均衡、含有丰富的含硫氨基酸及一定量的赖氨酸，蛋白质效价比值高于大豆蛋白，是一种优质的植物蛋白资源，但在我国菜籽饼粕一直在饲料领域广泛应用，附加值利用不足。
3.随着人们消费观念的转变及政策支持，植物蛋白市场潜力巨大。《国民营养计划(2017
‑
2030)》指出：到2030年，我国居民膳食中要减少50％动物蛋白摄入量；“markets and markets
tm
2020年植物蛋白报告”预测未来五年植物蛋白市场将以14％年复合增长率发展。目前，国际上已有burcon及dsm的菜籽蛋白产品先后被fda、efsa批准公认安全的(generally regarded as safe,gras)及食品新资源原料，菜籽蛋白正在作为一种新型产品逐步从动物转向人类营养市场。
4.菜籽饼粕在具备高蛋白含量同时，还含有一定量的纤维、硫甙及植酸等抗营养物质。目前菜籽蛋白的制备方法主要包括ph分段控制法、盐溶法、osborne(osb)法及酶解法等，其中ph分段控制中的碱溶酸沉法是目前满足产业化生产中高产量及高纯度的要求最常用的方法。采用碱溶酸沉法从菜籽饼粕中提取蛋白质通常要先经过乙醇/乙醚脱脂、干燥、粉碎等预处理，再进行碱性环境提取，酸沉或不沉，离心后喷雾干燥或冻干，所的蛋白产品其色泽及溶解性较差、且环境污染大、能耗高，不符合目前绿色发展的观念。
5.另外，公开号为cn112574276 b，名称为“一种菜籽蛋白的提取工艺”的发明专利申请，具体公开了“提取工艺包括将油菜籽经过脱皮及仁皮分离后，对菜籽仁进行软化处理，对经软化处理后的菜籽仁进行压榨处理，对经压榨处理后的饼胚进行粉碎，得菜籽粕；将菜籽粕置于容器中，加入石油醚，脱脂，过滤，将脱脂后菜籽粕置于容器中，加入混合液，浸泡2
‑
4h后进行辐照处理，过滤，向辐照后沉淀物中加入盐酸水溶液，超声处理，过滤，向所得混合料a中加入乙醇水溶液，超声处理，过滤，向混合料b中加水，调节ph，升温，加入复合酶，酶解，灭酶，过滤，向酶解液中加入活性炭，抽滤，将滤液浓缩、冷冻干燥”，但该方法需要添加大量石油醚进行脱脂，且需要进行辐照，工艺技术复杂且能耗高，同时辐照处理需要在特殊的环境进行。制备工艺复杂，设备及环境要求高、成本高。
6.又如，公开号为cn106866783 a，名称为“从菜籽饼中提取粗蛋白的工艺方法”的发明专利申请，具体公开了“提取工艺包括取菜籽饼用乙醇浸泡脱去油脂，得脱脂菜籽饼将脱脂菜籽饼干燥、粉碎，得菜籽饼粉碎料将菜籽饼粉碎料与氢氧化钠水溶液混合浸提，得菜籽饼浸提液将菜籽饼浸提液离心分离，取上层上清液用酸碱剂调节,离心分离沉淀即得所述粗蛋白”，该方法仍同样是传统的脱脂、碱溶酸析方法，需消耗大量有机试剂，且制备效率低。
7.再如，公开号为cn 113057249a，名称为“一种无毒菜籽分离蛋白及其制备方法”的发明专利申请，具体公开了“该发明也是先进行菜籽饼粕正己烷脱脂处理，然后进行植酸酶处理，经酶解处理的饼粕渣进一步用碱溶酸沉法制备菜籽蛋白，乙醇水洗涤后进行冻干”，可见，该方法仍需进行脱脂处理，之后再进行酶解，试剂消耗量大。
8.基于此，急需优化及改进现有技术菜籽饼中高蛋白的提取方法，以期以最环保，最高效的提取方法来代替现有的提取技术。


技术实现要素：

9.针对上述菜籽饼粕蛋白制备均需有机溶剂脱脂制备脱脂饼粕再进行粉碎，酶解或不酶解进行碱溶酸析制备菜籽蛋白的工艺中存在的操作程序多、有机试剂消耗量大且不符合当前绿色发展需求的问题，本发明提出了一种新的改进的基于低温超微粉碎耦合ph法提取菜籽饼粕高蛋白的方法，该方法采用饼粕原料直接进行超微技术物理改性，在减小饼粕粒径增大其比表面积的同时、改善饼粕中纤维与蛋白的作用程度，提高纤维的溶解程度，从而降低碱溶蛋白所需的碱液强度并保障其溶出效果，该方法工序简易、不需进行有机溶剂脱脂、且碱溶液消耗量小
10.为了实现上述目的，本发明的具体技术方案如下：
11.基于低温超微粉碎耦合ph法提取菜籽饼粕高蛋白的方法，包括以下步骤：
12.s1：收集菜籽饼粕，通过超微粉碎机对菜籽饼粕进行预处理，获得原料中间体菜籽饼粕超微粉体；
13.s2：经步骤s1得到的菜籽饼粕超微粉体体置于反应容器，加入已调节好ph的碱混合液，浸提，过滤，得上清液a；
14.s3：对经步骤s2得到的上清液a直接进行干燥制得菜籽粕蛋白提取物ap；
15.或，向上清液a用hcl调节ph至酸性，静置后，过滤离心，得到上清液b和沉淀c，上清液b经喷雾干燥制得菜籽粕蛋白提取物bp，沉淀c经冷冻干燥制得菜籽粕蛋白提取物cp。
16.作为优选，所述步骤s1中菜籽饼粕超微粉碎处理改性的控制参数为：控制装料量不大于腔体的2/3，控制超微粉碎温度0
‑
10℃，控制超微粉碎时间在5
‑
30min。
17.作为优选，所述步骤s1经超微粉碎后的菜籽饼粕中间体的粒径分布(d
90
)为在80um
‑
200um。
18.作为优选，所述步骤s2中碱混合液的ph范围为7
‑
10，且碱混合液的加入量是菜籽饼粕超微粉体的10
‑
40倍。
19.作为优选，所述碱混合液不超过0～0.5mol/l的nacl或cacl2及0～0.3％的na2so320.作为优选，所述步骤s2中是在常温到45℃条件下浸提1
‑
2h后，过滤，得到上清液a。
21.作为优选，所述步骤s3中用hcl调节的酸性ph为3
‑
4.2，静置时间为1
‑
3h。
22.作为优选，所述步骤s3中菜籽粕蛋白提取物cp进行复溶进行活性炭脱色处理。
23.特别的，活性炭的加入量为蛋白溶液质量的1～3％，搅拌30
‑
60min，抽滤，得滤液，将滤液浓缩、冷冻干燥，得菜籽蛋白。
24.与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
25.1.本发明利用超微粉碎先进技术对菜籽饼粕直接进行物理改性处理，一是提高菜籽饼粕超微粉活性物质浸提的比表面积，二是通过破坏纤维
‑
蛋白的复合结构从而提高蛋白质的溶出效果，可实现菜籽饼粕无需脱脂处理直接在温和碱性条件下制备菜籽蛋白。该方法无需大量有机溶剂、工艺程序简单、环境污染小，复合绿色发展的趋势。
26.2.利用该方法所制备的三种不同菜籽饼粕蛋白提取物，具有一定的清除abts自由的能力及抑制金黄色葡萄球菌生长的能力。
27.3.利用该方法所制备的菜籽粗蛋白cp中蛋白质在30
‑
40kda及22
‑
14kda间均有分布，即主要为菜籽球蛋白；菜籽粕蛋白提取物bp的蛋白质分子量主要分布在～16kda，主要为菜籽白蛋白。
28.4.本发明所提出的方法能够通过菜籽饼粕的超微粉碎预处理提高蛋白质溶出率、降低碱溶环节的碱性强度，在提高蛋白质品质的同时降低有机溶剂及碱的使用量，制备工艺更环保。
附图说明
29.图1是实施例1
‑
3以及对比例中菜籽饼粕超微粉体粒径分布图。
30.图2中a和b分别为实施例1中菜籽饼粕超微粉体放大1000倍及3000倍的sem图。
31.图3中a和b分别为实施例2中菜籽饼粕超微粉体放大1000倍及3000倍的sem图。
32.图4中a和b分别为实施例3中菜籽饼粕超微粉体放大1000倍及3000倍的sem图。
33.图5中a和b分别为对比例1中菜籽饼粕超微粉体放大1000倍及3000倍的sem图。
34.图6中a和b分别为对比例2中菜籽饼粕超微粉体放大1000倍及3000倍的sem图。
35.图7为实施例3中蛋白质的分子质量分布图。
36.图8为实施例2中蛋白质的抑菌能力对照图。
具体实施方式
37.为了使本技术领域的人员更好地理解本发明方案，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分的实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。
38.本发明提供的基于低温超微粉碎耦合ph法提取菜籽饼粕高蛋白的方法，包括以下步骤：
39.s1：收集菜籽饼粕，并通过超微粉碎机对菜籽饼粕进行预处理，获得超微粉体状的菜籽饼粕中间体；具体是：
40.1)将市场所售的菜籽饼粕直接进行低温超微粉碎处理，根据超微粉碎机的处理能力，控制装料量不大于腔体的2/3，控制超微粉碎温度0
‑
10℃，控制超微粉碎时间在5～30min，更精确的根据不同超微粉碎机的选型，控制菜籽饼粕超微粉体的粒径分布(d
90
)在
80um～200um，该粒度范围内饼粕微粉在提取介质中呈均匀分散状态并具有较大的比表面积，微粉与提取介质间的充分接触十分有利于蛋白物质的有效溶出；同时超微粉碎处理可一定程度改善纤维素的溶解性，提高蛋白质的溶出效果；而当微粉粒度(d
90
)＜80um后会发生粉体临界聚集造成表观粒度的增大或当其粉体粒径(d
90
)＞200um后，粉体比表面积的降低将不利于蛋白的溶出，这一点在实施例和实验结果部分得到了很好的验证；
41.s2：经步骤s1得到的菜籽饼粕中间体置于反应容器，加入已调节好的ph(7
‑
10)碱混合液，碱混合液的加入量是菜籽饼粕超微粉的10
‑
40倍，在常温到45℃条件下浸提1
‑
2h，过滤，得上清液a；
42.s3：对经步骤s2得到的上清液a直接进行干燥制得淡黄色的菜籽粕蛋白ap(粗蛋白含量约25％)；
43.或，向上清液a用hcl调节ph至酸性，静置后，过滤离心，得到上清液b和沉淀c，再上清液b经喷雾干燥制得乳白色菜籽粕蛋白提取物(bp粗蛋白含量约15％)，沉淀c经冷冻干燥制得棕色菜籽粕蛋白(cp粗蛋白含量约75％)。
44.实施例1
45.参照图1、2所示，一种基于低温超微粉碎耦合ph法提取菜籽饼粕高蛋白的方法
46.包括以下步骤：
47.s1将市场所售的菜籽饼粕直接进行低温粉碎处理，根据超微粉碎机的处理能力，粉碎腔体装料量400g,超微粉碎温度0℃，处理时间为5min,得到菜籽饼粕超微粉体平均粒径d
90
为178.1um；
48.s2将s1得到的菜籽饼粕中间体置于反应容器，加入ph＝10碱混合液，碱混合液的加入量是菜籽饼粕超微粉的40倍，在45℃条件下浸提2h，离心过滤，得上清液a1。其中碱混合液中含0.2mol/l的nacl及0.3％的na2so3；
49.s3对经步骤s2得到的上清液a1直接进行干燥制得淡黄色的菜籽粕蛋白ap1；
50.或向上清液a用hcl调节ph至3.5，静置后，过滤离心，得到上清液b1和沉淀c1，上清液b1经喷雾干燥制得乳白色菜籽粕蛋白提取物bp1，沉淀c1复溶后添加其质量2％的活性炭进行脱色处理，然后冷冻干燥得到菜籽粕蛋白cp1。
51.实施例2
52.参照图1、3所示，一种基于低温超微粉碎耦合ph法提取菜籽饼粕高蛋白的方法s1将市场所售的菜籽饼粕直接进行低温粉碎处理，根据超微粉碎机的处理能力，粉碎腔体装料量400g,超微粉碎温度4℃，处理时间为15min,得到菜籽饼粕超微粉体粒径d
90
为94.8um；
53.s2将s1得到的菜籽饼粕中间体置于反应容器，加入ph＝8碱混合液，碱混合液的加入量是菜籽饼粕超微粉的20倍，在30℃条件下浸提1.5h，离心过滤，得上清液a2。其中碱混合液中含0.3mol/l的nacl及0.2％的na2so3；
54.s3对经步骤s2得到的上清液a2直接进行干燥制得淡黄色的菜籽粕蛋白ap2；
55.或向上清液a2用hcl调节ph至4左右，静置后，过滤离心，得到上清液b2和沉淀c2，上清液b2经喷雾干燥制得乳白色菜籽粕蛋白提取物bp2，沉淀c2复溶后添加其质量3％的活性炭搅拌进行脱色处理，然后冷冻干燥得到菜籽粕蛋白cp3。
56.针对实施例2本技术还进一步做了抑菌能力测试，如图8所示，与ck相比可看出，菜籽粗蛋白bp及cp均表现出一定的抑制金黄色葡萄球菌生长的能力。
57.实施例3
58.参照图1、4所示，一种基于低温超微粉碎耦合ph法提取菜籽饼粕高蛋白的方法
59.s1将市场所售的菜籽饼粕直接进行低温粉碎处理，根据超微粉碎机的处理能力，粉碎腔体装料量400g,超微粉碎温度10℃，处理时间为30min,得到菜籽饼粕超微粉体粒径d
90
为82.5um；
60.s2将s1得到的菜籽饼粕中间体置于反应容器，加入ph＝7碱混合液，碱混合液的加入量是菜籽饼粕超微粉的15倍，在常温条件下浸提1h，离心过滤，得上清液a3。其中碱混合液中含0.5mol/l的cacl2及0.3％的na2so3；
61.s3向经步骤s2得到的上清液a3用hcl调节ph至4.2左右，静置后，过滤离心，得到上清液b3和沉淀c3，上清液b3经喷雾干燥制得乳白色菜籽粕蛋白提取物bp3，沉淀c3复溶后添加其质量3％的活性炭进行脱色处理，然后经冷冻干燥得到菜籽粕蛋白cp3。
62.下表为实施例3中蛋白质的体外清除自由基能力
[0063][0064]
针对实施例3还做了蛋白质的分子质量分布测试，如图7所示。
[0065]
结果表明：菜籽粗蛋白cp中蛋白质在30
‑
40kda及22
‑
14kda间均有分布，即主要为菜籽球蛋白；菜籽粕蛋白提取物bp的蛋白质分子量主要分布在～16kda，主要为菜籽白蛋白。
[0066]
对比案例1
[0067]
参照图1、5所示，s1将市场所售的菜籽饼粕直接进行常规粉碎处理，过60目筛,取筛下物备用，得到菜籽饼粕粉体粒径d
90
为379.514um；
[0068]
s2将s1得到的菜籽饼粕中间体置于反应容器，加入ph＝12.5碱混合液，碱混合液的加入量是菜籽饼粕超微粉的20倍，在30℃条件下浸提1.5h，离心过滤，得上清液a2。其中碱混合液中含0.3mol/l的nacl及0.2％的na2so3；
[0069]
s3对经步骤s2得到的上清液a2
‑
1直接进行干燥制得淡黄色的菜籽粕蛋白ap2
‑
1；
[0070]
或向上清液a2用hcl调节ph至4左右，静置后，过滤离心，得到上清液b2
‑
1和沉淀c2
‑
1，上清液b2
‑
1经喷雾干燥制得乳白色菜籽粕蛋白提取物bp2
‑
1，沉淀c2
‑
1复溶后添加其质量3％的活性炭搅拌进行脱色处理，然后冷冻干燥得到菜籽粕蛋白cp3
‑
1。
[0071]
与实施案例1、2、3相比，采用常规粉粹处理方式，未采用低温超微粉碎，且微粉粒度相对较大。
[0072]
对比案例2
[0073]
参照图1、6所示，将市场所售的菜籽饼粕直接进行低温粉碎处理，根据超微粉碎机
的处理能力，粉碎腔体装料量400g,超微粉碎温度0℃，处理时间为50min,得到菜籽饼粕粉体粒径d
90
为77.34um；
[0074]
s2将s1得到的菜籽饼粕中间体置于反应容器，加入ph＝7碱混合液，碱混合液的加入量是菜籽饼粕超微粉的20倍，在30℃条件下浸提1.5h，离心过滤，得上清液a5。其中碱混合液中含0.3mol/l的nacl及0.2％的na2so3；
[0075]
s3对经步骤s2得到的上清液a5
‑
1直接进行干燥制得淡黄色的菜籽粕蛋白ap5
‑
1；
[0076]
或向上清液a2用hcl调节ph至4左右，静置后，过滤离心，得到上清液b5
‑
1和沉淀c5
‑
1，上清液b5
‑
1经喷雾干燥制得乳白色菜籽粕蛋白提取物bp5
‑
1，沉淀c5
‑
1复溶后添加其质量3％的活性炭搅拌进行脱色处理，然后冷冻干燥得到菜籽粕蛋白cp5
‑
1。
[0077]
与实施案例1、2、3相比，均采用低温超微粉碎，且超微粉体粒径(d
90
)更小，但极易发生粉体聚集。
[0078]
实验方法与结果：
[0079]
实施例1/2/3,对比案例1、对比案例2。
[0080]
本实验中，菜籽饼粕采购至浙江嘉兴，其他试剂耗材为分析纯。其中对菜籽饼粕进行成分分析可知，其粗蛋白质含量约为35.21％、粗脂肪含量约为9.87％、粗纤维含量为8.73g/kg、水分含量约为8％。
[0081]
1.实验方法：
[0082]
采用激光粒度仪mastersizer 2000对菜籽饼粕微粉的粒度分布进行检测分析；
[0083]
利用场发射扫描电子显微镜su8020观察微粉的表观结构；(经低温超微粉碎处理后饼粕微粉(图2
‑
6中的第一张图片a)首先同等放大倍数(x 1000)下微粉颗粒较多，即微粉粒径分布较小，比表面积较大，同时图6中第一张图可看出粉体倾向于成团聚集，即粒径越小并不一定在反应中具有更大的比表面积；进一步放大微粉(图2
‑
6中的第二张图片b，放大倍数x3000)，可看出经低温超微粉碎的单个微粉颗粒与常规粉碎微粉相比，表面粗糙，多呈鳞片状分析，这大大增加了反应介质与微粉接触的空间，更有利于目标物质的溶出。
[0084]
显然，粉碎过程中机械易发热，而蛋白质相对是热敏感物质，采用低温超微粉碎可有效避免热对蛋白质的影响。
[0085]
采用两步酸水解法测定饼粕粉体中纤维素的含量；
[0086]
参照“gb 5009.5
‑
2016食品安全国家标准食品中蛋白质的测定”测定蛋白质提取物的蛋白质含量。
[0087]
2.实验结果
[0088]
1)不同超微粉碎工艺的菜籽饼粕超微粒径分布
[0089]
检测项目实施例1实施例2实施例3对比案例1对比案例2d
90
(um)178.194.882.5379.51477.34span5.34.14.62.1913.89
[0090]
2)不同超微粉碎工艺的菜籽饼粕超微粉体粗纤维含量的变化
[0091]
检测项目实施例1实施例2实施例3对比案例1对比案例2粗纤维含量11.5％11.13％11.08％11.7％11.03％
[0092]
3)参照gb/t 6832
‑
2018采用凯氏定氮法测定碱溶环节中蛋白质的溶出率
[0093]
检测项目实施例1实施例2实施例3对比案例1对比案例2蛋白质溶出率(％)40.53％42.74％41.98％40.41％40.38％
[0094]
从上表可以看出，超微粉碎菜籽饼粕中间体粉体粒径可以在降低碱溶环节碱溶液强度的条件下，有效保障蛋白质的溶出率；较低碱强度一方面可以节省生产投资成本，同时降低碱溶液废水的处理难度，具有较好的环保效果；因此本技术所设计的超微粉体的技术手段是在后面的碱溶环节中可以大大降低碱溶液强度，从而将现有制备所需要的12.5
‑
13.5的强碱溶液强度降低到7
‑
10，更加符合环保理念。
[0095]
以上结合具体的实施方式对本发明进行了描述，但本领域技术人员应该清楚，这些描述都是示例性的，并不是对本发明保护范围的限制。本领域技术人员可以根据本发明的精神和原理对本发明做出各种变型和修改，这些变型和修改也在本发明的范围内。