一株链霉菌JXGZ01及生物药剂、应用的制作方法

一株链霉菌jxgz01及生物药剂、应用
技术领域
1.本发明属于微生物农药技术领域，具体涉及一株链霉菌jxgz01及生物药剂、应用。


背景技术：

2.根结线虫(root
‑
knot nematodes,rkn)是一种以固着式、内寄生为寄生方式的植物寄生性线虫，被评为世界十大植物寄生线虫之首。其寄生范围非常广泛，能侵染几乎所有的维管植物，包括蔬菜、果树、粮食作物和观赏花卉在内的3000多种植物。在当今我国农业生产中，尤其是在保护地设施蔬菜种植过程中，在集约化种植和品牌效应等多种因素的影响下，连茬复种现象广泛存在，为根结线虫的世代繁衍提供了良好的温床，也使得根结线虫病害的发生日益严重。据统计，在辽宁、河北、山东、江苏等地的保护地温室大棚中，1
‑
2年新建大棚根结线虫发病率为16.7
‑
20％，而4年以上的老棚根结线虫发病率可高达87.5％，且随着大棚使用年限的增高，发病的严重程度也逐渐加重。根结线虫主要以二龄幼虫侵染作物根系诱导形成根瘤，影响根的功能，同时其侵染造成伤口和降低植物抗性，也为土传性真菌病害和部分细菌病害的发生(比如枯萎病、根霉菌和根霉菌等)提供了有利条件，导致病害的复合侵染，造成更严重的经济损失。据报道，我国因根结线虫造成的农业损失已高达700亿，蔬菜根结线虫发生面积已经超过2000万亩，我国由根结线虫引起的蔬菜产量减少大约在10
‑
20％，严重地区为30％
‑
50％，甚至高达70％，根结线虫病害已经成为保护地蔬菜种植的头号病害。
3.但是根结线虫防治困难。一是根结线虫生命力顽强，在干燥的作物根蔓中可存活2年，在缺乏寄主的土壤中能够存活2
‑
5年；二是传播途径广泛，能够通过水流、农具操作、种苗等各种方式传播，而且农业生产中常采用大水大肥的方式，而且机械耕作频繁，为根结线虫的传播创造了有利条件；三是抗药性强，根结线虫一旦中毒没有死亡，就会产生很强的抗性，且还能够很快传递给下一代，导致对根结线虫的灭杀能力逐年下降。
4.在对根结线虫的防治方法中，化学防治根结线虫是主要的防治措施并取得明显的防效，但化学防治对人类和环境会造成严重危害，且易使线虫产生抗药性。因此，采用生物防治逐渐成为研究者关注的热点问题，其中筛选微生物拮抗菌等在农业生产中己得到应用并取得一定的效果，在线虫病害防控中发挥巨大作用，越来越受到人们的重视和青睐。


技术实现要素：

5.本发明的目的是解决现有技术的不足，发明人发现了一株链霉菌jxgz01菌株，该菌株相比于现有的其它菌株，对根结线虫二龄幼虫具有更强的致死活性，且对根结线虫卵囊的孵化具有更强的抑制作用，对于作物根结线虫病的防治具有重要的应用价值。该链霉菌jxgz01菌株名称为streptomyces aquilus jxgz01，发明人已于2021年7月13日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，保藏编号为gdmcc no：61804。该菌株的16s rdna序列如seq id no：1所示：
6.gaaccacttcggtggggattagtggcgaacgggtgagtaacacgtgggcaatctgcccttcactctggg
acaagccctggaaacggggtctaataccggatatcactcgcgcaggcatctgtgcgggttgaaagctccggcggtgaaggatgagcccgcggcctatcagcttgttggtgaggtaacggctcaccaaggcgacgacgggtagccggcctgagagggcgaccggccacactgggactgagacacggcccagactcctacgggaggcagcagtggggaatattgcacaatgggcgaaagcctgatgcagcgacgccgcgtgagggatgacggccttcgggttgtaaacctctttcagcagggaagaagcgaaagtgacggtacctgcagaagaagcgccggctaactacgtgccagcagccgcggtaatacgtagggcgcaagcgttgtccggaattattgggcgtaaagagctcgtaggcggcttgtcacgtcgggtgtgaaagcccggggcttaaccccgggtctgcattcgatacgggctagctagagtgtggtaggggagatcggaattcctggtgtagcggtgaaatgcgcagatatcaggaggaacaccggtggcgaaggcggatctctgggccattactgacgctgaggagcgaaagcgtggggagcgaacaggattagataccctggtagtccacgccgtaaacggtgggaactaggtgttggcgacattccacgtcgtcggtgccgcagctaacgcattaagttccccgcctggggagtacggccgcaaggctaaaactcaaaggaattgacgggggcccgcacaagcagcggagcatgtggcttaattcgacgcaacgcgaagaaccttaccaaggcttgacatacaccggaaacggccagagatggtcgcccccttgtggtcggtgtacaggtggtgcatggctgtcgtcagctcgtgtcgtgagatgttgggttaagtcccgcaacgagcgcaacccttgtcctgtgttgccagcatgcccttcggggtgatggggactcacaggagaccgccggggtcaactcggaggaaggtggggacgacgtcaagtcatcatgccccttatgtcttgggctgcacacgtgctacaatggcaggtacaatgagctgcgaaaccgtgaggtggagcgaatctcaaaaagcctgtctcagttcggattggggtctgcaactcgaccccatgaagtcggagttgctagtaatcgcagatcagcattgctgcggtgaatacgttcccgggccttgtacacaccgcccgtcacgtcacgaaagtcggtaacacccgaagccggtggcccaacccc
7.其rpob基因序列如seq id no：2所示：
8.tctgtcccgtgagcgggccggcttcgaggtccgtgacgtgcacccgtctcactacggccgtatgtgcccgatcgagacgcccgaaggcccgaacatcggtctgatcggttcgctcgcctcctacggccgcgtcaacgcgttcggcttcgtggagacgccgtaccgcaaggtcgtcgacggtgtcgtcaccgacgaggtcgactacctgacggccgacgaagaggaccgattcgtcatcgcgcaggccaacgccacgctcgacgacggcatgcgcttcaccgagaaccgcgtcctggtccgccgccgtggcggcgaggtcgactacgtccccggtgacgacgtggactacatggacgtctcgccgcgccagatggtgtcggtcgcgaccgccatgatcccgttcctcgagcacgacgacgccaaccgtgccctcatgggcgcgaacatgatgcgtcaggccgtgccgctgattaagtccgagtccccgctcgtcggcaccggcatggagtaccgctccgccgtcgacgccggcgacgtggtcaaggccgagaaggcgggtgtggtccaggaggtctccgcggactacatcaccacggccaacgacgacggcacgtacatcacgtaccgcctggccaagttcgcccgctccaaccagggcacctcggtcaaccagaagg
9.链霉菌jxgz01菌株和/或其发酵液可用于制备防治根结线虫的生物药剂中。发酵液的制备过程为：将菌落于挑至高氏一号培养基中200rpm培养96h，然后1000rpm离心10min，上清液用0.22μm细菌过滤膜过滤得到。其中，高氏一号培养基包括：可溶性淀粉20g，kno
3 1g，nacl 0.5g，k2po4·
3h2o 0.5g，mgso4·
7h2o 0.5g，feso4·
7h2o 0.01g，琼脂15
‑
20g，蒸馏水1000ml，调节ph值至7.2
‑
7.4。
10.本发明的有益效果为：本发明发现的链霉菌jxgz01菌株对根结线虫二龄幼虫具有更强的致死活性，且对根结线虫卵囊的孵化具有更强的抑制作用，对于作物根结线虫病的防治具有重要的应用价值，能够广泛应用于根结线虫病的防治生物药剂的制备当中。
附图说明
11.图1所示为链霉菌jxgz01菌株在高氏一号培养基上的形态，a为正面，b为反面；
12.图2所示为链霉菌jxgz01菌株在光学显微镜下的照片；
13.图3所示为链霉菌jxgz01菌株基于16s rdna序列构建的系统发育树。
具体实施方式
14.以下将结合实施例和附图对本发明的构思及产生的技术效果进行清楚、完整的描述，以充分地理解本发明的目的、方案和效果。
15.实施例1：
16.streptomyces aquilus jxgz01的分离与筛选：
17.发明人于2020年11月采集江西省赣州市于都县山药种植区0～20cm深度土壤，做好标记后放入自封袋中，带回实验室4℃保存备用。采用稀释平板涂布法，称取新鲜保存的土样10g，倒入含90ml无菌水和10粒直径5mm玻璃珠的250ml锥形瓶中，放入28℃摇床中震荡30min混匀，使微生物细胞分散，静置20
‑
30s，即为10
‑1稀释液，然后取0.1ml锥形瓶中混匀的土壤悬浊液加入到含有0.9ml无菌水的2ml离心管中，吹吸混匀，得到10
‑2土壤稀释液，以此类推，连续稀释得到10
‑3和10
‑4土壤悬浊稀释液。取10
‑4土壤悬浊稀释液进行涂板，所用固体培养基为高氏一号培养基(可溶性淀粉20g，kno
3 1g，nacl 0.5g，k2po4·
3h2o 0.5g，mgso4·
7h2o 0.5g，feso4·
7h2o 0.01g，琼脂15
‑
20g，蒸馏水1000ml，调节ph值至7.2
‑
7.4)，将涂好的平板放置于桌面上20
‑
30min，使菌液渗入培养基，然后将平板倒置于28℃恒温培养箱中培养。待长出放线菌菌落后，在无菌环境下，将平板上长出的放线菌单菌落用灭菌的移植钩转入新的培养基平板进行继代培养2
‑
3代，直到菌株纯化为止。利用上述方法，通过筛选获得菌株编号为jxgz01的streptomyces aquilus。发明人已于2021年7月13日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为gdmcc no.61804，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，广东省科学院微生物研究所。
18.实施例2：
19.streptomyces aquilus jxgz01的鉴定：
20.(1)形态学特征：用插片法培养5、7、10天后观察：streptomyces aquilus jxgz01菌株的分生孢子丝长，直链或柔曲，孢子短柱形，表面光滑；在高氏一号琼脂培养基(如图1所示)、酵母精麦芽精琼脂培养基(isp2)、燕麦粉琼脂培养基(isp3)、无机盐淀粉琼脂培养基(isp4)和甘油天冬素琼脂培养基(isp5)上培养，气生菌丝体均呈白色，基质菌丝体浅黄色或黄色至棕黄色，在以上培养基上均无可溶性色素产生。jxgz01菌株在光学显微镜下的照片如图2所示。
21.表1菌株jxgz01的培养特征
22.培养基气生菌丝体基质菌丝体可溶性色素高氏一号琼脂培养基白色浅黄色无酵母精麦芽精琼脂培养基(isp2)白色黄色至棕黄色无燕麦粉琼脂培养基(isp3)白色黄色至棕黄色无无机盐淀粉琼脂培养基(isp4)白色浅黄色无甘油天冬素琼脂培养基(isp5)白色浅黄色无
23.(2)生理特性：对菌株jxgz01的碳源进行筛选，结果如表2所示：该菌株对蔗糖、甘露醇、棉籽糖、木糖和核糖均能利用；能够使明胶液化，使牛奶凝固和胨化，亦可还原硝酸盐和水解淀粉，能产生黑色素和硫化氢。
24.表2菌株jxgz01的生理生化特征
[0025][0026][0027]
注：“ ”为阳性结果。
[0028]
(3)分子生物学特性：将得到的菌株jxgz01在高氏一号固体培养基上培养7d后，在超净工作台中用无菌枪头挑取代表菌株菌团块至2ml无菌离心管中，利用植物dna提取试剂盒(通用型)提取其dna。分别利用27f(agtttgatcmtggctcag)，1492r(ggtt accttgttacgactt)和rpo b
‑
5':atcaacatc
‑
cggccgg tggt
‑
3'，rpo b
‑
3':gg tttc gatcgggca
‑
catcc
‑
5'为引物，试验菌株为模板，扩增其16s rrna基因和rpo b基因并纯化测序。并采用mega软件，基于16s rdna序列，邻接法构建系统发育树，1000次重复计算，节点显示bootstrap值大于50％数值，上标“t”表示模式菌株。
[0029]
streptomyces aquilus jxgz01的16s rdna的序列如seq id no：1所示；rpob基因测序序列如seq id no：2所示。
[0030]
菌株jxgz01测序得到的16s rrna序列为1362bp，用blast程序在genebank与已登录的序列进行核酸同源性比较，该菌的16s rrna序列与streptomyces cyaneochromogenes的同源性达99.63％，与streptomyces griseoruber(灰红链霉菌)和streptomyces aquilus的同源性均达99.38％；测序得到的rpo b基因序列为677bp，用blast程序在genebank与已登录的序列进行核酸同源性比较，该菌的rpo b基因序列与streptomyces aquilus的同源性达99.56％；系统进化树的分析结果也表明该菌与streptomyces aquilus遗传距离更接近(如图3所示)。
[0031]
结合菌落形态学特征、生理生化特征及分子生物学特性，明确菌株jxgz01为streptomy ces aquilus jxgz01。
[0032]
实施例3：
[0033]
streptomyces aquilus jxgz01发酵液的制备：
[0034]
将菌株jxgz01于无菌条件下接种到实施例1中的9cm高氏一号固体培养基上，25℃黑暗培养4d左右即可长出使用。挑取平板上生长良好的单菌落于100ml改良的高氏一号液体培养基中，200rpm摇床培养96h后制成放线菌菌悬液，10000rpm离心10min，取上清液用0.22μm细菌过滤膜过滤即制成菌株jxgz01的发酵液。同时摇瓶空白液体高氏一号培养基(无菌株)、离心、过0.22μm滤膜后作为对照，4℃保存备用。
[0035]
实施例4：
[0036]
streptomyces aquilus jxgz01发酵液杀根结线虫的作用测定：
[0037]
(1)根结线虫的培养
[0038]
收集受南方根结线虫侵染的黄瓜根系，用水轻轻冲洗，小心取下卵囊。放入1％次氯酸钠溶液中消毒3min，再用无菌水冲洗3次，放入内有少量无菌水的培养皿里，置于25℃恒温中培养，每隔24h收集一次新孵化的南方根结线虫2龄幼虫，置于4℃冰箱保存备用。
[0039]
(2)对比菌株
[0040]
淡紫褐链霉菌(streptomyces enissocaesilis)：购买自中国普通微生物菌种保藏管理中心的根结线虫生防菌株，保藏号为cgmcc 4.1586。
[0041]
jz
‑
1菌株和jz
‑
2菌株：发明人在筛选streptomyces aquilus jxgz01菌株时，一同发现的其它链霉菌属菌株。
[0042]
(3)杀线虫作用测定
[0043]
将实施例3中的菌株jxgz01发酵液500μl分别加入到24孔细胞培养板中，并加入500μl南方根结线虫悬液(30
‑
100条)，进行毒力测定。以目前现有的根结线虫生防菌株淡紫褐链霉菌和相同方法筛选到的jz
‑
1菌株和jz
‑
2菌株为对比菌株，以无菌水和高氏一号空白液体培养基(g
‑
ck)为对照，每组处理4次重复。放入25℃培养箱中，24h后记录线虫死亡情况，针触法判断线虫死活，计算校正死亡率。线虫致死率＝死亡线虫/供试线虫总数
×
100％；校正死亡率(％)＝(处理线虫死亡率－对照线虫死亡率)/(1－对照线虫致死率)
×
100％，死亡线虫是指在物理刺激条件下不运动的线虫，每个时间点进行4个生物学重复。
[0044]
结果：如表3所示，菌株jxgz01发酵液处理24h后，线虫基本均呈僵直死亡状态，针刺不动，校正死亡率达95.85％，而对比菌株jz
‑
1菌株、jz
‑
2菌株和淡紫褐链霉菌的校正死亡率分别仅为16.13％、15.16％和36.26％。由此表明，菌株jxgz01发酵液对南方根结线虫二龄幼虫的毒杀作用明显优于对比菌株。
[0045]
表3 streptomyces aquilus jxgz01发酵液对南方根结线虫二龄幼虫的作用效果
[0046]
[0047][0048]
注：平均死亡率以均值
±
标准误差表示，同列不同字母表示处理间差异显著(p<0.05)。
[0049]
实施例5：
[0050]
菌株jxgz01发酵液对根结线虫卵囊孵化的作用测定：
[0051]
将实施例3中的菌株jxgz01发酵液2.5ml加入到无菌培养皿(直径6cm)中，并加入2.5ml无菌水，使菌悬液的稀释倍数为2
×
，再每皿加入20个颜色相近、大小相同消毒后的卵囊，以等体积淡紫褐链霉菌、jz
‑
1菌株和jz
‑
2菌株为对比菌株，以等体积高氏一号液体培养基和无菌水为对照，每个处理重复3次，放入28℃培养箱于24h后统计卵囊孵化出的线虫数，计算卵囊孵化的相对抑制率。相对抑制率(％)＝(对照卵囊孵化线虫数
‑
处理卵囊孵化线虫数)/对照卵囊孵化线虫数
×
100。
[0052]
结果如表4所示：菌株jxgz01发酵液2倍稀释液对根结线虫的卵囊孵化相对抑制率达68.29％，对比菌株jz
‑
1菌株、jz
‑
2菌株和淡紫褐链霉菌对根结线虫的卵囊孵化相对抑制率仅为27.24％、22.65％和46.85％。由此表明，菌株jxgz01发酵液对对根结线虫卵囊的孵化具有更强的抑制作用，且抑制作用显著优于对比菌株jz
‑
1菌株、jz
‑
2菌株和淡紫褐链霉菌。
[0053]
表4 streptomyces aquilus jxgz01发酵液对南方根结线虫卵囊孵化的抑制作用
[0054][0055]
注：抑制率以均值
±
标准误差表示，同行不同字母表示处理间差异显著(p<0.05)。
[0056]
综上所述，streptomyces aquilus jxgz01发酵液不仅对根结线虫二龄幼虫具有强烈的毒杀作用，也可在很大程度上抑制卵囊的孵化率，对作物根结线虫病的防治具有重要的应用价值。
[0057]
以上所述，只是本发明的较佳实施例而已，本发明并不局限于上述实施方式，只要其以相同的手段达到本发明的技术效果，都应属于本发明的保护范围。在本发明的保护范
围内其技术方案和/或实施方式可以有各种不同的修改和变化。