阿糖胞苷前药有关物质及其应用的制作方法

1.本发明属于药物技术领域，具体而言，本文发明涉及阿糖胞苷前药的有关物质及其应用。


背景技术：

2.阿糖胞苷前药是一个采用hepdirecttm技术研制的靶向化合物(可参见中国专利第200380102686.5号)，可以通过化学合成方法制备，主要用于治疗或预防表达p450的肝癌和结肠直肠癌，其化学结构式如下：
[0003][0004]
中国专利cn103393709b公开了包含阿糖胞苷前药的(药物)制剂及其制备方法，将其溶液ph控制在3.5～4.1之间，进行冷冻干燥。
[0005]
然而，本发明人发现，阿糖胞苷前药水溶性差，且结构中含有磷酸酯和胞嘧啶结构，在其(原料药)存储、运输过程中以及制备成(药物)制剂的过程中均容易产生有关物质。而现有技术对阿糖胞苷前药的有关物质报道很少。
[0006]
在没有现有技术启示和指导的情况下，本发明人迎难而上，经过大量艰苦地研究，发现了阿糖胞苷前药的大量有关物质，不但能用于表征阿糖胞苷前药的质量，而且更令人意想不到的是，其中多种有关物质可以用于显示在实际的生产过程中出现的异常情况，从而用于改善实际的生产，提高阿糖胞苷前药的药品质量。


技术实现要素：

[0007]
本发明要解决的技术问题在于提供阿糖胞苷前药的有关物质的检测方法。
[0008]
具体而言，在第一方面，本发明提供了分离的如下式1～10之一个或多个所示的化合物
[0009]
[0010][0011]
本发明第一方面的化合物是阿糖胞苷前药有关物质。本发明第一方面的化合物可以是式1～10之一个所示的化合物，也可以是式1～10之2、3、4、5、6、7、8、9或10个所示的化合物，后者实际上是由式1～10之2、3、4、5、6、7、8、9或10个所示的化合物的组合物。
[0012]
如果存在于阿糖胞苷前药的原料药或者制剂中，本发明第一方面的化合物具备稳定的色谱行为(参见以下两表格)。例如，式1所示的化合物可以表示为阿糖胞苷前药原料药经实施例7所述的色谱方法分离而具备定位保留时间为4.413min的化合物；又如，式10所示的化合物可以表示为阿糖胞苷前药制剂，经实施例7所述的色谱方法分离而具备定位保留时间为17.165min的化合物。
[0013]
原料药中各成分的分离情况
[0014][0015]
制剂中的特有有关物质及其与主峰的色谱行为
[0016][0017]
在第二方面，本发明提供了本发明第一方面的化合物在制备阿糖胞苷前药中的应用；另外，本发明提供了本发明第一方面的化合物在制备包含阿糖胞苷前药的组合物中的应用，优选在制备包含阿糖胞苷前药的药物组合物中的应用。
[0018]
在本文中，如无特别指明，“制备”指的是现实生产状况下的大规模制备，本领域技术人员理解，其与理想状况下或接近于理想状况(如环境、设备、条件、试剂和操作人员不计成本地严格控制)下的制备(如由研究专家在高等级实验室小规模制备)不同，会产生更多的因为设备故障、环境、条件或实际控制不十分严格、操作人员失误、和/或甚至原因难以查明的因素而造成的异常情况，从而影响阿糖胞苷前药的质量。因此，在本发明第二方面的应用中，所述制备的过程包括检测阿糖胞苷前药有关物质的步骤。通常，制备阿糖胞苷前药的过程依次包括如下步骤：
[0019]
(1)合成阿糖胞苷前药并纯化；和
[0020]
(2)检测步骤(1)合成并纯化的阿糖胞苷前药有关物质。
[0021]
而通常，制备包含阿糖胞苷前药的组合物的过程依次包括如下步骤：
[0022]
(1)任选检测阿糖胞苷前药有关物质；
[0023]
(2)将任选经步骤(1)检测的阿糖胞苷前药与可接受的辅料(如，药学上可接受的辅料)混合；和
[0024]
(3)检测步骤(2)获得的组合物中的阿糖胞苷前药有关物质。
[0025]
在本文中，如无矛盾的指示，“药物组合物”与“药物制剂”可以互换使用，指的是药物活性物质与药学上可接受的辅料的组合物。在本文中，“药学上可接受的辅料”指无毒的填充剂、稳定剂、稀释剂、载体、溶剂或其他制剂辅料。
[0026]
优选在本发明第二方面的应用中，本发明第一方面的化合物作为对照品。例如，本发明第一方面的化合物可以作为本发明的具体实施方式中记载的hplc检测方法的对照，用于确定该化合物对应的峰位置(保留时间)和量。当然，对于其他的检测方法(尤其是条件不同的hplc检测方法)，本发明第一方面的化合物作为的对照的用途更广。
[0027]
更优选在本发明第二方面的应用中，式4的化合物增加用于显示阿糖胞苷前药受到碱或酸破坏。本发明人研究发现，尽管不排除在阿糖胞苷前药或其制剂的制备过程中有碱性或酸性试剂加入过量等情况的可能性，但这通常是由于在阿糖胞苷前药或其制剂的制备过程中碱性或酸性试剂未均匀分布而局部浓度过大的情况发生而造成的，由此需要降低碱性或酸性试剂的加入速度、降低待加入的碱性或酸性试剂的浓度、和/或提高混合设备的混合力度。
[0028]
更优选在本发明第二方面的应用中，式7和式8的化合物都增加用于显示阿糖胞苷前药在溶液中受到高温破坏。本发明人研究发现，通常在阿糖胞苷前药原料药的储存中不会形成溶液，因而这通常是由于在阿糖胞苷前药或其制剂的制备过程中有温度过高的情况
发生而造成的，由此需要检测设备的温度检测、调节和控制部件，修复受损或异常部件。其中，式7和式8为互变异构体。
[0029]
更优选在本发明第二方面的应用中，式8的化合物增加可以用于显示阿糖胞苷前药受到氧化破坏。本发明人研究发现，这通常是由于阿糖胞苷前药或其制剂的制备过程中或者阿糖胞苷前药原料药的储存过程中有被氧化的情况发生而造成的，由此需要改进在上述过程中密封状况或隔绝氧化剂的状况。
[0030]
也更优选在本发明第二方面的应用中，式10的化合物增加可以用于显示阿糖胞苷前药在固体状态下受到高温的破坏。高温可以是由于光照加热而造成的。本发明人研究发现，通常在阿糖胞苷前药或其制剂的制备过程中其固体状态所处的时间很短，因而这通常是由于在阿糖胞苷前药原料药的储存过程中有温度过高的情况发生而造成的，由此需要改进其储存条件，如环境温度、强光照射等。
[0031]
优选在本发明第二方面的应用中，所述检测是hplc检测。例如，所述检测可以采用高效液相色谱仪，以反相色谱柱进行梯度洗脱，对洗脱产物进行hplc检测。
[0032]
其中，反相色谱柱的填充剂可以为十八烷基硅烷键合硅胶，如为岛津intersil-ods-sp的色谱柱；
[0033]
色谱柱的长度可以为150～250mm，直径可以为4～5mm，填充粒径可以为1.8～5μm，在本发明的具体实施方式中，例如，色谱柱的长为250mm，直径为4.6mm，填充粒径为3～5μm；
[0034]
流动相由流动相a和流动相b组成；其中，流动相a为缓冲溶液与有机溶剂的混合溶液，流动相b为有机溶剂；
[0035]
有机溶剂可以为甲醇或乙腈，或两者的混合物；
[0036]
缓冲溶液为磷酸盐缓冲溶液，优选地，所述磷酸盐选自磷酸钠、磷酸铵、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢铵、磷酸氢二铵、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾中的一种或几种，如为磷酸二氢铵和磷酸氢二铵的混合物；其中优选地，磷酸盐缓冲溶液为17mmol/l～22mmol/l磷酸二氢铵与1.7mmol/l～2.2mmol/l磷酸氢二铵溶液；
[0037]
流动相a中磷酸盐缓冲液与有机溶剂的比例可以为93:7～98:2，如为95:5；
[0038]
梯度洗脱程序可以为：
[0039]
时间0min，流动相a：100％，流动相b：0；
[0040]
时间30min，流动相a：92％，流动相b为8％；
[0041]
时间50min，流动相a：60％，流动相b为40％；
[0042]
时间55.1min，流动相a：100％，流动相b为0；
[0043]
时间65min，流动相a：100％，流动相b为0；
[0044]
检测波长可以为205nm～270nm，如为210nm；
[0045]
梯度洗脱的流速为0.8～1.2ml/min，优选为1.0ml/min。
[0046]
本发明人获得了实际制备的阿糖胞苷前药及其制剂中的有关物质，解析出其结构，并研究了它们的吸收波长。如下表所示，它们的最大吸收波长，基本都在205～220nm，但由于205nm为近波长，梯度洗脱，基线容易不稳定，同时考虑到各成分的响应值，因此本发明人优选出检测波长为210nm。
[0047]
各成分的紫外最大吸收波长
[0048]
成分名称最大吸收波长成分名称最大吸收波长
式1199式6207式2200式7203式3201式8199式4200式9205阿糖胞苷前药199式10200式5199//
[0049]
采用本发明的hplc检测的方法，各有关物质峰之间、阿糖胞苷前药主峰及其相邻有关物质峰之间的分离度均达到了基线分离，专属性良好，如下表所示，本发明的hplc检测的方法灵敏度高、检测限低、线性好。
[0050]
各成分的灵敏度、线性校正因子结果表
[0051][0052]
采用本发明第二方面优选的hplc检测的方法，即检测阿糖胞苷前药有关物质的方法，其包括采用高效液相色谱仪，以反相色谱柱进行梯度洗脱，对洗脱产物进行hplc检测。其中，阿糖胞苷前药可以是阿糖胞苷前药的原料药，也可以是阿糖胞苷前药的制剂。在避强光、保持室温、隔绝氧化剂、无其他诸如酸碱的试剂在附近的条件下，对阿糖胞苷前药(原料药)及其制剂进行长期稳定性试验，采用该hplc检测的方法的结果如以下两个表所示。
[0053]
阿糖胞苷前药(原料药)有关物质稳定性结果
[0054]
[0055]
阿糖胞苷前药制剂有关物质稳定性结果
[0056][0057]
结果表明本发明第一方面的化合物对阿糖胞苷前药及其制剂的储存有非常有利的意义，它们在改进阿糖胞苷前药及其制剂的储存(包括制备过程中的储存)条件中的应用，可以有效避免有关物质的显著提高，即使在长期储存后，阿糖胞苷前药(原料药)的有关物质几乎没有提高，而其制剂的有关物质的提高量也很微小。
[0058]
本发明的有益效果在于，提供了阿糖胞苷前药中的有关物质，不但能用于表征阿糖胞苷前药的质量，而且可以用于显示在实际的生产过程中出现的异常情况，从而用于改善实际的阿糖胞苷前药的原料药或制剂的生产，提高阿糖胞苷前药的药品质量；另外，本发明提供的hplc检测方法能对阿糖胞苷前药及其有关物质基线分离，专属性良好、灵敏度高、检测限低、线性好。
[0059]
为了便于理解，一下将通过具体实施例和附图对本发明进行详细的描述。需要特别指出的是，这些描述仅仅是事例性的描述，并不构成对本发明范围的限制。依据本说明书的论述，本发明的许多变化，改变对所述领域技术人员来说都是显而易见的。
[0060]
另外，本发明引用了公开文献，这些文献是为了更清楚地描述本发明，他们的全文内容均纳入本文进行参考，就好像他们的全文已经在本文中重复叙述过一样
附图说明
[0061]
附图1阿糖胞苷前药有关物质的混合溶液高效液相色谱图。
[0062]
附图2阿糖胞苷前药有关物质的供试品液相色谱图。
[0063]
附图3阿糖胞苷前药制剂有关物质的供试品液相色谱图。
[0064]
附图4阿糖胞苷前药有关物质强制降解色谱图叠加图，其中谱线自上而下，分别代表未破坏溶液、强碱破坏溶液、强酸破坏溶液、氧化破坏溶液、固体加热破坏溶液、溶液加热破坏、光照破坏溶液及遮光破坏溶液。
具体实施方式
[0065]
以下通过实例进一步示例性地说明本发明。如未特别指明，实例中所用的技术用语和描述为本领域技术人员熟知和理解。其中，阿糖胞苷前药(原料药)的制备参照中国专利第200380102686.5号记载的进行，阿糖胞苷前药制剂的制备参照中国专利cn103393709b记载的进行。未合成的化合物均可通过商业渠道购买。
[0066]
实施例1
[0067]
4-氨基-1-([5-o-(2r,4r)-2-氧基-4-(4-吡啶)-1,3,2-二氧磷杂环己烷-2-基]-β-d-阿拉伯呋喃糖基)-2(1h)-嘧啶酮(式5)对照品的生成和制备：
[0068][0069]
在50ml的三口瓶中，加入50g的二甲基丙烯基脲溶液，加入吡啶二醇对映异构体白色固体2g，加入1g的吡啶溶液，氩气保护下，在40℃的水浴中将固体完全溶解，撤去水浴，氩气保护下降至室温(20-25℃)，该溶液标定为a1；再取50ml的单口瓶，加入2g的三氯氧磷溶液，加入0.9g的乙腈溶液，该溶液标定为a2.在氩气保护下，向50ml的三口瓶中加入3.5g的二甲基丙烯基脲溶液，搅拌降温至-25～-20℃，控温不超过-15℃，缓慢同时滴加a1和a2溶液，滴加完毕保温-25
--
20℃反应1.5h。然后向反应体系中一次性加入2g的阿糖胞苷盐酸盐白色固体，升温至0-5℃。反应72h，控温不超过15℃加入2l的纯水，加毕搅拌0.5h；控温不超过15℃，慢慢滴加14％的氢氧化钠溶液，调节ph值为(4.8-5.2)，用二氯甲烷溶液萃取两遍(20l
×
2)；再用14％的氢氧化钠溶液调节ph值为(6.8-7.0)，抽滤，除去机械固体杂质，室温(20-25℃)下搅拌36h析晶；抽滤，滤饼用0.5l的纯水淋洗两遍，柱层析，洗脱液浓缩干燥得到，得到目标化合物0.56g，(c
17
h
21
n4o8p[m h]:441.1,[m na]:443.3)
[0070]
实施例2
[0071]
4-氨基-1-([5-o-(2s,4s)-2-氧基-4-(4-吡啶)-1,3,2-二氧磷杂环己烷-2-基]-β-d-阿拉伯呋喃糖基)-2(1h)-嘧啶酮(式6)对照品的生成和制备：
[0072][0073]
将阿糖胞苷前药的冻干制剂，置放在氯化钠溶液中室温放置30天，将固体化合物溶于水进行采用乙腈-水梯度洗脱，收集主峰后的最大一个峰，浓缩后得到目标化合物0.5g，(c
17
h
21
n4o8p[m h]:441.0,[m na]:463.0,[m k]:478.9)
[0074]
实施例3
[0075]
1-([5-o-(2r,4s)-2-氧基-4-(4-吡啶)-1,3,2-二氧磷杂环己烷-2yl]-β-d-阿拉伯呋喃基)-2,4(1h,3h)-嘧啶二酮(式7)对照品的生成和制备：
[0076][0077]
在50ml的三口瓶中，加入30g的二甲基丙烯基脲溶液，加入吡啶二醇白色固体1.5g，加入1g的吡啶溶液，氩气保护下，在35℃的水浴中将固体完全溶解，撤去水浴，氩气保护下降至室温(20-25℃)，该溶液标定为a1；再取50ml的单口瓶，加入1.8g的三氯氧磷溶液，加入0.5g的乙腈，该溶液标定为a2.在氩气保护下，向50ml的三口瓶中加入3.5g的二甲基丙烯基脲溶液，搅拌降温至-25
--
20℃，控温不超过-15℃，缓慢同时滴加a1和a2溶液，滴加完毕保温-25
--
20℃反应2h。然后向反应体系中一次性加入1g的阿糖尿苷，升温至0-5℃。反应96h，控温不超过15℃加入200ml的纯水，加毕搅拌0.5h；控温不超过15℃，慢慢滴加14％的氢氧化钠溶液，调节ph值为(4.8-5.5)，用二氯甲烷溶液萃取两遍(20l
×
2)；再用14％的氢氧化钠溶液调节ph值为(6.8-7.2)，抽滤，除去机械固体杂质，室温(20-25℃)下搅拌36h析晶；抽滤，滤饼用0.5l的纯水淋洗两遍，柱层析，洗脱液浓缩干燥得到，得到目标化合物0.23g(c
17
h
20
n3o9p[m h]:442.1025)。
[0078]
实施例4
[0079]
4-羟基-1-([5-o-(2r,4s)-2-氧基-4-(4-吡啶)-1,3,2-二氧磷杂环己烷-2yl]-β-d-阿拉伯呋喃糖基)-2(1h)-嘧啶酮(式8)对照品的生成和制备
[0080]
[0081]
将阿糖胞苷前药冻干制剂溶于水，置40℃放置2天，将化合物溶于水，采用乙腈-(40:60)，收集主峰前的一个最大色谱峰，浓缩得到目标化合物8(c
17
h
20
n3o9p[m h]:442.3)
[0082]
实施例5
[0083]
3-(2-氧代-4-吡啶-4-基-2λ5-[1,3,2]二氧磷杂环-2-氧基)-1-吡啶-4-基-1-丙醇(式9)对照品的生成和制备
[0084][0085]
取100ml的四口瓶，加入60g的二甲基丙烯基脲溶液，加入吡啶二醇白色固体20g，加入10.4g的吡啶溶液，氩气保护下，在40℃的水浴中将固体完全溶解，撤去水浴，氩气保护下降至室温(20-25℃)，该溶液标定为a1；再取50ml的单口瓶，加入20g的三氯氧磷溶液，加入9g的乙腈溶液，该溶液标定为a2.在氩气保护下，向250ml的四口瓶中加入35g的二甲基丙烯基脲溶液，搅拌降温至-25℃，控温不超过-15℃，缓慢同时滴加a1和a2溶液，滴加完毕保温-15
±
5℃反应1.5h。然后向反应体系中一次性加入20g的吡啶二醇白色固体，自然升温至0-5℃。控温0-5℃，反应72h。控温不超过15℃加入2l的纯水，加毕搅拌0.5h；控温不超过15℃，用二氯甲烷溶液萃取两遍(200l
×
2)；合并有机相，水洗，饱和氯化钠洗涤，干燥，浓缩，柱层析得到样品c
16
h
19
n2o5p[m h]:351.0。
[0086]
实施例6
[0087]
4-氨基-1-([5-o-(2r,4s)-2-氧基-4-(4-吡啶)-1,3,2-二氧磷杂环己烷-2-基]-β-d-阿拉伯呋喃糖基)-2(1h)-嘧啶酮二聚体(式10，即阿糖胞苷前药二聚体)对照品的生成和制备
[0088][0089]
将阿糖胞苷前药的冻干制剂，置60℃放置两天，将加热后的冻干制剂溶于水，进行制备，采用乙腈-水(20:80)制备，收集主峰前最大的色谱峰，洗脱液浓缩至约20ml，冷冻干燥，得到目标化合物:(c
34
h
42
n8o
16
p2[m h]:880.2194，[m/2 h]:441.1198)
[0090]
实施例7
[0091]
高效液相色谱条件及配置
[0092]
十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱(250mm
×
4.6mm，5μm)，以磷酸盐缓冲液(20mmol/l磷酸二氢铵和2mmol/l磷酸氢二铵溶液)-乙腈(95:5)为流动相a；乙腈为流动相b，，梯度洗脱如下：0min(100％a-0％b)
→
30min(92％a-8％b)
→
55min(60％a-40％b)
→
55.1min
(100％a-0％b)
→
65min(100％a-0％b)；流速为1.0ml/min，进样量为20μl；检测波长为210nm；柱温为30℃。
[0093]
系统适用性试验溶液：分别称取对照品1、2、3、4、5、6、7、8、9约5mg，精密称定，加水分别制成含有各成分约为0.2mg/ml的溶液，作为储备液。另取阿糖胞苷前药对照品40mg，置100ml量瓶中，加水适量使其溶解，然后再分别精密量取上述储备溶液各1ml，置上述100ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，作为混合溶液。
[0094]
试验操作：取混合溶液20μl进样，记录色谱图。
[0095]
典型色谱图见附图1，由附图1可以看出，各有关物质峰之间，有关物质峰与主峰之间均得到了良好的基线分离。
[0096]
实施例8
[0097]
样品的检测
[0098]
十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱(250mm
×
4.6mm，5μm)，以磷酸盐缓冲液(18mmol/l磷酸二氢铵和1.8mmol/l磷酸氢二铵溶液)-乙腈(95:5)为流动相a；乙腈为流动相b，梯度洗脱如实施例1，流速为1.0ml/min，进样量为20μl；检测波长为210nm；柱温为30℃。
[0099]
样品配制：取阿糖胞苷前药冻干粉适量，约相当于阿糖胞苷10mg，精密称定，加加水稀释制成含有阿糖胞苷前药浓度为0.4mg/ml的溶液。
[0100]
取阿糖胞苷前药10mg，精密称定，加水稀释制成含有浓度为0.4mg/ml的溶液，作为阿糖胞苷前药供试品溶液。
[0101]
试验操作：取两个供试品溶液各20μl，分别进样，记录色谱图。
[0102]
典型色谱图见附图2(阿糖胞苷前药冻干粉有关物质色谱图)、附图3(阿糖胞苷前药有关物质色谱图)
[0103]
实施例9
[0104]
强制降解试验溶液配制：
[0105]
未破坏溶液：取阿糖胞苷前药冻干粉适量(约10mg)，精密称定，置25ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，作为未破坏溶液；
[0106]
强碱破坏溶液：取阿糖胞苷前药冻干粉适量(约10mg)，置25ml量瓶中，加1mol/l的氢氧化钠溶液1ml，振摇后马上加1mol/l的盐酸溶液中和，加水稀释至刻度，摇匀，作为强碱破坏溶液。
[0107]
强酸破坏溶液：取阿糖胞苷前药冻干粉适量(约10mg)，置25ml量瓶中，加磷酸溶液1ml，置室温下分别放置17小时，加入1mol/l的氢氧化钠溶液，调节至中性，加水稀释至刻度，摇匀，作为强酸破坏溶液。
[0108]
氧化破坏溶液：取阿糖胞苷前药冻干粉适量(约10mg)，置25ml量瓶中，加30％双氧水1ml，置室温下放置2小时，加水稀释至刻度，摇匀，作为氧化破坏溶液。
[0109]
固体加热破坏溶液：取阿糖胞苷前药冻干粉置85℃烘箱中，加热破坏2h。取加热后阿糖胞苷前药冻干粉适量(约10mg)，置25ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，作为固体加热破坏溶液；
[0110]
溶液加热破坏：取阿糖胞苷前药冻干粉(约10mg)，置10ml试管中，加水1ml溶解，于沸水浴中加热30min，取出放冷至室温，以水溶解，并转移至25ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，作为水溶液加热破坏溶液。
[0111]
光照破坏溶液：取阿糖胞苷前药冻干粉置光照箱，于4500lx灯下放置2天。取光照后的阿糖胞苷前药冻干粉适量(约10mg)，置25ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，作为光照破坏溶液。
[0112]
遮光破坏溶液：取阿糖胞苷前药冻干粉(采用黑纸包装)置光照箱，于4500lx灯下放置2天。取光照后的阿糖胞苷前药冻干粉适量(约10mg)，置25ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，作为遮光破坏溶液。
[0113]
试验操作：取上述溶液各20μl，分别进样，色谱条件如实施例7中所述的色谱条件，记录色谱图。
[0114]
各破坏溶液的色谱图的叠加图，详见附图4，其中，自上而下，分别代表未破坏溶液、强碱破坏溶液(其中式4的化合物显著增加)、强酸破坏溶液(其中式4的化合物显著增加)、氧化破坏溶液(其中式8显著增加)、固体加热破坏溶液(其中式10显著增加)、溶液加热破坏(其中式7和式8均显著增加)、光照破坏溶液(其中式10显著增加)及遮光破坏溶液(其中式10显著增加)。
[0115]
由此，在阿糖胞苷前药中，式4的化合物单独可以用于显示其受到强碱或强酸破坏，表明在阿糖胞苷前药的制备过程中可能有碱性或酸性试剂加入过量或者碱性或酸性试剂未均匀分布而局部浓度过大等情况发生；式7和式8的化合物联合可以用于显示其在溶液中受到高温破坏，表明阿糖胞苷前药的制备过程中可能有温度过高的情况发生；式8的化合物单独可以用于显示其受到氧化破坏，表明阿糖胞苷前药的制备过程中或者储存过程中可能有被氧化的情况发生；式10的化合物单独可以用于显示其在固体状态下受到高温(包括在光照条件和遮光条件下由于光照的热效应而引起的高温)的破坏，表明阿糖胞苷前药的储存过程中可能有温度过高(包括光照强烈引起的温度过高)的情况发生。根据这些结果，在制备阿糖胞苷前药的过程的步骤(2)或制备包含阿糖胞苷前药的组合物的过程的步骤(1)或(3)后，确定换用阿糖胞苷前药继续后续步骤，或者改进在前的制备步骤或者储存条件并重复进行制备。