三嵌段共聚物及包括其的纳米纤维凝胶化微球的制作方法

三嵌段共聚物及包括其的纳米纤维凝胶化微球
1.相关申请的交叉引用本技术要求2019年4月12日提交的美国临时申请序列号62/833,002的权益，其内容通过引用以其整体并入本文。
2.关于联邦资助研究或开发的声明本发明是在国家卫生研究院授予的hl109054、hl114038和hl136231的政府支持下进行的。政府对本发明享有一定权利。


背景技术：

3.再生医学技术通常利用支架材料。支架材料可以起到三维(3d)模板的作用。例如，支架可以提供适当的孔和孔壁表面以促进和引导细胞附着、迁移、增殖、分化和组织再生和/或三维组织。组织再生可能是具有丢失或患病组织的患者的潜在治疗。
附图说明
4.通过参考以下详细描述和附图，本公开的实例的特征将变得显而易见，其中相似的附图标记对应于相似的但可能不相同的部件。为了简洁起见，具有先前描述的功能的附图标记或特征可以结合它们出现的其它附图来描述，或者可以不结合它们出现的其它附图来描述。
5.图1是本文所公开的三嵌段共聚物的实例的示意图；图2是说明用于制备三嵌段共聚物的方法的不同实例的流程图；图3a是纳米纤维凝胶化微球的示意图；图3b是纳米纤维凝胶化微球的纳米纤维的示意性透视图；图4是当将纳米纤维凝胶化微球暴露于预定温度时形成的实例水凝胶的示意图；图5是本文所公开的三嵌段共聚物的实例的1h nmr光谱；图6是本文所公开的三嵌段共聚物的实例的ftir光谱；图7a和图7b是描述二嵌段共聚物和本文所公开的三嵌段共聚物的实例的流体动力学尺寸(nm，y轴)对温度(℃，x轴)的图，并且还示意性描述低于和高于较低临界溶液温度(lcst)的相应的共聚物的结构；图8包括用三嵌段共聚物形成的实例微球(直径30 μm至60 μm)的黑白扫描电子显微镜(sem)显微照片，所述三嵌段共聚物具有a1
‑
c1)数均分子量为1000 g/mol的疏水嵌段，a2
‑
c2)数均分子量为2700 g/mol的疏水嵌段，和a3
‑
c3)数均分子量为11300 g/mol的疏水嵌段；图9a至图9c是由一个实例三嵌段共聚物形成的微球的黑白sem显微照片，其中不同尺寸的微球具有a)无开孔、b)一个开孔或c)多个开孔；图9d至图9f分别是图9a至图9c的微球的2d横截面荧光显微照片(原始红色，并且以黑白再现)；图10是在具有特定直径(μm，x轴)的一组微球的一侧上的孔的平均数(y轴)的图，
其中每组对于每个直径包括100个微球；图11a至图11d是用三嵌段共聚物形成的微球的2d横截面共焦荧光显微照片的黑白再现，所述三嵌段共聚物的每一个嵌段单独地且用不同的荧光单体化学染色，其中图11a说明用丙烯酰氧基乙基硫代氨基甲酰基罗丹明b染色的pnipam嵌段(原始图像为红色)，图11b说明用荧光素o
‑
丙烯酸酯染色的peg嵌段(原始图像为绿色)，图11c说明用尼罗蓝丙烯酰胺染色的plla嵌段(原始图像为蓝色)，和图11d说明三个嵌段的合并荧光显微照片；图11e至图11h分别是图11a至图11d中的一部分微球的更高放大率图像；图12a是pnipam嵌段(图11e)和plla嵌段(图11g)的合并荧光显微照片的黑白再现；图12b是peg嵌段(图11f)和plla嵌段(图11g)的合并荧光显微照片的黑白再现；图13a至图13d是用plla:peg:pnipam=68:9:23的三嵌段共聚物形成的实例微球(直径30 μm至60 μm)的sem显微照片，其中图13a是在磷酸盐缓冲盐水(pbs)中孵育之前，图13b是在孵育之后2周，图13c是在孵育之后5周，并且图13d是在孵育之后8周；图14a至图14d是用plla:peg:pnipam=68:9:23的三嵌段共聚物形成的实例微球(直径60 μm至90 μm)的sem显微照片，其中图14a是在磷酸盐缓冲盐水(pbs)中孵育之前，图14b是在孵育之后2周，图14c是在孵育之后5周，并且图14d是在孵育之后8周；图15是描述在图13a至图13d和图14a至图14d中所示的微球和对比plla微球的微球重量损失(%，y轴)对降解时间(以周计)；图16a是用5% w/v水性悬浮液形成的水凝胶的2d横截面共焦荧光显微照片的黑白再现，所述水性悬浮液包括由plla:peg:pnipam=68:9:23的三嵌段共聚物形成的微球(直径60 μm至90 μm)；图16b是图16a的水凝胶内的微球之间的交联的示意图；图17是原始彩色照片的黑白表示，其证明用5% w/v水性悬浮液形成的水凝胶的稳定性，所述水性悬浮液包括由plla:peg:pnipam=68:9:23的三嵌段共聚物形成的微球(直径60 μm至90 μm)，在几个不同的时间段内，其中插图是在25小时后水凝胶中微球的交联的示意图；图18a至图18c是描述储能模量(g’)和损耗模量(g
’’
) (都以pa计，y轴)对温度(℃，x轴)的图：图18a
‑
10% w/v包括plla:peg:pnipam=68:9:23微球(tbc11，参见表3)的水性悬浮液，图18b
‑
10% w/v包括plla:peg:pnipam=84:5:11微球(tbc6，参见表3)的水性悬浮液，和图18c
‑
10% w/v包括plla:peg:pnipam=88:4:8微球(tbc7，参见表3)的水性悬浮液；图19是描述在增加的应力(以pa计，x轴)下，在37℃下10% w/v包括plla:peg:pnipam=68:9:23微球的水性悬浮液的储能模量(g’)和损耗模量(g”) (都以pa计，左y轴)以及损耗模量与储能模量之间的比率(tan(δ)=g
’’
/g’，右y轴)的图；图20是描述在37℃下和在增加的频率(rad/s，x轴)下对于以下的储能模量(g’)和损耗模量(g”) (都以pa计，y轴)的图：a
‑
10% w/v包括plla:peg:pnipam=68:9:23微球(tbc11，参见表3)的水性悬浮液，b
‑
10% w/v包括plla:peg:pnipam=84:5:11微球(tbc6，参见表3)的水性悬浮液，和c
‑
10% w/v包括plla:peg:pnipam=88:4:8微球(tbc7，参见表3)的水性悬浮液；图21是描述在0.1 pa的恒定应力下和在增加的频率(rad/s，x轴)下对于以下的储
能模量(g’)和损耗模量(g
’’
) (都以pa计，y轴)的图： 5% w/v包括plla:peg:pnipam=68:9:23微球(tbc11，参见表3)的水性悬浮液和10% w/v包括plla:peg:pnipam=68:9:23微球(tbc11，参见表3)的水性悬浮液，；图22是描述plla的数均分子量(mn) (g/mol，y轴)对引发剂(hema)与l
‑
丙交酯的比率的图，包括所形成的微球的sem图像；图23是pnipam重量% (x轴)对peg重量% (y轴)对plla重量%的图，其说明对于纳米纤维形成的最小plla重量%；图24是peg重量% (x轴)对pnipam重量% (y轴)对plla重量%的图，其说明对于凝胶形成的最小peg重量%；图25是pnipam重量% (x轴)对peg重量% (y轴)对plla重量%的图，其说明对于凝胶形成的最小pnipam重量%；图26a至图26c是共焦激光显微镜图像的黑白表示，说明保留在plla:peg:pnipam=68:9:23 (tbc11)微球的水凝胶中的心肌细胞；图27a和图27b是共焦激光显微镜图像的黑白表示，说明在用仅心肌细胞(cm) (图27a)和用cm加tbc11微球(图27b)治疗的组的梗塞大鼠心脏中通过人特异性抗原(hu
‑
mito)染色的心肌细胞(cm)移植；图28是描述用仅心肌细胞(“仅cm”)和用心肌细胞加tbc11微球(“cm nf
‑
gms”) (n=9，**，p<0.01，与cm组比较)治疗的组的移植大小(mm3)的图；图29a至图29f是共焦激光显微镜图像的黑白表示，通过在梗塞大鼠心脏中针对ctnt的免疫荧光染色和抗hu
‑
mito染色(图29a至图29c)说明心肌细胞(cm)移植，并说明在宿主和移植细胞之间(箭头，图29f)和在移植细胞之间形成丰富的间隙连接(图29d至图29f)，如连接蛋白43染色所指示的；图30说明用pbs (“pbs”)、仅心肌细胞(“仅cm”)、仅tbc11微球(“nf
‑
gms”)或cm tbc11微球(“cm nf
‑
gms”)治疗28天后，梗塞大鼠心脏的远区和边界区中血管样内腔的共焦激光显微镜图像的黑白再现，并用内皮细胞标记物cd31染色，原始红色指示血管内腔表面上的cd31阳性内皮细胞；图31a和图31b是描述在用pbs (“pbs”)、仅心肌细胞 (“仅cm”)、仅tbc11微球(“nf
‑
gms”)或cm tbc11微球(“cm nf
‑
gms”) (n=9，**，p < 0.01，与pbs组比较；##，p < 0.01，与cm组比较)治疗的梗塞大鼠心脏的远区和边界区中血管样内腔的定量的图；图32说明使用masson三色染色，用pbs (“pbs”)、仅心肌细胞(“仅cm”)、仅tbc11微球(“nf
‑
gms”)或cm tbc11微球(“cm nf
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gms”)治疗28天后的梗塞大鼠心脏；图33是用pbs (“pbs”)、仅心肌细胞(“仅cm”)、仅tbc11微球(“nf
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gms”)或cm tbc11微球(“cm nf
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gms”)治疗28天后，梗塞大鼠心脏的梗塞大小(%)的图；图34a和图34b分别是用pbs (“pbs”)、仅心肌细胞(“仅cm”)、仅tbc11微球(“nf
‑
gms”)或cm tbc11微球(“cm nf
‑
gms”)治疗28天后梗塞大鼠心脏的左心室射血分数(ef，%)和缩短分数(fs，%)的图；图35描述在两端具有附着的相同的官能团的亲水性聚合物与试剂的反应以在一端引入不同的官能团；和图36描述在图2中的实例方法100c期间发生的反应的实例。
具体实施方式
6.已经开发许多支架用于药物递送和/或组织再生。虽然支架可以具有许多不同的特性，可能特别期望支架是纳米纤维的、可注射的并且能够自组装。纳米纤维支架可能是期望的，因为它们模拟天然的细胞外基质。可注射的支架可能是期望的，因为它们可以容易地操纵并且涉及对患者的最小侵入性程序。自组装支架可能是期望的，因为它们可以在体内形成宏观三维结构，并因此可以容易地填充缺陷和/或伤口。虽然这些特定特性中的每一个在单个支架中可能是期望的，但是实现支架产生过程中涉及的特定特性和/或竞争性要求的聚合物的竞争性特性(例如，极性)使其难以产生表现出所有这些特性的支架。
7.本文公开了三嵌段共聚物，其克服了这些竞争性要求。三嵌段共聚物包括三个嵌段，每个嵌段具有特定的官能度并且位于沿着共聚物链的特定位置。三嵌段共聚物可以用于产生为纳米纤维的、可注射的、并且能够在体内形成稳定水凝胶的微球。三个嵌段中的第一个是疏水嵌段，其有助于形成纳米纤维。因此，微球表现出模拟天然的细胞外基质(ecm)(并且特别是ecm纤维状蛋白)的构造和结构特性。三个嵌段中的第二个是亲水嵌段，其赋予亲水性。纳米纤维微球的亲水性使得它们能够在室温下(例如，约18℃至约25℃)存在于自由流动的水性悬浮液中，这进而使得它们能够被注入缺陷和伤口中，包括不规则形状的那些。注射是最小侵入性过程。三个模嵌段中的第三个是温度响应性嵌段。温度响应性嵌段使得纳米纤维微球能够经历热响应性可逆疏水性相互作用(例如，交联)，这导致三维的、几何上稳定的水凝胶的自组装。这种凝胶化性质模拟细胞外蛋白聚糖或多糖。在本文所公开的实例中，已经发现嵌段的比率、嵌段的长度和嵌段沿链的位置导致足够的聚合物链规则性以用于纳米纤维形成、保留所需量的水以及形成足够的物理交联以用于水凝胶构造。
8.如所述的，三嵌段共聚物和包括三嵌段共聚物的纳米纤维微球是热响应性的，并且可以经历从更亲水状态到更疏水状态或从可溶状态到不可溶状态的转变。在这种转变期间(其可以在体内注射后发生)，至少一部分三嵌段共聚物形成物理交联，导致形成水凝胶。水凝胶可以在体内保持其三维(3d)几何形状。这些特性有助于水凝胶在体内保持在其预期的位置，这与在自由流动液体中的其它可注射的支架不同，所述其它可注射的支架不能保持其3d几何形状，并因此倾向于从注射部位迁移离开。当水凝胶停留在其预期的位置时，其可以帮助保留(在预期的位置)用纳米纤维微球注射的任何细胞和/或其它生物功能分子，并且可以使再生组织与预期的宿主组织整合。
9.因此，本文所公开的三嵌段共聚物可以特别适用于制备纳米纤维微球，并且纳米纤维微球可以特别适于组织工程。特别地，本文所公开的实例能够实现细胞的最小侵入性递送，增强细胞迁移和整合，并且提供期望的再生环境。纳米纤维微球也可以用于多种其它应用，包括药物递送、组织膨胀、粘合剂、化妆品、伤口敷料、外科敷料和其它生物医学应用。在有机溶剂中为温度响应性的纳米纤维微球的实例可以适用于工业应用。
10.三嵌段共聚物现在参考图1，三嵌段共聚物10的实例包括由疏水性纳米纤维形成聚合物12’组成的第一末端嵌段12，其中第一末端嵌段12以约10%至约89%范围内的重量百分比存在于三嵌段共聚物10中；附着于第一末端嵌段12的中间嵌段14，中间嵌段14由亲水性聚合物14
’ꢀ
组成，其中中间嵌段14以约1%至约89%范围内的重量百分比存在于三嵌段共聚物10中；和附着于中间嵌段14的第二末端嵌段16，第二末端嵌段16由温度响应性聚合物16’组成，其中第二
末端嵌段16以约1%至约89%范围内的重量百分比存在于三嵌段共聚物10中。
11.第一末端嵌段12由疏水性纳米纤维形成聚合物12’组成。疏水性纳米纤维形成聚合物12’的实例选自聚(l
‑
乳酸) (plla)、聚(丙交酯
‑
共
‑
乙交酯) (plga)、聚乙交酯、聚酸酐、聚(原醚)、聚己内酯、聚(羟基丁酸酯)、聚(磷酸酯)、聚(癸二酸甘油酯)、聚(富马酸丙二醇酯)、聚磷腈、聚碳酸酯、聚氨酯、非水溶性胶原、非水溶性明胶、非水溶性弹性蛋白及其共聚物。
12.在本文所公开的实例中，已经发现疏水性纳米纤维形成聚合物12’的分子量(并且特别是数均分子量(mn，以g/mol或道尔顿计))对三嵌段共聚物10产生纳米纤维的能力有作用。因此，疏水性纳米纤维形成聚合物12’的数均分子量等于或高于纳米纤维形成阈值分子量。对于本文所述的疏水性纳米纤维形成聚合物的每个实例，纳米纤维形成阈值分子量可以与不同。在一个实例中，疏水性纳米纤维形成聚合物是聚(l
‑
乳酸)并且数均分子量(mn)为至少5,500 g/mol。在另一个实例中，疏水性纳米纤维形成聚合物是聚(丙交酯
‑
共
‑
乙交酯)并且数均分子量(mn)为至少1,000 g/mol。
13.中间嵌段14由亲水性聚合物14’组成。亲水性聚合物14’的实例选自聚(乙二醇) (或聚氧乙烯)、聚(乙烯醇)、聚(甲基丙烯酸2
‑
羟乙酯)、聚乙烯吡咯烷酮、藻酸盐、胶原、明胶、透明质酸、淀粉、糖原、纤维素、角叉菜胶、葡聚糖、甲壳质、壳聚糖、果胶、肝素、硫酸乙酰肝素、聚(丙烯酸)、聚(丙烯酰胺)、聚(n,n'
‑
亚甲基双丙烯酰胺)、聚乙烯基甲基醚及其共聚物。
14.可以容易地操纵亲水嵌段以具有两个不同的端基，其中一个端基可以附着于第一末端嵌段12，并且另一个端基可以附着于第二末端嵌段16。改变水溶性聚合物的端基可能是期望的，以避免使用有机溶剂。这一特性使得中间嵌段14特别需要亲水嵌段。此外，亲水嵌段有助于三嵌段共聚物10的水结合能力和水凝胶形成能力。
15.第二末端嵌段16由温度响应性聚合物16’组成。温度响应性聚合物16’的选择将部分取决于其中期望发生从亲水性到疏水性转变的环境和待递送到该环境的悬浮液中所用的液体载体。在一个实例中，当暴露于预定温度时，温度响应性聚合物16’在水中可以从亲水状态切换至更疏水状态；和温度响应性聚合物16’选自聚(n
‑
异丙基丙烯酰胺)、聚[甲基丙烯酸2
‑
(二甲基氨基)乙酯]、羟丙基纤维素、聚(乙烯基己内酰胺)和聚乙烯基甲基醚。在另一个实例中，当暴露于预定温度时，温度响应性聚合物16’在有机溶剂中可以从可溶状态切换至不可溶状态；和温度响应性聚合物16’选自聚苯乙烯、聚乙烯、聚甲基丙烯酸甲酯和聚丙烯。
[0016]
将温度响应性聚合物16’定位在三嵌段共聚物的另一末端使得温度响应性聚合物位于所形成的纳米纤维凝胶化微球18的最外部(参见图3)。因此，纳米纤维凝胶化微球18中的温度响应性聚合物16’容易地可用于与其它纳米纤维凝胶化微球18中的其它温度响应性聚合物交联。
[0017]
应当理解，嵌段12、14、16中的每一个包括不同类型的聚合物。因此，如果选择聚乙烯基甲基醚作为中间嵌段14，则选择不同的聚合物用于第二末端嵌段16。
[0018]
在本文所公开的三嵌段共聚物10的实例中，应当理解，嵌段12、14、16不沿着共聚物链重复。在一些实例中，三嵌段共聚物10为线性共聚物，并且在其它实例中，三嵌段共聚物10为支化共聚物。链的结构将取决于在相应的嵌段12、14、16中使用的聚合物12’、14’、
16’。
[0019]
在本文所公开的实例中，每个嵌段12、14、16代表共聚物10的总重量的一定百分比。选择重量百分比使得所得三嵌段共聚物10能够形成纳米纤维，具有高亲水性，并且当暴露于预定温度时还能够形成疏水交联。通常，三嵌段共聚物10包括约10重量%至约89重量%的第一末端嵌段12；约1重量%至约89重量%的中间嵌段14；和约1重量%至约89重量%的第二末端嵌段16，各自相对于三嵌段共聚物10的总重量。在另一个实例中，三嵌段共聚物10包括约30重量%至约70重量%的第一末端嵌段12；约3重量%至约56重量%的中间嵌段14；和约5重量%至约65重量%的第二末端嵌段16，各自相对于三嵌段共聚物10的总重量。在再另一个实例中，三嵌段共聚物10包括约50重量%至约89重量%的第一末端嵌段12；约5重量%至约40重量%的中间嵌段14；和约10重量%至约45重量%的第二末端嵌段16，各自相对于三嵌段共聚物10的总重量。
[0020]
在三嵌段共聚物10的实例中，第一末端嵌段12(以及因此疏水性纳米纤维形成聚合物12’)是三嵌段共聚物10的主要组分，因为其以比中间嵌段14或第二末端嵌段16更高的重量百分比存在。
[0021]
重量百分比将取决于所使用的特定聚合物12’、14’、16’。 在一个实例中，疏水性纳米纤维形成聚合物12’是聚(l
‑
乳酸)并且至少68重量%的三嵌段共聚物10是第一末端嵌段12；亲水性聚合物14
’ꢀ
是聚(乙二醇)并且至少5重量%的三嵌段共聚物是中间嵌段14；和温度响应性聚合物16是聚(n
‑
异丙基丙烯酰胺)并且至少11重量%的三嵌段共聚物10是第二末端嵌段16。以下是具有这些特定聚合物12’、14’、16’的三嵌段共聚物10的更具体的实例：i)第一末端嵌段12以68重量%的量存在，中间嵌段14以9重量%的量存在，并且第二末端嵌段16以23重量%的量存在；ii)第一末端嵌段12以80重量%的量存在，中间嵌段14以9重量%的量存在，并且第二末端嵌段16以11重量%的量存在；和iii)第一末端嵌段12以84重量%的量存在，中间嵌段14以5重量%的量存在，并且第二末端嵌段16以11重量%的量存在。
[0022]
三嵌段共聚物10可以通过将末端嵌段12、16附着在中间嵌段14的相对末端处的任何合适的方法合成。在图2中描述不同的实例方法。第一实例方法的变化以附图标记100a、100b和100c显示，并且包括在框104、106和108中显示的过程。第二实例方法的变化以附图标记102a、102b和102c显示，并且包括在框104、110和11中显示的过程。
[0023]
第一实例方法100a、100b、100c涉及合成亲水性聚合物14’，然后在亲水性聚合物14’存在下使单体聚合以形成附着于亲水性聚合物14’的其它聚合物12’和16’。在实例中，第一实例方法100a、100b、100c包括合成具有两个不同官能端基的不对称亲水性聚合物，从而形成三嵌段共聚物10的中间嵌段14 (附图标记104)；使用两个不同官能端基的第一官能端基使疏水性单体聚合，从而形成附着于中间嵌段14的三嵌段共聚物10的第一末端嵌段12 (附图标记106)；和使用两个不同官能端基的第二官能端基使温度响应性单体聚合，从而形成附着于中间嵌段14的三嵌段共聚物的第二末端嵌段16 (附图标记108)。如在图2中一些箭头所指定的，疏水性单体的聚合(附图标记106)在温度响应性单体的聚合(附图标记108)之前(在方法100a中)、同时(在方法100b中)或之后(在方法100c中)发生。
[0024]
现在将描述具有两个不同官能端基的不对称亲水性聚合物的合成(附图标记104)。在实例中，亲水性聚合物可以与将附着于亲水性聚合物的一端的试剂反应。在实例中，亲水性聚合物与试剂的比率为1:1。亲水性聚合物可以具有附着在两端的相同的官能
团，并且与亲水性聚合物反应的试剂可以引入不同的官能团。该反应的实例在以下图35中显示，其中亲水性聚合物是无水聚(乙二醇) (其中n在约4至约800的范围内)并且试剂是2
‑
溴异丁酰溴。
[0025]
如在图35中所示的方案中的产物所描述的，这产生在一端具有羟基(
‑
oh)基团并且在另一端具有溴(
‑
br)官能团的不对称聚(乙二醇)聚合物。在图35中所示的反应可以在四氢呋喃(thf)和三乙胺(tea)存在下，用等摩尔量的peg和试剂发生。在另一个实例中，亲水性聚合物是聚(甲基丙烯酸2
‑
羟乙酯)，并且试剂是2
‑
溴异丁酰溴，其产生甲基丙烯酸2
‑
(2
‑
溴异丁酰氧基)乙酯。所得不对称亲水性聚合物是双官能和正交引发剂。不对称亲水性聚合物是双官能的，因为每个末端官能团可以反应，并且是正交的，因为在末端官能团处的相应的反应不相互干扰。在一个实例中，官能团之一(例如羟基)引发疏水性单体的开环聚合(rop)，而另一个官能团(例如溴基团)引发温度响应性单体的原子转移自由基聚合(atrp)。可以引发rop的其它官能团包括胺基(
‑
nh2)或羧基(
‑
cooh)。例如，琥珀酸和丙二酸可以用于将亲水性聚合物的
‑
oh基团转化为
‑
cooh基团；或者丙氨酸可以用于将亲水性聚合物的
‑
oh基团转化为
‑
nh2基团。
[0026]
应当理解，不对称亲水性聚合物也可以是可商购获得的产品(例如，甲基丙烯酸2
‑
(2
‑
溴异丁酰氧基)乙酯)，并因此可以不进行在附图标记104处的合成步骤。相反，方法100a、100b、100c可以涉及提供合适的不对称亲水性聚合物。
[0027]
一旦获得不对称亲水性聚合物，就可以进行方法100a、100b或100c的任何变化。
[0028]
在这些实例的任一个中，疏水性单体(用于步骤106中)可以是l
‑
丙交酯、乙交酯、酸酐单体、己内酯、磷酸酯单体、磷腈单体、碳酸酯单体或氨基甲酸酯单体。同样在这些实例的任何一个中，温度响应性单体(用于步骤108中)可以是n
‑
异丙基丙烯酰胺、甲基丙烯酸2
‑
(二甲基氨基)乙酯、n
‑
乙烯基己内酰胺、甲基乙烯基醚、苯乙烯、乙烯、甲基丙烯酸甲酯或丙烯。
[0029]
在方法100a中，在不对称亲水性聚合物存在下，疏水性单体聚合，以形成附着于两个不同官能端基之一的第一末端嵌段12 (附图标记106)，然后在不对称亲水性聚合物(具有与之附着的第一末端嵌段12)存在下，温度响应性单体聚合，以形成附着于两个不同官能端基的另一个的第二末端嵌段16 (附图标记108)。在方法100a的一个实例中，不对称聚(乙二醇)聚合物(来自图35)可以与疏水性单体(例如l
‑
丙交酯)反应。不对称peg聚合物充当l
‑
丙交酯的开环聚合的引发剂，其聚合并附着于羟基。然后，该共聚物可以与温度响应性单体(例如n
‑
异丙基丙烯酰胺)反应。不对称peg亲水性聚合物还充当n
‑
异丙基丙烯酰胺的原子转移自由基聚合的引发剂，n
‑
异丙基丙烯酰胺聚合并附着于溴基团。
[0030]
在方法100b中，在不对称亲水性聚合物存在下，疏水性单体和温度响应性单体同时但分别聚合，以形成附着于两个不同官能端基之一的第一末端嵌段12 (附图标记106)和附着于两个不同官能端基的另一个的第二末端嵌段16 (附图标记108)。
[0031]
在方法100c中，在不对称亲水性聚合物存在下，温度响应性单体聚合，以形成附着于两个不同官能端基之一的第二末端嵌段16 (附图标记108)，然后在不对称亲水性聚合物(具有与之附着的第二末端嵌段12)存在下，疏水性单体聚合，以形成附着于两个不同官能端基的另一个的第一末端嵌段12 (附图标记106)。方法100c的一个实例示于图36中。
[0032]
在图36中，不对称聚(乙二醇)聚合物(来自图35)首先与温度响应性单体(例如，n
‑
异丙基丙烯酰胺)反应，以形成羟基封端的二嵌段共聚物(图36中标记为1)，并且然后羟基封端的二嵌段共聚物1与疏水性单体(例如，l
‑
丙交酯)反应，以形成本文所公开的三嵌段共聚物10的实例(在图36中标记为2)。n
‑
异丙基丙烯酰胺单体的atrp由不对称聚(乙二醇)聚合物(来自图35)的溴基团引发，其形成二嵌段共聚物1。该反应可以在具有氯化铜(cucl)和三
‑
[2
‑
(二甲基氨基)乙基]胺(me6)的水/乙醇混合物中发生。l
‑
丙交酯的rop由二嵌段共聚物1的羟基端基引发，以形成三嵌段共聚物的实例(在图36中标记为共聚物2)。该反应可以在四氢呋喃(thf)中与2
‑
乙基己酸亚锡(sn(oct)2)在约80℃下进行。
[0033]
在实例方法100a、100b、100c的任一种中，使足量的疏水性单体聚合，以形成数均分子量等于或高于纳米纤维形成阈值分子量的第一末端嵌段12。
[0034]
在图2中所示的第二实例方法102a、102b、102c涉及合成亲水性聚合物14’，然后将其它聚合物12’和16’共轭到亲水性聚合物14’的相对末端。在实例中，第二实例方法102a、102b、102c包括合成具有两个不同官能端基的不对称亲水性聚合物，从而形成三嵌段共聚物10的中间嵌段14 (附图标记104)；通过两个不同官能端基的第一官能端基将第一末端嵌段12共轭到中间嵌段14，该第一末端嵌段包括疏水性纳米纤维形成聚合物12
’ꢀ
(附图标记110)；和通过两个不同官能端基的第二官能端基将第二末端嵌段16共轭到中间嵌段14，该第二末端嵌段16包括温度响应性聚合物16
’ꢀ
(附图标记112)。如在图2中一些箭头指定的，第一末端嵌段14的共轭(附图标记110)发生在第二末端嵌段16的共轭(附图标记108)之前(在方法102a中)、同时(在方法102b中)或之后(在方法102c中)。
[0035]
在方法102a、102b和102c中，具有两个不同官能端基的不对称亲水性聚合物的合成(附图标记104)可以如本文所述的进行。一旦获得不对称亲水性聚合物，就可以进行方法102a、102b或102c的任何变化。
[0036]
在方法102a中，疏水性纳米纤维形成聚合物12’通过两个不同官能端基之一共轭到不对称亲水性聚合物(附图标记110)，然后温度响应性聚合物16’共轭到不对称亲水性聚合物(具有与之附着的第一末端嵌段12)，以形成附着于两个不同官能端基的另一个的第二末端嵌段16 (附图标记112)。在方法100a的一个实例中，不对称聚(乙二醇)聚合物(来自图35)可以共轭到疏水性聚合物(例如聚(l
‑
乳酸))。然后，该共聚物可以与温度响应性聚合物(例如聚(n
‑
异丙基丙烯酰胺))反应。
[0037]
在方法102b中，疏水性纳米纤维形成聚合物12’和温度响应性聚合物16’同时且分别共轭到不对称亲水性聚合物，以形成附着于两个不同官能端基之一的第一末端嵌段12 (附图标记110)和附着于两个不同官能端基的另一个的第二末端嵌段16 (附图标记112)。
[0038]
在方法102c中，温度响应性聚合物16’共轭到不对称亲水性聚合物，以形成附着于两个不同官能端基之一的第二末端嵌段16 (附图标记112)，然后疏水性纳米纤维形成聚合物12’共轭到不对称亲水性聚合物(具有与之附着的第二末端嵌段12)，以形成附着于两个不同官能端基的另一个的第一末端嵌段12 (附图标记110)。
[0039]
在实例方法102a、102b、102c的任一种中，在形成三嵌段共聚物10之前合成疏水性纳米纤维形成聚合物12’。实例方法102a、102b、102c的任一种可以进一步包括使疏水性单体聚合以形成疏水性纳米纤维形成聚合物12’和/或使温度响应性单体聚合以形成温度响应性聚合物16’。在一个具体实例中，方法102a、102b或102c包括使足量的疏水性单体聚合，以形成数均分子量等于或高于纳米纤维形成阈值分子量的疏水性纳米纤维形成聚合物
12’。
[0040]
纳米纤维凝胶化微球三嵌段共聚物10可以用于形成纳米纤维凝胶化微球。纳米纤维凝胶化微球的实例包括：三嵌段共聚物10的互连的纳米纤维(包括疏水性纳米纤维形成聚合物12’的第一末端嵌段12，其中第一末端嵌段12以约10%至约89%范围内的重量百分比存在于三嵌段共聚物10中；附着于第一末端嵌段12的中间嵌段14，由亲水性聚合物14’组成的中间嵌段14，其中中间嵌段14以约1%至约89%范围内的重量百分比存在于三嵌段共聚物10中；和附着于中间嵌段14的第二末端嵌段16，第二末端嵌段16由温度响应性聚合物16’组成，其中第二末端嵌段16以约1%至约89%范围内的重量百分比存在于三嵌段共聚物10中；和在互连的纳米纤维之间形成的空间，其中纳米纤维凝胶化微球在第一温度下可悬浮于液体中，并且在高于第一温度的第二温度下在液体中形成水凝胶。
[0041]
纳米纤维凝胶化微球18的实例示于图3a中，并且一个纳米纤维20的实例示意性地示于图3b中。纳米纤维凝胶化微球18的纳米纤维20可以具有芯
‑
冠类型的结构，其中第一末端嵌段12 (包括疏水性纳米纤维形成聚合物12’)形成纤维(芯)，并且中间嵌段14 (包括亲水性聚合物14’)和第二末端嵌段16形成纤维的最外层(冠)。
[0042]
每个纳米纤维20的直径在约1 nm至约1000 nm范围内。纳米纤维20的长度可以是纳米级的或者可以更大。纳米纤维20之间的空间的直径可以小于2 μm。
[0043]
纳米纤维凝胶化微球18的整个结构的直径d在约5 μm至约1000 μm范围内。
[0044]
纳米纤维凝胶化微球18的一些实例可以是单级多孔结构，其中纳米纤维20之间的空间是微球18的唯一孔。换句话说，纳米纤维凝胶化微球18的这些实例不包括任何其它更大的开口。纳米纤维凝胶化微球18的其它实例可以是具有至少一个大于纳米纤维20之间的空间的开口的多级多孔结构。在一个实例中，纳米纤维凝胶化微球18包括由纳米纤维20构成的壳围绕的单个中空芯。在另一个实例中，纳米纤维凝胶化微球18包括规则的球形宏观尺度的孔(直径在约100 μm至约500 μm范围内)、约100 μm的微观尺度孔间开口(即，将一个宏观尺度的孔与另一个宏观尺度的孔连接的开口)和纳米纤维20之间的空间(直径小于5 μm)。
[0045]
为了形成纳米纤维凝胶化微球18，可以将三嵌段共聚物10暴露于一系列自组装过程。一个实例方法包括通过溶解三嵌段共聚物以形成溶液，引起三嵌段共聚物10自组装成纳米纤维凝胶化微球18；乳化溶液以形成液体微球；和诱导液体微球的相分离。
[0046]
在该实例中，首先将三嵌段共聚物10溶解在合适的溶剂中以形成共聚物溶液。溶剂的实例包括四氢呋喃(thf)、二甲基甲酰胺(dmf)、吡啶、thf
‑
甲醇混合物、二氧六环
‑
甲醇混合物、二氧六环
‑
水混合物、二氧六环
‑
丙酮混合物或二氧六环
‑
吡啶混合物。溶剂可以根据三嵌段共聚物10的嵌段12、14、16而变化。在一个实例中，三嵌段共聚物10可以以约0.5% (w/v)至约15% (w/v)范围的浓度溶解于溶剂中。在另一个实例中，三嵌段共聚物10可以以约1% (w/v)至约5% (w/v)范围的浓度溶解于溶剂中。在实例中，将三嵌段共聚物10以约2% (w/v)的浓度溶解于溶剂中。
[0047]
然后将共聚物溶液乳化成液体微球。在实例中，将甘油快速加入到共聚物溶液中。当加入甘油时，搅拌混合物(例如，使用磁力搅拌棒或机械搅拌器)。在另一个实例中，将共聚物溶液加入到甘油中。当加入共聚物溶液时，搅拌混合物。混合物的温度可以在约20℃至
约100℃的范围内。在实例中，混合物的温度可以保持在约50℃。共聚物溶液快速(例如，在几秒内)乳化成共聚物溶液液滴，但是不存在相转化。
[0048]
然后诱导相分离以形成纳米纤维结构。相分离可以通过将共聚物乳液倒入液氮中来诱导。相分离是热力学过程，其中均匀多组分系统倾向于自组装成多相以降低系统自由能。对于共聚物溶液，在自组装期间将形成富含共聚物的相和贫共聚物的相，其中前者固化成共聚物骨架，并且后者在溶剂萃取期间变成空隙空间。因此，相分离形成微球的共聚物骨架，以及包括甘油和溶剂的液相。从共聚物骨架中提取甘油和溶剂(例如，通过用水洗涤)，并形成微球。共聚物和溶剂的类型以及溶液浓度和溶剂萃取方法都在相分离期间的结构形成中起作用。如在实施例部分中说明的，某些共聚物将形成纳米纤维，而其它共聚物将聚集在一起。
[0049]
可以将形成的微球冷冻干燥。
[0050]
纳米纤维凝胶化微球的用途本文所公开的纳米纤维凝胶化微球18可以特别适于体内生物医学应用，例如组织工程、药物递送等。
[0051]
纳米纤维凝胶化微球18可以悬浮在温度低于体温(低于36℃)的液体载体中。在一些实例中，液体载体并因此悬浮液处于约18℃至约35℃，或约18℃至约25℃范围的温度。当悬浮液保持低于体温时，微球18保持其纳米纤维结构。当处于悬浮液中时，纳米纤维凝胶化微球18可以容易地皮下注射。
[0052]
所使用的液体载体可以取决于三嵌段共聚物10的第二末端嵌段16中的温度响应性聚合物16’，并且还可以取决于悬浮液待注入其中的环境。当温度响应性聚合物16’在水中是热响应性时，液体载体可以是单独的水，或者是包括有机或无机溶质、缓冲液、组织培养基或体液的水(水性)基溶液。有机或无机溶质的实例包括盐(例如氯化钠、氯化钙、磷酸钙、硫酸钙等)、糖、多糖、肽、蛋白质、核糖核酸(rna)、脱氧核糖核酸(dna)等。缓冲液溶液的一个实例是磷酸盐缓冲盐水。当温度响应性聚合物16’在有机溶剂中是热响应的时，液体载体可以是单独的有机溶剂，或者是包括水、缓冲液、组织培养基或体液的有机基溶液。
[0053]
在一些实例中，悬浮液可以包括液体载体、多个纳米纤维凝胶化微球18和多个细胞或生物功能分子，所述细胞或生物功能分子附着于多个纳米纤维凝胶化微球18中的至少一些或与多个纳米纤维凝胶化微球18在液体载体中混合。在实例中，悬浮液包括约1:1至约1:1000范围内的纳米纤维凝胶化微球18与细胞的数量比。任何细胞或生物功能分子可以附着于纳米纤维凝胶化微球18或在液体载体中混合。实例细胞包括组织特异性细胞，例如心肌细胞、平滑肌细胞、骨骼肌细胞、内皮细胞、成骨细胞、软骨细胞、髓核细胞、成纤维细胞、肝细胞、神经元、血液细胞、免疫细胞、生殖细胞等及其祖细胞、成人干细胞、胚胎干细胞、诱导的多能干细胞等。合适的生物功能分子的实例包括趋化因子配体2、趋化因子配体7、白介素4、白介素13、转化生长因子
‑
β(tgf
‑
β)、成纤维细胞生长因子(fgf)、vegf、血小板衍生的生长因子(pdgf)、甲状旁腺激素(pth)、化学引诱物、骨形态发生蛋白(bmp)、其衍生物及其组合。
[0054]
当细胞或生物功能分子附着于纳米纤维凝胶化微球18时，可以使用任何合适的接种方法。接种方法可以涉及滴加、混合、化学反应、物理附着等。
[0055]
当细胞或生物功能分子在液体载体中混合时，它们保持与纳米纤维凝胶化微球18
不附着，并且可以至少部分地被水凝胶包封，所述水凝胶在纳米纤维凝胶化微球18暴露于三嵌段共聚物10对其热响应的温度时形成。
[0056]
利用纳米纤维凝胶化微球18的治疗方法可以包括在低于体温的温度下将纳米纤维凝胶化微球18引入水性溶液中，从而形成悬浮液；将该悬浮液注入心脏、骨、平滑肌、血管、心脏瓣膜、心肌、骨骼肌、膀胱、腱、韧带、皮肤、脂肪、软骨、椎间盘、乳房、肝、肠、食道、气管、肺或神经。可以使用纳米纤维凝胶化微球18和液体载体的任何实例，并且在一些情况下，细胞和/或生物功能分子也可以包括在注射的悬浮液中。当温度响应性嵌段16在有机溶剂中响应时，水性溶液可以用合适的有机溶剂代替。
[0057]
一个具体的实例治疗方法是用于使梗塞心脏再生。该实例方法包括在低于体温的温度下将纳米纤维凝胶化微球18引入缓冲液溶液中，从而形成悬浮液，其中多个细胞包括心肌细胞；和将悬浮液注入梗塞心脏。
[0058]
可以将悬浮液皮下注入所需区域。注射可以使用注射器或另一个合适的工具进行。
[0059]
一旦注射，悬浮液就暴露于体温，体温通常在约36.5℃至约37.5℃范围内，但在一些情况下可能更高。升高的温度引起纳米纤维凝胶化微球18的温度响应性嵌段16经历亲水性到疏水性转变以形成物理交联。这些交联在图4中在附图标记24处显示，其描述交联在一起的几个纳米纤维凝胶化微球18。亲水性到疏水性转变和所得交联24形成水凝胶22。如在图4中示意性所示，单独的纳米纤维凝胶化微球18保持其微观3d几何形状以及其纳米纤维构造。
[0060]
为了进一步说明本公开，本文给出了实施例。应当理解，这些实施例是为了说明的目的而提供的，并且不应被解释为限制本公开的范围。
实施例
[0061]
实施例1三嵌段共聚物的合成在四氢呋喃(thf)和三乙胺(et3n)存在下，使用溴异丁酰溴(bibb)与等摩尔量的无水ho
‑
peg
‑
oh反应合成不对称亲水性聚合物(ahp) br
‑
peg
‑
oh。更具体地说，将干燥的四氢呋喃(thf) (25 ml)、干燥的聚乙二醇(peg) (6.68 mmol)和干燥的三乙胺(tea) (20 mmol，1.5 ml)放置在250 ml圆底烧瓶中，并保持在氮气氛下。在1小时内，通过滴液漏斗缓慢加入溴异丁酰溴(bibb) (6.68 mmol，0.83 ml)。在加入完成之后，将混合物在室温下搅拌过夜。滤出沉淀的盐，并将滤液真空蒸发。然后，加入1 m盐酸(hcl) (30 ml)，并且混合物用二氯甲烷(3
×
20 ml)萃取。合并的有机层用水(50 ml)洗涤三次以去除盐。有机层经无水na2so4干燥过夜。去除溶剂后，将聚合物沉淀到冷乙醚中并通过过滤收集。将所得白色粉末真空干燥24小时，以得到ho
‑
peg
‑
br。
[0062]
通过br
‑
peg
‑
oh与n
‑
异丙基丙烯酰胺反应制备羟基封端的二嵌段共聚物(ho
‑
peg
‑
pnipam)。br
‑
peg
‑
oh的溴端基引发n
‑
异丙基丙烯酰胺单体的原子转移自由基聚合。在氮气保护下，将peg大分子引发剂(br
‑
peg
‑
oh，mn=1551) (0.6 mmol，1 g)、nipam (26.5 mmol，3 g)和cucl (0.170 mmol，0.016.8 g)放置在250 ml圆底烧瓶中，并用橡胶隔膜塞子密封。将milli
‑
q水(20 ml)和me6tren (0.174 mmol，0.04g)放置在schlenk管中，并用n2气体吹扫约
40分钟。在氮气保护下使用注射器将溶液转移至圆底烧瓶中。然后将反应混合物在氮气气氛下搅拌约24小时。然后通过将容器向空气中打开而停止反应。将反应混合物沉淀到乙醚中，过滤并干燥。然后将所得固体溶解在h2o中，并对去离子水透析(mw截留值3.5 kda) 3天以去除未反应的peg大分子引发剂。然后将混合物冻干3天，以得到ho
‑
peg
‑
pnipam二嵌段共聚物。
[0063]
通过使羟基封端的二嵌段共聚物(ho
‑
peg
‑
pnipam)与l
‑
丙交酯在四氢呋喃中反应来制备plla
‑
peg
‑
pnipam三嵌段共聚物。更具体地说，在搅拌和氮气吹扫下，将干燥的thf (10ml)、l
‑
丙交酯(139 mmol，2g)、ho
‑
peg
‑
pnipam (mn=5371) (0.0559 mmol，0.3g)和sn(oct)
2 (0.4 mmol，0.162 g)在50 ml圆底烧瓶中混合。在氮气保护下将混合物加热至80℃以完全熔融。在氮气保护下，在80℃下进行聚合约24小时。将粗产物溶解在20 ml氯仿中，在100 ml冷甲醇中沉淀，然后真空干燥。
[0064]
使用1h nmr (核磁共振)和ftir (傅立叶变换红外光谱)表征所得三嵌段共聚物(plla
‑
peg
‑
pnipam)。用inova 400 nmr仪器在室温下以400 mhz操作，使用cdcl3作为溶剂记录共聚物的1h nmr光谱。
[0065]
plla
‑
peg
‑
pnipam的1h nmr结果示于图5中。在5.2 ppm (d)和1.6 ppm (e)区域中观察到的共振谱带分别归因于plla主链中的次甲基质子和侧链甲基质子。在3.6 ppm (c)处的谱带归因于peg的亚甲基质子。在1.2 ppm (f)、4.0 ppm (b)和6.4 ppm (a)处的谱带分别归因于pnipam的甲基质子、侧链次甲基质子和胺质子。
[0066]
plla
‑
peg
‑
pnipam的ftir结果示于图6中。plla嵌段的c=o (酯)基团的拉伸振动出现在1750 cm
−1， peg嵌段的c
‑
o基团的拉伸振动出现在1000
‑
1250 cm
−1，并且pnipam嵌段的c=o (酰胺)基团的拉伸振动出现在1650 cm
−1。
[0067]1h nmr和ftir结果都证实成功地合成了三嵌段共聚物。
[0068]
二嵌段和三嵌段共聚物的热诱导的相变行为使用动态光散射(dls)监测羟基封端的二嵌段共聚物(ho
‑
peg
‑
pnipam)和三嵌段共聚物的较低临界溶液温度(lcst)，所述三嵌段共聚物在水中plla:peg:pnipam重量百分比为68:9:23。0.1重量%的二嵌段peg
‑
pnipam共聚物存在于一种水性溶液中，而0.01重量%的三嵌段plla
‑
peg
‑
pnipam共聚物存在于另一种水性溶液中。使用zetasizer nanozs动态光散射(dls)仪器(malvern，uk)评价二嵌段和三嵌段共聚物的流体动力学直径(dh)。固定波长为633 nm且散射角为173
°
。分散剂折射率和水的粘度分别设定为1.330和0.8872 cp。测量在25℃至50℃的温度下进行。
[0069]
如在图7a中所示，羟基封端的二嵌段共聚物(ho
‑
peg
‑
pnipam)共聚物在线性pnipam链的lcst上方形成胶束，其为约32℃至34℃。在图7a中的数据指示，在低于34℃的温度下，二嵌段共聚物良好溶解于水中，其平均流体动力学直径(dh)为约10 nm。通过升高温度，拉伸的pnipam链塌陷，并且水溶性peg嵌段延伸至外表面。如在图7a的图中示意性说明的，形成芯
‑
壳胶束。dh在转变温度区域以上变为恒定，指示pnipam嵌段完全塌陷，并且ho
‑
peg
‑
pnipam二嵌段共聚物的lcst为约34℃。
[0070]
在图7b中的数据指示plla
‑
peg
‑
pnipam (68:9:23)三嵌段共聚物在所有温度下形成胶束，其中plla嵌段在芯中，并且peg
‑
pnipam嵌段在壳中。在低于32℃的温度下，在约950 nm处，聚合物胶束的dh保持恒定。通过升高温度，拉伸的pnipam链塌陷，并且聚合物胶束的
dh收缩至600 nm。如构象转变引起的粒度突变指示的，plla
‑
peg
‑
pnipam三嵌段共聚物的lcst确定为约32℃。
[0071]
实施例2三嵌段共聚物的合成用聚(l
‑
乳酸) (plla)、聚乙二醇(peg)和聚(n
‑
异丙基丙烯酰胺) (pnipam)制备三嵌段共聚物的不同实例。使用不同的不对称亲水性聚合物和/或进料质量比和/或反应时间合成不同的共聚物。
[0072]
不同的不对称亲水性聚合物基于不同分子量的聚乙二醇(peg)。如在图35中所示的和如在实施例1中所述的，使peg聚合物与2
‑
溴异丁酰溴反应。所得不对称亲水性聚合物包括羟基端基和溴端基。表1显示各种实例不对称亲水性聚合物(ahp)和它们相应的数均分子量(mn，g/mol)、重均分子量(mw，g/mol)和mw/mn的比率。两种分子量都使用凝胶渗透色谱法(gpc) (特别是waters凝胶渗透色谱440型)确定。thf用作洗脱液，流速为1.0 ml/分钟。用聚苯乙烯标准物校准分子量和多分散性。
[0073]
表1ahp标识组成mnmwmw/mnahp1ho
‑
peg
1000
‑
br8109071.12ahp2ho
‑
peg
2000
‑
br155117221.11ahp3ho
‑
peg
4000
‑
br275332211.17ahp与n
‑
异丙基丙烯酰胺(nipam)在不同的进料比和/或反应时间下反应以产生几种不同的二嵌段共聚物。图36中的第一反应表示该反应，其中不对称亲水性聚合物的溴官能团引发n
‑
异丙基丙烯酰胺的原子转移自由基聚合。这些反应如在实施例1中所述进行。所得二嵌段共聚物包括羟基端基、peg亲水性聚合物作为中间嵌段和聚(n
‑
异丙基丙烯酰胺) (pnipam)作为末端嵌段。表2显示各种实例二嵌段共聚物和它们相应的mn、mw和mw/mn的比率(如本文所述确定)。表2还显示反应中使用的不对称亲水性聚合物、nipam与ahp的进料质量比和反应时间。
[0074]
表2
然后使dbc与l
‑
丙交酯在不同的进料比和/或反应时间下反应，以产生几种不同的三嵌段共聚物。图36中的第二反应表示该反应，其中二嵌段共聚物的羟基官能团引发l
‑
丙交酯的开环聚合。这些反应也如在实施例1中所述进行。所得三嵌段共聚物包括plla作为一个端基、peg亲水性聚合物作为中间嵌段和pnipam作为另一个末端嵌段。表3显示各种实例三嵌段共聚物以及它们相应的mn、mw和mw/mn的比率(如本文所述确定)。表3还显示所用的二嵌段共聚物、l
‑
丙交酯与二嵌段共聚物的进料质量比和反应时间。
[0075]
表3
由三嵌段共聚物合成微球将每种三嵌段共聚物暴露于本文所公开的两步自组装程序以产生微球。在60℃下将每种三嵌段共聚物分别溶解在thf中，其中浓度为2.0% (w/v)。在剧烈的机械搅拌(速度7，maxima，fisher scientific)下，将三倍于plla
‑
peg
‑
pnipam共聚物溶液体积的甘油(60℃)逐渐加入到plla
‑
peg
‑
pnipam共聚物溶液中，用于乳化和形成液体微球。之后继续搅拌5分钟。然后将混合物快速倒入液氮中。约10分钟后，加入水冰混合物(1,000 ml)进行溶剂交换持续约24小时。将球体过筛并用过量的蒸馏水洗涤6次以去除甘油残留物。然后将球体冻干3天。
[0076]
微球结构/构造使用扫描电子显微镜(sem)检查各种共聚物微球的表面形态。使用philips xl30 feg sem，其中加速电压为8 kv。使用溅射涂布器(deskii，denton vacuum inc.)用金涂布
样品90秒。在涂布过程期间，气压保持在50毫托，并且电流为18 ma。
[0077]
所有共聚物产生一些形式的微球，但不是所有的微球都是纳米纤维状的。本文讨论了微球结构的代表性实例。微球的直径在约10 μm至约100 μm范围内。球体尺寸可以受聚合物化学结构、乳液强度(其可以通过搅拌控制)、乳液的温度和所用的介质影响。如果需要，可以使用筛子以获得较窄的尺寸范围。
[0078]
首先使用mn为约1550的peg嵌段、mn为约3800的pnipam嵌段和mn为约1000的plla嵌段合成tbc8 (总mn为约6376)。如在图8中a1至c1中所示，用三嵌段共聚物tbc8形成的微球具有光滑表面而不是纳米纤维结构。不能形成纳米纤维特征归因于plla的短的链长。
[0079]
通过控制在l
‑
丙交酯的开环聚合中的peg
‑
pnipam/l
‑
丙交酯的比率，用相同的peg (mn=约1550)和pnipam (mn=约3800)长度和增加的plla长度(mn=约2700)合成tbc9 (总mn为约8042)。由tbc9共聚物制成的微球具有片状形态，如在图8中a2至c2所示。
[0080]
在tbc11中plla嵌段的mn进一步增加到约11300 (总mn为约16665)。如在图8中所示，用该plla嵌段在3a至3c制造具有纳米纤维结构的微球。微球中纳米纤维的平均直径为约150 nm，其与胶原纤维在相同的尺寸范围内。由sem显微照片计算平均纤维直径。对于每个样品测量至少100根纤维，并确定它们的平均值和标准偏差。
[0081]
这些结果指示，在仔细调整化学结构后，plla
‑
peg
‑
pnipam三嵌段共聚物可以成功地自组装成纳米纤维微球。
[0082]
使用用tbc11制造的微球作为实例，发现随着微球直径的增加，在微球的外表面处形成一个开孔或多个开孔。在图9a至图9f中显示实例。图9a至图9c分别是tbc11微球的无开孔、一个开孔和多个开孔的sem图像。图9d至图9e分别是在图9a至图9c中所示的微球的2d横截面荧光显微照片(黑白再现)。如在图9a至图9f中所示，当微球的直径大于约30 μm时，实现一个开孔或多个开孔。
[0083]
检查具有不同直径的tbc11微球以确定在孔数和直径之间是否存在趋势。在sem下检查每个直径的100个微球，并人工计数孔数。图10说明显示微球一侧上的平均孔数对直径之间的关系的图。显然，一侧上的孔数随着微球直径的增加而增加。更具体地说，当直径从约10 μm增加到100 μm时，纳米纤维微球一侧上的开孔的平均数从0增加到大于20。
[0084]
微球中三嵌段共聚物的分布为了检查plla
‑
peg
‑
pnipam纳米纤维微球中plla、pnipam和peg嵌段的分布，制备其中每个嵌段用荧光单体单独地和化学地染色的实施例。
[0085]
br
‑
peg
‑
plla共聚物的合成：在搅拌和氮气吹扫下，将干燥thf (10ml)、l
‑
丙交酯(139 mmol，2g)、peg大分子引发剂(mn=1551) (0.6 mmol，1g)和sn(oct)
2 (0.4 mmol，0.162 g)在50 ml圆底烧瓶中混合。在氮气保护下将混合物加热至80℃以完全熔融。在氮气保护下，在80℃下进行聚合24小时。将粗产物溶解在20 ml thf中，并在100 ml去离子(di)水中沉淀。然后将所得混合物对去离子水透析(mw截留值3.5 kda) 3天以去除未反应的peg大分子引发剂。然后将混合物冻干3天，以得到br
‑
peg
‑
plla共聚物。
[0086]
荧光素o
‑
丙烯酸酯染色的plla
‑
peg共聚物的合成：在氮气保护下，将br
‑
peg
‑
plla共聚物(1 g)、荧光素o
‑
丙烯酸酯(0.065 mmol，0.025g)和cucl (0.170 mmol，0.016.8 g)放置在250 ml圆底烧瓶中，并用橡胶隔膜塞子密封。将milli
‑
q水(20 ml)和me6tren (0.174 mmol，0.04g)放置在schlenk管中，并用n2气体吹扫40分钟。在氮气保护下使用注射
器将溶液转移至圆底烧瓶中。然后将反应混合物在氮气气氛下搅拌约24小时。然后通过将容器向空气中打开而停止反应。将反应混合物对去离子水透析(mw截留值3.5 kda) 3天以去除未反应的荧光素o
‑
丙烯酸酯。然后将混合物冻干3天，以得到荧光素o
‑
丙烯酸酯染色的plla
‑
peg共聚物。
[0087]
荧光素o
‑
丙烯酸酯(peg)和丙烯酰氧基乙基硫代氨基甲酰基罗丹明b (pnipam)染色的plla
‑
peg
‑
pnipam共聚物的合成：在氮气保护下，将荧光素o
‑
丙烯酸酯染色的plla
‑
peg共聚物(0.5 g)、丙烯酰氧基乙基硫代氨基甲酰基罗丹明b (0.007 mmol，0.005 g)、nipam (26.5 mmol，3 g)和cucl (0.170 mmol，0.016.8 g)放置在250 ml圆底烧瓶中，并用橡胶隔膜塞子密封。将milli
‑
q水(20 ml)和me6tren (0.174 mmol，0.04g)放置在schlenk管中，并用n2气体吹扫约40分钟。在氮气保护下使用注射器将溶液转移至圆底烧瓶中。然后将反应混合物在氮气气氛下搅拌约24小时。然后通过将容器向空气中打开而停止反应。将反应混合物对去离子水透析(mw截留值3.5 kda) 3天以去除未反应的丙烯酰氧基乙基硫代氨基甲酰基罗丹明b。然后将混合物冻干3天，以得到荧光素o
‑
丙烯酸酯和丙烯酰氧基乙基硫代氨基甲酰基罗丹明b染色的plla
‑
peg
‑
pnipam共聚物。
[0088]
尼罗蓝丙烯酰胺染色的plla聚合物的合成：将hema
‑
plla5 (1.4 g)、尼罗蓝丙烯酰胺(0.012 mmol，0.005 g)和aibn (0.06 mmol，9.8 mg)加入到二氧六环(10 ml)中，并搅拌至溶解。在70℃下进行聚合24小时。聚合后，通过从氯仿到甲醇的重复再沉淀3次来纯化粗产物，并且最后在40℃下真空干燥48小时，以得到尼罗蓝丙烯酰胺染色的plla聚合物。
[0089]
荧光染色的纳米纤维微球的制造：在60℃下将表3中的tbc11溶解在20 ml thf中，其中浓度为2.0% (wt/v)。加入荧光素o
‑
丙烯酸酯和丙烯酰氧基乙基硫代氨基甲酰基罗丹明b染色的plla
‑
peg
‑
pnipam共聚物(0.1 g)和尼罗蓝丙烯酰胺染色的plla聚合物(0.05 g)并溶解。在剧烈的机械搅拌(速度7，maxima，fisher scientific)下，将三倍于plla
‑
peg
‑
pnipam共聚物溶液体积的甘油(60℃)逐渐加入到plla
‑
peg
‑
pnipam共聚物溶液中。之后继续搅拌5分钟。然后将混合物快速倒入液氮中。约10分钟后，加入水冰混合物(1,000 ml)进行溶剂交换持续24小时。将球体过筛并用过量的蒸馏水洗涤6次以去除甘油残留物。然后将球体冻干3天。
[0090]
使用共焦成像来观察这些微球。用10% w/v若丹明
‑
共轭的bsa水性溶液处理微球20分钟，接着用去离子水充分洗涤。使用共焦激光扫描显微镜(clsm) (nikon eclipse c1)检查微球。
[0091]
图11a至图11d是2d横截面共焦荧光显微照片的黑白再现，其最初是彩色的。在与图11a相应的原始彩色显微照片中，微球是红色，指示pnipam嵌段被丙烯酰氧基乙基硫代氨基甲酰基罗丹明b染成红色(红色)。在与图11b相应的原始彩色显微照片中，微球是绿色，指示peg嵌段被荧光素o
‑
丙烯酸酯染成绿色。在与图11c相应的原始彩色显微照片中，微球是蓝色，指示plla嵌段被尼罗蓝丙烯酰胺染成蓝色(蓝色)。图11d是图11a、图11b和图11c的合并图像。原始彩色图像指示所有三种颜色，并因此所有三个嵌段分布在整个微球中。然而，当使用高分辨率共焦荧光显微镜(leica sp8)在更高放大率下观察时，各嵌段可清楚地区分。
[0092]
图11e是图11a的较高放大率图像，图11f是图11b的较高放大率图像，图11g是图11c的较高放大率图像，并且图11h是图11d的较高放大率图像。图11g指示plla嵌段形成具
(89:11重量比)。在thf中用sn(oct)2在80℃下发生反应。
[0102]
使用甲基丙烯酸2
‑
(2
‑
溴异丁酰氧基)乙酯作为用于nipam的原子转移自由基聚合和用于l
‑
丙交酯的开环聚合的双头引发剂制备二嵌段共聚物plla
‑
pnipam (73:27重量比)。甲基丙烯酸2
‑
(2
‑
溴异丁酰氧基)乙酯与nipam在具有氯化铜(cucl)和三
‑
[2
‑
(二甲基氨基)乙基]胺(me6)的水/乙醇混合物中在室温下反应。然后，在thf中用sn(oct)2在约80℃下进行l
‑
丙交酯的rop。
[0103]
plla、peg和pnipam的无规共聚物沿共聚物链不具有三个不同的嵌段，而是相应的聚合物沿共聚物链无规分布。对于无规共聚物，首先如下合成聚(乙二醇)甲基丙烯酸酯(pegm)和plla大分子单体：在搅拌和氮气吹扫下，将l
‑
丙交酯(40 mmol，5.760 g)、pegma (4 mmol，2.0 g)和sn(oct)
2 (0.4 mmol，0.162 g)在50 ml圆底烧瓶中混合。在氮气保护下将混合物加热至120℃以完全熔融。在140℃下进行聚合2小时。将粗产物溶解在20 ml氯仿中，在100 ml冷甲醇中沉淀，然后真空干燥。如下合成plla
‑
peg
‑
pnipam无规共聚物：将pegma
‑
plla大分子单体(1.4 g)、pegma (2 mmol，0.1 g)、nipam (12.4 mmol，1.4 g)和偶氮二异丁腈(aibn，0.06 mmol，9.8 mg)加入到二氧六环(10 ml)中，并搅拌至溶解。在70℃下进行聚合24小时。聚合后，通过从氯仿到甲醇重复再沉淀3次来纯化粗产物，并且最后在40℃下真空干燥48小时。
[0104]
对于plla
‑
peg
‑
pnipam无规共聚物，如通过gpc测量并使用聚苯乙烯作为标准物和thf作为洗脱剂计算，mn=16630且mw=24114。由peg的亚甲基质子、pnipam的次甲基质子和plla的次甲基质子的平均信号强度比计算，无规共聚物中plla、peg和pnipam的质量比为52/14/34重量%。
[0105]
然后如本文所述使用溶解、使用甘油乳化和使用液氮相分离制备plla
‑
peg微球、plla
‑
pnipam微球、无规共聚物微球和plla微球。
[0106]
用tbc11微球、两种不同的二嵌段共聚物微球、无规共聚物微球和plla微球以5% w/v制备相应的水性分散体。在25℃下，每种水性分散体均为自由流动的液体。将每种分散体的温度升高至37℃(例如，体温)。在较高体温下，包括tbc11微球的水性分散体变成3d水凝胶。tbc11微球的水性悬浮液在25℃下不形成凝胶，但在37℃下确实形成凝胶。这些结果说明三嵌段共聚物在较高温度下经历热诱导的物理交联以形成水凝胶。其它微球在升高的温度下都不形成水凝胶。相反，plla
‑
peg二嵌段共聚物微球保持在液体悬浮液中；无规共聚物微球保持在悬浮液中；plla
‑
pnipam二嵌段共聚物微球从悬浮液中沉淀出来，并且plla微球从悬浮液中沉淀出来。这些结果显示结合水的peg和形成物理交联的pnipam使得本文所公开的三嵌段共聚物能够形成水凝胶。
[0107]
将tbc 11微球(60
‑
90 μm，5% w/v浓度，用若丹明
‑
bsa染色)放置在加热的载玻片上，并使用共焦激光扫描显微镜观察。结果以黑白示于图16a中，并在图16b中示意性地再现。如在两个图中所描述的，tbc 11微球在形成的3d水凝胶内保持它们的微球结构。这与其它微球不同，其它微球倾向于通过水凝胶形成而失去其3d几何形状。水凝胶中5% w/v浓度的tbc 11微球能够在37℃下长时间保持3d形状，如在图17中所示的。
[0108]
进行流变学测量以测量用tbc6 (plla:peg:pnipam=84:5:11)、tbc 7 (plla:peg:pnipam=88:4:8)和tbc11 (plla:peg:pnipam=68:9:23)形成的微球的溶胶
‑
凝胶转变温度和粘弹性性质(表3)。使用配备温度控制器的ar2000流变仪(ta instruments，美国)监测水
凝胶的流变学性质，包括储能模量(g’)和损耗模量(g
’’
)。所有测试使用直径20 mm的平行板。板之间的间隙距离为0.4 mm。对于频谱之外的测量，使用恒定的1 rad/s角速度。对于除应力扫描之外的测量，使用恒定的0.1pa应力。以2℃/分钟的加热速率对样品从20℃至45℃进行温度扫描。在37℃下进行0.1
‑
100 rad/s范围的频率扫描。在37℃下从1
‑
1000 pa对样品进行应力扫描。
[0109]
图18a至图18c分别描述10% w/v tbc 11水性悬浮液、10% w/v tbc6水性悬浮液和10% w/v tbc 7水性悬浮液的温度响应性g’和g”模量变化。如在图18a中描述的，tbc 11水性悬浮液的储能模量(g’)从在30℃下低于10 pa增加到在45℃下的8000 pa，显示溶胶
‑
凝胶转变温度为约35℃。对于10% w/v tbc6水性悬浮液(图18b)和10% w/v tbc 7水性悬浮液(图18c)观察到类似的现象。这些结果显示tbc 7可以形成可流动的(非独立式)水凝胶。
[0110]
为了确定tbc 11微球的强度和稳定性，在37℃下对10% w/v tbc 11水性悬浮液的水凝胶进行应力扫描实验。在应力水平从0.1 pa增加到20 pa时观察到线性粘弹性区域(lvr)，如在图19中所示。当施加的应力从20 pa增加到100 pa时，储能模量(g’)逐渐降低，并且tan (δ) (g
’’
/g’)增加。当施加的应力超过100 pa时，g’从145 pa急剧下降到2 pa，而tan (δ)从0.5增加到2.5，指示屈服应力水平和机械完整性的损失。
[0111]
一旦确定lvr，在37℃下用10% w/v tbc 11 (a)、tbc6 (b)和tbc 7 (b)水性悬浮液中的每一种在固定应力(0.1pa)下进行频率扫描实验，其中流变频率从0.1 rad/s增加到100 rad/s。如在图20和图21中所示的，模量显示频率独立性，并且在整个频率范围中g’比g
’’
占优势。
[0112]
图20中的结果说明pnipam百分比对水凝胶强度的作用。如上所述，tbc6具有11重量% pnipam，tbc 7具有8% pnipam，而tbc 11具有23重量% pnipam。tbc 11 (具有最高重量百分比的温度响应性聚合物)具有1000 pa的最高g’，tbc6 (具有11重量%的温度响应性聚合物)具有260 pa的g’，而tbc 7 (具有最低重量百分比的温度响应性聚合物)具有75 pa的最低g’。对于g”观察到类似的现象，显示pnipam百分比(交联密度)与微球的机械性质之间正相关。
[0113]
图21中的结果说明微球浓度对水凝胶机械性质的作用。在该测试中，在两个不同浓度(5% w/v和10% w/v)下测试tbc 11微球。当浓度从10% w/v降至5% w/v时，水凝胶的g’和g
’’
分别从1000 pa降至300 pa和从140 pa降至80 pa。这些结果说明微球浓度与微球水凝胶的机械性质之间的相关性。
[0114]
温度扫描、应力扫描和频率扫描实验的结果一致地证实plla
‑
peg
‑
pnipam微球的水性悬浮液在室温下是自由流动的可注射的液体，其在37℃下形成机械上有用的物理水凝胶，其模量在10
1 pa至10
3 pa量级，这取决于pnipam百分比和微球浓度，这可以容易地针对各种生物医学应用进行调整。
[0115]
实施例3plla
‑
peg
‑
pnipam微球的组成对微结构和凝胶化的作用表3中的各种三嵌段共聚物具有不同的plla、peg和pnipam嵌段长度。如在实施例2中所述的，使用thf和甘油，这些三嵌段共聚物中的每一种用于形成微球。还评价这些微球的微结构和凝胶化性质。
[0116]
为了比较，如在实施例2中所述的，合成具有三种不同分子量的线性plla均聚物
(组成和分子量(g/mol)示于表4中)并制成微球。还评价这些微球的微结构和凝胶化性质。
[0117]
表4使用sem观察微结构。如果在观察的样品/批料中90%或更多的微球具有纳米纤维结构，则认为微结构具有形成纳米纤维的能力。
[0118]
也目视观察微结构。如果微球(在5%至10% w/v水性悬浮液中)能够在37℃下形成水凝胶，则认为微结构具有形成独立式水凝胶的能力。
[0119]
所有三嵌段共聚物和plla均聚物的微结构和水凝胶结果示于表5中。
[0120]
检查平均分子量对plla均聚物对微球结构的作用。如在图22中所示，在所有数均分子量下，plla均聚物制成微球。当plla的mn为约3803时，制备具有更多片状结构的微球。
当plla的mn增加到约4700时，制造具有纳米纤维结构的微球。然而，一些纤维粘在一起，这导致平均纤维直径增加。当mn增加到约5521时，制造具有更期望的纳米纤维结构的微球。这些结果显示分子量对plla微球结构具有关键作用。因此，对于本文所公开的包括plla嵌段的三嵌段共聚物，plla嵌段的mn可以高于约5521，使得所得微球具有期望的纳米纤维结构。
[0121]
向plla嵌段中加入peg和pnipam嵌段降低链规则性，并降低plla链的结晶度。因此，本文所公开的三嵌段共聚物中plla嵌段的重量百分比也可以影响微球结构。
[0122]
图23是描述pnipam百分比(重量%)沿x轴、peg百分比(重量%)沿y轴和plla百分比(重量%)沿z轴的图。对于plla嵌段，用于纳米纤维形成的最小重量百分比为约66重量%。当在三嵌段共聚物中plla嵌段的重量百分比在约16重量%至约31重量%的范围内时，制造具有光滑表面的微球(参见图23和表1)。当共聚物中plla的重量百分比在约31重量%至约67重量%的范围内时，制造具有片状结构的微球(参见图23和表1)。当共聚物中plla的重量百分比为约68重量%或更高时，制造具有期望的纳米纤维结构的微球(参见图23和表1)。例如，约90%的tbc 11微球(68重量% plla)具有期望的纳米纤维结构，而约50%的tbc10微球(57重量% plla)具有期望的纳米纤维结构，而另外50%具有片状结构。
[0123]
因此，为了制造具有纳米纤维结构的plla
‑
peg
‑
pnipam微球，应当同时满足两个阈值要求：plla嵌段的mn应高于约5521，并且共聚物中plla嵌段的重量百分比应为68重量%或更高。例如，尽管tbc10中plla嵌段的mn为约7213 (表3和表5)，plla的重量百分比仅为约57重量%，并且所得微球具有片状结构。对于tbc3，plla的重量百分比为约69重量%，但是plla嵌段的mn为约2898。tbc3微球具有片状结构。仅当plla百分比为68重量%或更高并且plla嵌段的mn为约5521时，才能形成期望的纳米纤维结构。
[0124]
虽然该实施例中的结果是plla特有的，但是应当理解，对于其它疏水性纳米纤维形成聚合物，最小重量百分比和最小mn可以不同。
[0125]
虽然期望三嵌段共聚物形成纳米纤维微球，但是还期望当暴露于至少体温时形成水凝胶。对于plla
‑
peg
‑
pnipam三嵌段共聚物实例，已经发现peg百分比应为约5重量%或更高，并且pnipam百分比应为约11重量%或更高。对于其它亲水性聚合物和/或对于其它温度响应性聚合物，这些百分比可以变化。
[0126]
图24是描述peg百分比(重量%)沿x轴、pnipam百分比(重量%)沿y轴和plla百分比(重量%)沿z轴的图。当三嵌段共聚物中peg嵌段的重量百分比为5重量%或更高时，实现独立式水凝胶。在一个实例中，三嵌段共聚物中的peg嵌段在约5重量%至约28重量%的范围内(图24和表5)。当peg重量百分比小于约5重量%时，发生沉淀，这可能是由于微球的疏水性质。该结果证明plla
‑
peg
‑
pnipam共聚物中约5重量%的peg嵌段足以用作亲水结构域以结合水和防止沉淀发生。
[0127]
图25是描述pnipam百分比(重量%)沿x轴、peg百分比(重量%)沿y轴和plla百分比(重量%)沿z轴的图。当三嵌段共聚物中pnipam嵌段的重量百分比为约11重量%或更高时，实现独立式水凝胶。当共聚物中pnipam嵌段的重量百分比低于11重量%时，pnipam嵌段之间的疏水相互作用在体温下太弱而不能保持足够强的物理网络，并且plla
‑
peg
‑
pnipam微球不能形成独立式水凝胶。
[0128]
plla
‑
peg
‑
pnipam微球的微结构和凝胶化性质强烈地取决于共聚物组成。为了制造纳米纤维和凝胶形成微球，对于纳米纤维形成应当同时满足两个阈值要求，并且对于水
凝胶形成应当同时满足两个阈值要求。在实例中，当plla嵌段的mn高于约5521，并且三嵌段共聚物中plla、peg和pnipam的重量百分比分别为68重量%、5重量%和11重量%或更高时，微球变成纳米纤维状，并且能够在体温下形成独立式水凝胶。对于其它疏水、亲水和温度响应性嵌段，这些参数可以变化。
[0129]
实施例4心脏再生体外实验使用化学限定的培养物将hesc (h7细胞系)分化成心肌细胞(cm)。将完全汇合的单层hesc在cdm3培养基中培养以诱导cm分化。从第12天到第18天，施用乳酸盐培养基以纯化cm。在第20天，用胰蛋白酶消化衍生的cm，用于流式细胞术测定或随后的移植。
[0130]
为了研究纳米纤维和凝胶形成微球是否支持心肌细胞(cm)的维持和成熟，将cm与tbc11微球(描述于实施例2和实施例3中)一起体外培养7天。将以30:1的比率与tbc11微球混合的5,000,000个cm在35 mm培养皿(falcon)中与cdm3培养基共培养7天。
[0131]
对于免疫荧光染色，样品用4%多聚甲醛在室温下固定20分钟，在tissue
‑
plus o.c.t compound (fisher scientific)中冷冻，并冷冻切成7 μm的切片。载玻片切片用0.3% triton x
‑
100在室温下渗透15分钟，用dpbs
‑
t中的5%马血清在室温下封闭1小时，并用针对ctnt (ab45932，abcam)的第一抗体在4℃下在2%马血清中孵育过夜。然后用pbs洗涤切片3次，每次15分钟，与alexa fluor 488
‑
共轭的第二抗体(thermo fisher scientific)在dpbs
‑
t中的2%马血清中在室温下孵育1小时，用pbs洗涤3次，并且每次15分钟，然后用dapi染色(对于细胞核，参见图26a)。图像通过荧光显微镜(olympus，日本)获得，并且在图26a (细胞核染色)、26b (ctnt)和26c (来自26a和26b的合并图像)中以黑白再现。tbc11微球的开放和中空结构促进cm结合、均匀分布和附着于凝胶形成微球。凝胶形成微球的凝胶形成防止cm渗漏并允许cm相互作用。重要的是，凝胶中的cm表达心肌肌钙蛋白t (图26b)并维持心跳性质(数据未显示)。
[0132]
体内实验为了评价载体tbc11微球的长期细胞保留和体内移植，将具有tbc11微球的hesc衍生的cm移植到心肌梗塞大鼠中。
[0133]
使用八周龄(190
‑
210 g)雌性sprague daley大鼠，并且通过缺血再灌注(i/r)手术诱导心肌梗塞。用6
‑
0缝线结扎左前降动脉60分钟，并通过松开缝线再灌注。将动物随机分成不同的组：pbs对照(在图28和图30
‑
34b中标记为“pbs”)、仅cm组(在图28和图30
‑
34b中标记为“仅cm”)、仅tbc11微球组(在图28和图30
‑
34b中标记为“nf
‑
gms”或“仅tbc11微球”)和cm tbc11微球组(在图28和图30
‑
34b中标记为“cm nf
‑
gms”或“cm tbc11微球”)。对于cm tbc11微球组，将1
×
10
7 hesc
‑
cm与tbc11微球以30:1的比率混合，并悬浮于100 μl pbs中。i/r后七天，将100 μl pbs (pbs对照组)、或100 μl含有1
×
10
7 hesc
‑
cm的细胞悬浮液(仅cm组)、或100 μl含有tbc11微球的悬浮液(仅tbc11微球组)、或100 μl含有1
×
10
7 hesc
‑
cm并与tbc11微球混合的悬浮液(cm tbc11微球组)在5个位置注入梗塞的边界区。从细胞移植前两天开始，以10 mg/kg/天皮下给药免疫抑制剂环孢菌素a，直至动物被处死。
[0134]
在细胞移植后第28天(4周)评估移植的hesc
‑
cm的移植物大小。将心脏固定在4%多聚甲醛中，在tissue
‑
plus o.c.t compound (fisher scientific)中冷冻，并冷冻切成7 μ
m切片用于免疫组织化学和组织学分析。对于免疫荧光染色，程序与上述体外cm tbc11微球样品相同。用针对人线粒体的第一抗体(mab1273，emd millipore)进行染色以鉴定大鼠心脏中移植的cm。用ctnt (ab45932，abcam)和cnnx43 (sc
‑
9059，santa cruz biotechnology)抗体进行染色，以表征cm结构和细胞
‑
细胞连接。染色后，使用prolong
®ꢀ
diamond antifade mountant (p36970，thermo fisher scientific)安装载玻片，并使用nikon a1共焦激光显微镜成像。用抗cd31 (sc
‑
1506，santa cruz biotechnology)抗体染色用于研究血管密度。另外，进行masson三色染色以计算大鼠心脏中的梗塞大小。
[0135]
图27a(以黑白)说明仅cm组的人特异性抗原(hu
‑
mito)染色图像。在该图像中，主要在梗塞边界区观察到cm，并且偶尔在梗塞区观察到cm。图27b(以黑白)说明 cm tbc11微球组(标记为cm nf
‑
gms (纳米纤维
‑
凝胶化微球))的人特异性抗原(hu
‑
mito)染色图像。在cm nf
‑
gms组中，在边界区和梗塞区两者中主要鉴定了大得多的和汇合的cm移植物。
[0136]
通过将染色的载玻片从尖端到心脏底部每0.5 mm合并来计算移植物体积。通过imagej软件测量每个载玻片中的移植物面积。移植物大小(以mm3计)的结果示于图28中。如在图28中所示，cm tbc11微球组的移植物大小明显高于仅cm组，指示梗塞大鼠心脏的移植物大小比仅cm组增加了约10倍。
[0137]
tbc11微球携带的cm的大的移植也使用针对ctnt的免疫荧光染色和抗hu
‑
mito染色检测，如在图29a至图29c中说明的。此外，如连接蛋白43染色(图29d和图29f)中指示的，在宿主和移植细胞之间(箭头，图29f)以及在移植细胞之间形成丰富的间隙连接，指示tbc11微球携带细胞移植也促进宿主和移植的cm之间的细胞
‑
细胞整合。
[0138]
移植的cm的长期存活和整合需要在移植区域有足够的血管网络支持。因此，在细胞移植后28天，通过用内皮细胞标记物cd31染色，评价梗塞大鼠心脏中梗塞边界区和远区(非梗塞区)的血管密度。获得共焦图像，并且结果在图30中以黑白显示。在边界区中，用tbc11微球治疗的心脏说明血管的内腔表面上有最多的cd31内皮细胞(与其它治疗的心脏相比)，指示足够的血管网络支持。
[0139]
计算血管样内腔的数量以评估血管密度，并且远区的结果示于图31a中，而边界区的结果示于图31b中。如所描述的，在这些图中，在细胞移植后28天，所有组中远区的血管密度都大于边界区。在pbs对照组、仅cm组、仅tbc11微球组和cm tbc11微球组中，在远区中未观察到血管密度的统计学显著性。相反，比起仅cm组(317.79
±ꢀ
21.14)和pbs对照组(239.32
±
16.35) (p < 0.01)，在cm tbc11微球组(397.82
±
18.15)的边界区中观察到显著较高的血管密度。因此，tbc11微球携带cm移植促进梗塞大鼠心脏边界区的血管再生。
[0140]
进行masson三色染色以鉴定(原始蓝色)疤痕组织和(原始红色)活组织。这些图像在图32中以黑白显示。在pbs对照组和仅tbc11微球组的梗塞区域中几乎没有观察到活组织。在仅cm组中可以发现一些活细胞簇，但主要在边界区附近。相反，在cm tbc11微球组中在边界区和梗塞区两者中都鉴定大的活细胞簇，导致厚得多的心室壁。如在图33中所示，在tbc11微球携带cm注射一个月后，cm tbc11微球组中的梗塞大小仅为心脏左心室的16%，与pbs对照组相比减少58%，与仅tbc11微球组相比减少50%，并且与仅cm组相比减少43% (p<0.01)。
[0141]
在第6天和第35天进行超声心动图，以评价心脏功能。使用vevo
®ꢀ
2100系统测量左心室舒张末径(lvedd)和左心室收缩末径(lvesd)。使用以下等式计算左心室射血分数
(ef)和缩短分数(fs)：ef (%)=(lvedd2−
lvesd2)/lvedd2×
100%；和fs (%)=(lvedd
−
lvesd)/lvedd
×
100%。
[0142]
在第6天进行超声心动图，以获得细胞移植前的梗塞基线，并且用lvfs证实所有组中的心肌梗塞小于35%。在第35天的ef和fs数据分别在图34a和34b中显示。如所描述的，在cm tbc11微球组中发现心脏功能的显著增加，其中ef为54.00%并且fs为29.29%，指示显著功能恢复，其中与pbs对照组相比，ef增加39%并且fs增加46% (p<0.01)。cm tbc11微球组的心脏功能也显著大于仅cm组的心脏功能，其中ef高17%，并且fs高22% (p<0.05)。
[0143]
本实施例的所有数据说明，与仅cm移植相比，cm tbc11微球显著减小梗塞大小并增强功能恢复。
[0144]
将ecm模拟纳米纤维构造与温度响应性原位凝胶形成性质整合的本文所公开的微球是用于组织再生和药物递送的有吸引力的微载体。作为细胞载体，纳米纤维微球能够增强细胞保留、存活/增殖、cm表型表达和整合性心脏组织再生。在实施例4中，在梗塞大鼠模型中cm移植后28天观察到微球的移植物大小显著增加10倍。因此，纳米纤维微球携带的cm移植导致梗塞大小显著减小，再生区域中的脉管系统增加，宿主和移植细胞的偶联，以及最终心脏功能的显著改进。
[0145]
在整个说明书中对“一个实例”、“另一个实例”、“实例”等的引用意味着结合该实例描述的特定要素(例如，特征、结构和/或特性)包括在本文描述的至少一个实例中，并且可以存在于其它实例中或可以不存在于其它实例中。此外，应当理解，除非上下文明确另外指出，否则任何实例的所述要素可以任何合适的方式在各种实例中组合。
[0146]
应当理解，本文提供的范围包括所述范围和所述范围内的任何值或子范围，如同明确地列举了这样的值或子范围。例如，约10%至约89%的范围应被解释为不仅包括明确列举的从约10%至约89%的界限，而且包括单个值，例如25%、34.5%、68%等，以及子范围，例如约30%至约65%、从约50%至约85%等。此外，当“约”用于描述数值时，这意味着包括距所述值少量变化(至多 /
‑
10%)。
[0147]
在描述和要求保护本文所公开的实例时，单数形式“一”、“一个”和“该”包括复数指代物，除非上下文明确另外指出。
[0148]
虽然已经详细描述了若干实例，但是应当理解，可以修改所公开的实例。因此，前面的描述被认为是非限制性的。