环状RNAhsa_circ_0001741的表达载体、重组工程菌及其应用的制作方法

环状rna hsa_circ_0001741的表达载体、重组工程菌及其应用
技术领域
1.本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及环状rna hsa_circ_0001741的表达载体、重组工程菌及其应用。


背景技术：

2.肾细胞癌(renal cell carcinoma,rcc)是常见的恶性肿瘤之一，全球每年大约有35万人被诊断为肾细胞癌who根据肿瘤细胞起源及其基因改变等特点将肾细胞癌分为透明细胞癌、乳头状细胞癌、嫌色细胞癌、集合管癌和未分类肾细胞癌等。肾透明细胞癌(clear cell renal cell carcinoma，ccrcc)是临床上最常见的肾脏恶性肿瘤，其中约70％的肾细胞癌为肾透明细胞癌(ccrcc)。手术切除是目前治疗肾癌有效的方法，但仍有近1/3的肾癌患者在确诊时已发生远处转移，20％～40％手术后会出现复发并发展为转移性肾癌。转移性肾癌对传统的放、化疗及内分泌治疗均不敏感，患者预后差。
3.环状rna(circular rna)是非编码rna的一种，是一类首尾共价结合的、既无5’端帽子结构也无3’端多聚腺嘌呤尾的环状结构。随着高通量测序技术逐渐被运用到生命科学与医学研究中，越来越多的环状rna被发现，其在疾病特别是恶性肿瘤的发病中发挥重要作用，是潜在的治疗新靶点和诊断标志物。目前已有部分研究者关注环状rna在ccrcc中异常表达，及其与ccrcc发生发展和转移的关系，提示它们在ccrcc的诊断、预后和治疗中具有广阔的应用前景。


技术实现要素：

4.一种环状rna hsa_circ_0001741位于7号染色体(chr7):128655032
–
128658211，其亲本基因为线性tnpo3基因，有报道hsa_circ_0001741与卵巢癌耐药性相关。本发明在研究中发现hsa_circ_0001741在ccrcc表达下降，且验证了hsa_circ_0001741在ccrcc发生发展中的作用，并进一步提供了一种制备新型ccrcc治疗药物的构思。
5.本发明首先提供了一种环状rna hsa_circ_0001741的表达载体，其包含连接到环状rna表达质粒中的环状rna表达序列；所述环状rna表达序列为与基因tnpo3的2、3和4号外显子依次连接的核苷酸序列相似度90％以上的脱氧核苷酸序列。
6.在根据本发明的一个实施方案中，所述环状rna表达序列为seq id no:1
7.gttcatgcatgggagatctcagaccagttgttacagatccggcaggatgtggagtcatgctattttgctgcacagaccatgaaaatgaagattcagacctcattttatgagctccccacagactctcatgcctctttacgggactcattgctaacccatatccagaacttgaaagacttgtcacctgttattgtaacgcagctggctttagcaatagcagatcttgccctacagatgccttcctggaagggatgtgtgcaaacactggtggaaaaatacagcaatgatgtgacttctttgccttttttgctggagatccttacagtgttacctgaagaagtacatagtcgttccttacgaattggagctaatcggcgcacagaaattatagaagatttggccttctactctagtacagtagtatctctattg。
8.在根据本发明的一个实施方案中，所述环状rna表达质粒选自pcd
‑
cir、pcd2.1
‑
cir、plc5
‑
cir、plcdh
‑
cir、plo
‑
cir、pce
‑
rb
‑
mam、pcdna3.1( )circrna mini vector等环状rna过表达载体中的任一种。
9.本发明的另一方面提供了表达上述环状rna hsa_circ_0001741的表达载体的制备方法，包括：
10.1)以人类基因组cdna为底物，以基因tnpo3的2、4号外显子的配对序列为模板设计引物对，并通过pcr扩增获得环状rna表达序列；
11.2)将所述环状rna表达序列连接到环状rna表达质粒中，即得hsa_circ_0001741的表达载体。
12.在根据本发明的一个实施方案中，所述引物对的两条引物中分别添加特定限制性酶切位点，所述特定限制性酶切位点配合于环状rna表达质粒中的酶切位点。
13.在根据本发明的一个实施方案中，所述引物对为seq id no:2和seq id no:3；所述限制性酶切位点为kpnⅰ和bamhⅰ；所述环状rna表达质粒优选为pcd
‑
cir载体。
14.本发明进一步提供了一种扩增hsa_circ_0001741的表达载体的重组工程菌，包含上述的表达载体；受体细胞可以是原核受体细胞或真核受体细胞，原核受体细胞优选为大肠杆菌，真核受体细胞优选为酵母菌；本发明中优选为大肠杆菌dh5α感受态细胞。
15.本发明还提供了环状rnahsa_circ_0001741或者上述的表达载体在制备用于肾细胞癌诊断、治疗或预后的药物中的应用。
16.进一步地，本发明还提供了一种用于诊断肾细胞癌的诊断试剂，包含用于检测试样中hsa_circ_0001741表达量的引物对或探针；优选地，引物对为seq id no:4和seq id no:5；更优选地通过实时荧光定量pcr进行表达量检测。
17.进一步地，本发明还提供了一种用于肾细胞癌预后或治疗的药物，其包含hsa_circ_0001741或者上述的表达载体，以及靶向给药载体；优选地，所述靶向给药载体选自脂质体、微球、微囊、纳米粒或纳米囊。
18.本发明的上述技术方案的有益效果如下：
19.本发明通过利用pcd
‑
cir载体构建hsa_circ_0001741过表达载体，转染进ccrcc肿瘤细胞后，可显著抑制肾癌细胞的转移，其次通过合成hsa_circ_0001741的sirna，并在ccrcc肿瘤细胞中转染后，发现敲低hsa_circ_0001741能显著增加肾癌细胞的迁移和增殖能力，这表明hsa_circ_0001741能够有效地抑制ccrcc细胞的迁移和增殖，因此hsa_circ_0001741在作为肾癌转移病人的治疗和预后方面具有广泛的前景。
附图说明
20.图1为hsa_circ_0001741结构示意图和荧光定量pcr检测hsa_circ_0001741的图谱，其中a为hsa_circ_0001741结构图，b为荧光定量pcr检测hsa_circ_0001741的图谱。
21.图2为鉴定hsa_circ_0001741的环状rna特性的检测图谱；其中a为ribonuclease r(rnase r)消化实验结果图；b为oligo dt引物逆转录实验结果图；c为基因组扩增实验结果图；d为放线菌素d实验结果图；e为sanger测序鉴定hsa_circ_0001741成环检测图谱。
22.图3为hsa_circ_0001741在ccrcc肿瘤组织中显著性低表达检测图谱；其中，a～b为：hsa_circ_0001741在ccrcc组织中的表达。
23.图4为验证hsa_circ_0001741对ccrcc肿瘤细胞影响的结果图谱；其中，a～c为
ccrcc肿瘤细胞中干扰或过表达hsa_circ_0001741后，对细胞迁移能力的影响；d为ccrcc细胞中稳转干扰hsa_circ_0001741后对细胞增殖能力的影响。
具体实施方式
24.为使本发明要解决的技术问题、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图及具体实施例进行详细描述。
25.本发明使用到的试剂
26.实施例1荧光定量pcr检测hsa_circ_0001741的表达
27.1、设计hsa_circ_0001741引物，引物序列为：
28.f：taatcggcgcacagaaatta(seq id no:4)
29.r：aatagcatgactccacatcctg(seq id no:5)
30.荧光定量pcr和琼脂糖凝胶电泳验证引物特异性，具体步骤如下：
31.1)荧光定量pcr反应体系：
32.10μl体系，sybr 5.0μl、forward primer(5μm)0.5μl、reverse primer(5μm)0.5μl、ddh2o 2.0μl、cdnas 2.0μl。
33.2)反应条件：
34.95℃，30s；
35.95℃，10s(40个循环)；
36.58℃，10s；
37.72℃，10s，循环在72℃时采集荧光。
38.采集溶解曲线，从60℃升至95℃过程中，每个循环增加0.5℃，共71个循环。
39.2、琼脂糖凝胶电泳：
40.1)配制2％琼脂糖凝胶：
41.按照琼脂糖：tae＝1g：50ml比例配制混合后，微波炉里加热至溶液澄清，加入核酸染料(10000x)，核酸染料工作液浓度为1x，混匀后将混合液倒入模具中，待液体冷却凝固后将其取出置于电泳仪中。
42.2)电泳：
43.取上述荧光定量pcr产物，每孔加入1ul 10x loading buffer混匀后上样，电泳120v，30min。电泳结束后取出凝胶进行显影。
44.3)结果：
45.由图1可见，根据hsa_circ_0001741结构设计的引物，琼脂糖凝胶电泳显示产物大小在100bp
‑
150bp之间，与预期的128bp相符。
46.实施例2鉴定hsa_circ_0001741的环状rna特性
47.1、ribonuclease r(rnase r)消化鉴定hsa_circ_0001741成环：
48.trizol法提取caki
‑
1、rcc
‑
jf细胞总rna后，按下列体系消化：
49.1)消化体系：
50.mock组：10
×
buffer 1.5μl、rna 5μg、ddh2o up to 15μl；
51.rnase r组：10
×
buffer 1.5μl、rna 5μg、rnase r 6u、ddh2o up to15μl。
52.2)反应条件：
53.37℃，10min；85℃，5s；4℃保存。
54.消化后，取5μl产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，检测rna消化效果。另取5μl消化后产物，按下列体系进行逆转录：
55.10μl体系，5
×
primescript buffer 2μl、random 6mers(100μm)2.5μl
56.enzyme 0.5μl、rna 5μl。
57.反应条件：
58.37℃，15min；
59.85℃，5s；
60.4℃保存。
61.向逆转录产物中加入40μl无核酶水进行稀释后，按下列体系定量检测hsa_circ_0001741和gapdh的表达(染料法)，每组三个复孔。10μl体系，sybr 5.0μl、forward primer(5μm)0.5μl、reverse primer(5μm)0.5μl、ddh2o 2.0μl、cdnas 2.0μl。
62.反应条件：
63.95℃，30s；
64.95℃，10s(40个循环)；
65.58℃，10s；
66.72℃，10s，循环在72℃时采集荧光。
67.采集溶解曲线，从60℃升至95℃过程中，每个循环增加0.5℃，共71个循环。
68.合成引物序列
69.引物名称seq id no.序列5
’‑3’
linear
‑
tnpo3
‑
f6agatcttgccctacagatgccttlinear
‑
tnpo3
‑
r7aatttctgtgcgccgattagctcgapdh
‑
f8ccactcctccacctttgacgapdh
‑
r9accctgttgctgtagcca
70.2、oligo dt引物逆转录及sanger测序鉴定hsa_circ_0001741成环：
71.1)以相同rna样品按下列分组进行逆转录(10ul体系)：
72.组一：5
×
primescript buffer 2μl、random 6mers(100μm)2.5μl、enzyme 0.5μl、h2o up to 10μl；
73.组二：5
×
primescript buffer 2μl、oligo dt primer(50μm)2.5μl、enzyme 0.5μl、h2o up to 10μl。
74.2)反应条件：
75.37℃，15min；85℃，5s；4℃保存。
76.向逆转录产物中加入40μl无核酶水进行稀释。
77.3、按下列体系定量检测hsa_circ_0001741和线性tnpo3的表达(染料法)：
78.10μl体系，sybr 5.0μl、forward primer(5μm)0.5μl、reverse primer(5μm)0.5μl、ddh2o 2.0μl、cdnas 2.0μl。
79.反应条件：
80.95℃，30s；
81.95℃，10s(40个循环)；
82.58℃，10s；
83.72℃，10s，循环在72℃时采集荧光。
84.采集溶解曲线，从60℃升至95℃过程中，每个循环增加0.5℃，共71个循环。
85.3)将随机引物逆转录后得到的最终pcr产物进行sanger测序。
86.4、基因组扩增实验鉴定hsa_circ_0001741成环：
87.dna提取试剂盒(离心柱型)(天根)提取caki
‑
1、rcc
‑
jf细胞dna：
88.1)胰酶消化caki
‑
1、rcc
‑
jf细胞，洗涤后500g离心5min并弃上清；加入200μl缓冲
液ga，充分混匀。
89.2)加入20μl蛋白酶k，混匀；加入200μl缓冲液gb，颠倒混匀，70℃孵育10min后瞬时离心；加人200μl无水乙醇，充分振荡混匀15s，瞬时离心。
90.3)将裂解物转移至吸附柱中，室温下12000rpm离心30s，弃上清；向吸附柱中加入500μl缓冲液gd，室温下12000rpm离心30s，弃上清。
91.4)向吸附柱cb3中加入600μl漂洗液pw，室温下12000rpm离心30s，弃上清，重复一次；空柱12000rpm离心2min后弃废液，室温干燥5min。
92.5)将吸附柱转入新的ep管中，加入50μl洗脱液，室温放置5min后12,000rpm离心2min，将溶液收集到离心管中，即为caki
‑
1、rcc
‑
jf细胞的总dna。
93.6)用nanodrop one测定dna的浓度及质量。
94.5、按下列反应体系进行常规pcr，分别检测hsa_circ_0001741和线性tnpo3的表达：
95.10μl体系，rtaq 5.0μl、forward primer(5μm)0.5μl、reverse primer(5μm)0.5μl、ddh2o 2.0μl、cdnas/gdnas 2.0μl。
96.反应条件：
97.95℃，3min；
98.95℃，30s(40个循环)；
99.58℃，30s；
100.72℃，1min；
101.72℃，5min；
102.4℃，∞。
103.将上述pcr产物进行2％琼脂糖凝胶电泳。
104.6、放线菌素对hsa_circ_0001741稳定性的影响：
105.1)将caki
‑
1、rcc
‑
jf细胞铺于12孔板，2.5
×
105个/孔。
106.2)过夜培养待细胞贴壁后，加入放线菌素(2μg/ml)，对照组加入相同体积的dmso，继续培养。
107.3)放线菌素作用0h，3h，6h，12h后，分别提取细胞总rna，qrt
‑
pcr检测hsa_circ_0001741、线性tnpo3的表达情况。
108.7、结果：
109.如图2所示，rnase消化后hsa_circ_0001741较其亲本基因linear
‑
tnpo3更能抵抗rnase的消化，证明hsa_circ_0001741更稳定；oligo dt引物逆转录实验证明oligo dt能够逆转录线性基因但不能逆转出hsa_circ_0001741，证明与linear
‑
tnpo3相比hsa_circ_0001741缺少poly a尾巴，故而oligo dt逆转录产物无法检测出hsa_circ_0001741；基因组扩增实验进一步说明了hsa_circ_0001741的成环，故而在基因组dna中使用hsa_circ_0001741的引物无法扩增出产物；放线菌素d实验证实hsa_circ_0001741较linear
‑
tnpo3更加稳定，且sanger测序结果证实hsa_circ_0001741的成环。
110.实施例3hsa_circ_0001741在ccrcc肿瘤组织中显著性低表达，且与肿瘤分级相关
111.1、提取组织或细胞总rna：
112.1)将肾癌及癌旁组织从液氮中小心取出，剪碎，放入含有1ml trizol的组织匀浆
管中。做好标记，置于冰上预冷。
113.2)将含有trizol及组织样品的匀浆管对称置于组织匀浆仪中。设置参数为震荡5000rpm，15s。一次作用完成后取下匀浆管置于冰上大于2min，至温度冷却。
114.3)重复2)中步骤至少2次，直至组织基本破碎。
115.4)吸取不含组织碎片的裂解液至新的无酶1.5ml ep管中。细胞rna提取从此步骤开始，后续步骤相同。
116.5)向trizol
‑
组织/细胞裂解液中加入200μl氯仿，涡旋30s后，置于室温作用10min。然后12000rpm，4℃，离心15min。
117.6)离心结束后，小心吸取不含白膜层的上清置于新的ep管中，加入等体积异丙醇，立刻颠倒混匀后，室温作用10min。然后12000rpm，4℃，离心10min。
118.7)离心结束后，观察ep管地底部是否出现白色沉淀，小心弃去上清，加入1ml 75％乙醇洗涤。然后7500rpm，4℃，离心5min。
119.8)重复7)一次后，小心弃上清，室温下待乙醇挥发完全后加入一定体积的无核酶水。分装后保存于
‑
80℃。
120.2、组织或细胞rna质量及浓度鉴定:
121.1)开启nanodrop one仪器，待机器自检完成后，点击rna。
122.2)用无核酶水进行空白检测后，各个样本取1μl测定。观察并记录rna浓度及a260/280，a260/230比值。
123.3)测量结束后，用无核酶水清洗仪器后，退出测量界面，关闭仪器。
124.组织rna按下列体系进行mrna逆转录：
125.10μl体系，5
×
primescript buffer 2μl、oligo dt primer(50μm)0.5μl、random 6mers(100μm)0.5μl、enzyme 0.5μl、rna 1μg、ddh2o up to 10μl。反应条件：37℃，15min；85℃，5s；4℃保存。
126.向逆转录产物中加入40μl无核酶水进行稀释。
127.按下列体系定量检测hsa_circ_0001741的表达(染料法)：
128.10μl体系，sybr 5.0μl、forward primer(5μm)0.5μl、reverse primer(5μm)0.5μl、ddh2o 2.0μl、cdnas 2.0μl。
129.反应条件：
130.95℃，30s；
131.95℃，10s(40个循环)；
132.58℃，10s；
133.72℃，10s，循环在72℃时采集荧光。
134.采集溶解曲线，从60℃升至95℃过程中，每个循环增加0.5℃，共71个循环。
135.3、结果：
136.如图3所示，hsa_circ_0001741在ccrcc肾癌组织中显著性低表达，数据分析后发现下调达2倍以上，根据肾癌组织的临床信息整理后可见hsa_circ_0001741与肿瘤的分级相关，肿瘤分级越高hsa_circ_0001741表达越低。
137.实施例4构建hsa_circ_0001741的过表达载体和干扰sirna
138.1、hsa_circ_0001741过表达载体构建：
139.1)引物设计：
140.根据基因信息找出基因序列。根据载体多克隆位点的酶切位点，选择合适的酶切位点加在引物的5’端。根据pcd
‑
cir载体上的酶切位点，选取了kpnⅰ和bamhⅰ两个酶进行酶切实验。
141.hsa_circ_0001741的克隆引物序列如下：
142.f(seq id no:2):
143.ggggtacctgaaatatgctatcttacaggttcatgcatgggagatctca
144.r(seq id no:3):
145.cgggatcctcaagaaaaaatatattcaccaatagagatactactgtac
146.2)按以下反应进行扩增目的片段：
147.primestar max premix(2
×
)25μl、f
‑
primer(10μm)2μl、r
‑
primer(10μm)2μl、模板cdna 2μl、ddh2o add to 50μl。
148.反应条件：
149.98℃预变性2min
→
32
‑
34个扩增循环(98℃变性10s
→
56℃退火15s
→
72℃延伸30～60s(10s/kb)
→
72℃后延伸10min，pcr产物进行1％琼脂糖凝胶电泳(150v，20～30min)后于紫外光下观察结果，切胶回收目的片段。
150.3)胶回收：
151.试验中所有目的片段和骨架载体的回收纯化均按照胶回收试剂盒的使用说明操作(以擎科ge0101
‑
200胶回收试剂盒为例)：
152.将目的dna片段用干净的手术刀切下，放入1.5ml离心管中(避免长时间的紫外照射)；加入500μl buffer gl，65℃水浴5min，其间温和上下翻转离心管，至胶完全融化；在吸附柱ec中加入250μl buffer bl，12000g，离心1min，弃废液；将离心管中溶液转入吸附柱中，12,000g，离心1min；去废液，加入700μl buffer w2，12,000g，离心1min；重复前一步骤，弃废液，12,000g，空离2min；将吸附柱放入新的干净的1.5ml离心管中，室温静置2min；于膜中央加入适量(35～50μl)60～65℃预热的ddh2o，室温静置3min，12,000g,离心2min。离心管内液体即为回收的dna目的片段，可立即使用或储存于
‑
20℃。
153.4)表达载体骨架及粘性片段制备：
154.按照以下体系对表达载体以及3)中回收的片段进行双酶切，10
×
k buffer(2
×
)5μl、bamhⅰ2.5μl、kpnⅰ2.5μl、载体(15～20μg)/片段(全部)、ddh2o up to 50μl。37℃水浴4h后，片段通常使用pcr清洁回收，载体骨架进行1％琼脂糖凝胶电泳后于紫外光下观察结果，切胶回收目的片段。胶回收步骤同前。
155.5)连接反应：
156.目的片段和载体骨架的连接选用takara公司的连接试剂盒solution i。反应体系如下：solμtion i 5μl、载体骨架1μl、胶回收产物4μl、16℃(pcr仪/水浴锅)，连接2h。
157.6)质粒或连接产物转化大肠杆菌dh5α感受态细胞：
158.自
‑
80℃冰箱中取出感受态细胞，置于冰上融解；将待转化的连接产物(5～15μl)加入到感受态细胞中，轻柔混匀，冰浴15～30min；42℃，热激80～90s；立即冰上2min；在超净工作台中，每管加400～800μl空lb培养基，置于37℃，200r/min摇床，孵育30～45min；12,000g，离心1min；弃上清，剩余50～100μl液体重悬菌体，并转移到含有相应抗生素的lb固体
培养基上，用灭菌涂布棒涂布均匀；37℃倒置培养，12～16h后可出现单菌落。
159.7)大肠杆菌质粒的小量提取(康为世纪去内毒素小提试剂盒)：
160.挑取一单菌落，接种于含有5ml液体lb培养基的15ml离心管中，37℃，200r/min振荡培养过夜(16～18h)；将细菌用12,000g离心1min，弃尽上清；将细菌沉淀重悬于250μl的buffer p1；加入250μl buffer p2，轻柔颠倒离心管数次，室温静置3～5min；加入250μl buffer e3，轻柔颠倒离心管数次，室温静置5min；12,000g离心5min，转移上清液至endo
‑
remover fm吸附柱中，12,000g离心1min；向spin columns dm吸附柱加入200μlps，12,000g离心1min；向已经去除内毒素的溶液中加入225μl异丙醇，混匀后，加入spin columns dm吸附柱中，12,000g离心1min；加入700μlbuufer pw，12,000g离心1min；弃废液，12,000g空离2min；将吸附柱置于干净1.5ml离心管中，开盖室温静置5min；加入50～100μl 65℃预热的ddh2o于吸附膜上，室温静置5min，12,000g离心2min，
‑
20℃保存备用。
161.8)将提取好的质粒进行测序检测。
162.2、hsa_circ_0001741的过表达载体和sirna转染细胞实验：
163.1)铺板：
164.将状态良好的细胞按照每孔(6孔板)4
×
105cells进行铺板(注意：根据细胞大小不同调节铺孔数目)；
165.2)质粒/sirna转染：
166.贴壁培养24h后，根据质粒浓度计算质粒体积(6孔板应加质粒质量为2μg)。根据转染步骤分为a、b两个体系：a：200μl opti
‑
mem 5μl lipo2000；b：200μl opti
‑
mem xμl质粒，a体系混匀后静置5min；将b体系加入至a体系中，混匀后静置15min；sirna转染(sirna是由吉玛公司合成)：贴壁培养24h后，根据下列体系混合转染试剂：a：200μl opti
‑
mem 5μllipo 2000；b：200μl opti
‑
mem 5μlsirna，a体系混匀后静置5min；将b体系加入至a体系中，混匀后静置15min；
167.3)弃掉6孔板中的培养基，每孔加入1.6ml的opti
‑
mem培养基；每孔加入400μl上述混匀液体；
168.4)混匀培养液后，将6孔板放置于37℃，5％co2细胞培养箱中进行无菌培养。24h后用trizol法提取细胞的rna，并将rna根据实施例3的方法进行逆转录和荧光定量pcr，检测过表达及敲低hsa_circ_0001741效率。
169.上述hsa_circ_0001741的sirna的序列为：
170.正义链5’to 3’(seq id no:10):cucuauugguucaugcaugtt；
171.反义链5’to 3’(seq id no:11):caugcaugaaccaauagagtt。
172.3、结果：
173.如图4中的a所示，敲低hsa_circ_0001741效率可达90％，过表达hsa_circ_0001741效率达3倍以上，效率均可。
174.实施例5hsa_circ_0001741抑制ccrcc肿瘤细胞的迁移和增殖
175.1、建立sh
‑
hsa_circ_0001741稳转肾癌细胞株
176.1)按moi＝1：50的比例感染caki
‑
1细胞，同时加入polybrene(7μg/ml)。感染24h后换新鲜完全培养基。
177.本发明中使用的sh
‑
hsa_circ_0001741慢病毒是由汉恒生物公司合成，其shrna序
列如下：
178.sh
‑
hsa_circ_0001741(seq id no:12)：
179.gtagtatctctattggttcatgcat
180.sh
‑
nc(seq id no:13)：
181.ttctccgaacgtgtcacgtaa
182.2)感染48h后，加入嘌呤霉素进行筛选，嘌呤霉素筛选浓度：caki
‑
1为1.5μg/ml，一次筛选周期以未经病毒感染的野生型细胞全部死亡为止，然后每2
‑
3天更换含嘌呤霉素的完全培养基一次，连续筛选3代后，冻存稳转株。
183.3)triol法提取稳转株细胞及对照组细胞总rna，按案例3中方法进行qrt
‑
pcr检测hsa_circ_0001741的表达情况。
184.2、细胞增殖实验：
185.以cck
‑
8试剂盒进行增殖实验，取稳转hsa_circ_0001741的细胞消化，获得细胞悬液，设置细胞量为3000个cell/孔，分别在37℃培养箱中培养24h，48h，72h，96h和120h，同一样本做3个重复。分别在培养24h，48h，72h，96h和120h后向每孔弃去原有培养基，加入100ul cck
‑
8混合液(按培养基：cck
‑
8试剂＝9：1配制)，然后继续在37℃细胞培养箱中培养2小时。最后再酶标仪上测定450nm吸光度，得出对应的od值。
186.3、细胞迁移试验：
187.rcc
‑
jf和caki
‑
1细胞均分别转染si
‑
hsa_circ_0001741/si
‑
nc和过表达hsa_circ_0001741/空载，用细胞迁移分析实验测定转染后能够穿透膜的细胞数目。具体操作步骤如下：
188.1)消化法从细胞培养瓶中获取细胞，用无fbs的rpmi1640培养基重悬细胞，细胞浓度为5
×
105个/ml；
189.2)上室加入200μl细胞悬液，下室加入600μl含10％fbs的rpmi1640细胞培养基，37℃条件下培养20～24h；
190.3)培养完毕后，用棉签擦去上室上面的非侵袭细胞，移去transwells，倒置，风干；
191.4)将小室置于加有500μl结晶紫染色液的24孔板中，37℃条件下使膜浸没在培养基染液中10min；
192.5)取出小室，pbs清洗后，拍照并计数。
193.4、结果：
194.如图4中b～d所示，干扰后hsa_circ_0001741后细胞迁移能力显著增强；相反，过表达hsa_circ_0001741后肾癌细胞的迁移能力显著减弱；且在肾癌细胞中稳转干扰hsa_circ_0001741后细胞的增殖能力显著增强，以上结果说明hsa_circ_0001741能抑制ccrcc肾癌细胞的增殖和迁移。
195.以上所述是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明所述原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。