用于基因水平ABO嵌合体的Taqman水解探针及检测方法与流程

技术特征：
1.一种用于基因水平abo嵌合体的taqman水解探针，其特征在于：包括三种taqman水解探针，它们分别为：探针261：fam
‑
tcaacatcgacatcctcaacgagca
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bhq；探针467：fam
‑
cgcggtgccccgcgtga
‑
bhq；探针803：fam
‑
gggatgtaggcctgggactggggccggc
‑
bhq。2.一种用于基因水平abo嵌合体的检测方法，其特征在于：具体包括以下步骤：（1）内参白蛋白基因标准曲线的建立：取一份高质量的基因组dna作为标准品，用分光光度计重复测定基因组dna的浓度8次，然后计算得到基因组dna的浓度平均值， 再使用te缓冲液进行稀释并调整得到浓度为100ng/
µ
l的dna溶液，接着使用te缓冲液对所述dna溶液进行倍比梯度稀释，得到浓度依次为50ng/
µ
l、25ng/
µ
l、12.5ng/
µ
l、6.25ng/
µ
l、3.125ng/
µ
l、1.5625ng/
µ
l的稀释液；将各个稀释浓度的基因组dna溶液分别作为dna模板进行白蛋白内参基因pcr扩增反应，所述白蛋白内参基因pcr扩增反应的体系总体积为20
µ
l，其具体包括2
×
hieff
tm qpcr green master mix试剂盒的反应mix液10
µ
l、dna模板2.0
µ
l、白蛋白上游引物0.8
µ
l、白蛋白下游引物0.8
µ
l，余量为无菌双蒸水；所述白蛋白上游引物和白蛋白下游引物的浓度均为10
µ
m；所述白蛋白上游引物为tgttgcatgagaaaacgcca；所述白蛋白下游引物为gtcgcctgttcaccaaggat；所述内参基因pcr扩增反应的程序参数为：s1.95℃预变性 5min；s2.扩增循环参数：95℃ 10s，60℃ 30s，75℃ 1s，共40个循环；s3.熔解曲线分析参数：95℃ 15s，60℃ 60s，95℃ 15s，检测范围60℃～95℃，温度变化率为0.1℃/s；根据测定结果绘制白蛋白基因的扩增曲线、熔解曲线和标准回归曲线；（2）取待测血样进行dna的提取，具体是先取血样2ml于edta抗凝管中得到edta抗凝血，然后取edta抗凝血100μl于ep管中，接着加入100 μlnai，涡旋振荡2~3 min，接着加入200 μl抽提剂抽提3 min，再在13000 r/min的条件下离心5 min，取上清液至新的ep管中，再加入200 μl异丙醇摇匀，然后在13000 r/min的条件下离心5 min，接着弃上清液，加入1ml体积浓度为70%的乙醇，在13000 r/min的条件下离心5 min，再弃上清液得到沉淀，然后将沉淀干燥后再加入20μl的灭菌双蒸水溶解得到待测dna；所述抽提剂是氯仿和异戊醇按照体积比24:1的比例均匀混合得到的；（3）取5μl待测dna用灭菌双蒸水稀释至1.0 ml得到待测样品，测定待测样品在260nm、280nm和310n m处的吸光度od值，计算每个待测样品的浓度，将待测样品作为dna模板，按照步骤（1）中所述的白蛋白内参基因pcr扩增反应进行扩增，根据所得到的扩增曲线和步骤（1）中得到的标准回归曲线分析计算得到待测样品的浓度，以此对待测样品的浓度进行校正，然后调节待测样品中dna的浓度至20ng/μl；（4）pcr扩增反应：将步骤（2）中得到的待测样品分别作为检测模板进行pcr扩增反应，先将引物组261、引物组467、引物组803和三个水解taqman探针分别用双蒸水稀释成10pmol/μl的溶液，然后与检测模板、2
×
probe pcr master mix试剂和灭菌双蒸水混合得
到用于检测261突变位点、261正常位点、467突变位点、803突变位点、803正常位点的扩增反应体系溶液；每个待测样品重复检测2次；所述引物组261由以下引物组成：上游引物261
‑
mut：ggaaggatgtcctcgtggca；上游引物261
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nor：ggaaggatgtcctcgtggcg；下游引物261：cttgatggcaaacacagttaac；所述引物组467由以下引物组成：上游引物467
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mut：tatgtcttcaccgaccagtt；下游引物467：cgctcgcagaagtcactgat；所述引物组803由以下引物组成：上游引物803：ctccgctgttcggcaccctg；下游引物803
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mut：ccgaccccccgaagaaag；下游引物803
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nor：ccgaccccccgaagaaac；所述2
×
probe pcr master mix试剂是由qiagen 公司生产的 quantinova
tm probe pcr kit 的 2
×
probe pcr master mix；每个扩增反应体系溶液中待测样品中dna的起始定量浓度为20ng/
µ
l；用于检测261突变位点的扩增反应体系溶液的体积为20μl，其具体由以下体积的组分组成：2
×
probe pcr master mix试剂10μl、检测模板2.5μl、上游引物261
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mut和下游引物261的体积各为1.0μl、探针261的体积为0.5μl，余量为灭菌双蒸水；接着将所得到的扩增反应体系溶液在荧光定量pcr仪中依次进行如下扩增反应程序：95℃预变性2min，扩增循环参数为95℃变性5s，60℃ 30s，共40个循环；用于检测261正常位点的扩增反应体系溶液的体积为20μl，其具体由以下体积的组分组成：2
×
probe pcr master mix试剂10μl、检测模板2.5μl、上游引物261
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nor和下游引物261的体积各为1.0μl、探针261的体积为0.5μl，余量为灭菌双蒸水；接着将所得到的扩增反应体系溶液在荧光定量pcr仪中依次进行如下扩增反应程序：95℃预变性2min，扩增循环参数为95℃变性5s，60℃ 30s，共40个循环；用于检测467突变位点的扩增反应体系溶液的体积为20μl，其具体由以下体积的组分组成：2
×
probe pcr master mix试剂10μl、检测模板2.5μl、上游引物467
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mut和下游引物467的体积各为1.0μl、探针467的体积为0.5μl，余量为灭菌双蒸水；接着将所得到的扩增反应体系溶液在荧光定量pcr仪中依次进行如下扩增反应程序：95℃预变性2min，扩增循环参数为95℃变性5s，60℃ 30s，共40个循环；用于检测803突变位点的扩增反应体系溶液的体积为20μl，其具体由以下体积的组分组成：2
×
probe pcr master mix试剂10μl、检测模板2.5μl、上游引物803和下游引物803
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mut的体积各为1.0μl、探针803的体积为0.5μl，余量为灭菌双蒸水；接着将所得到的扩增反应体系溶液在荧光定量pcr仪中依次进行如下扩增反应程序：95℃预变性2min，扩增循环参数为95℃变性5s，60℃ 30s，共40个循环；用于检测803正常位点的扩增反应体系溶液的体积为20μl，其具体由以下体积的组分组成：2
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probe pcr master mix试剂10μl、检测模板2.5μl、上游引物803和下游引物803
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nor的体积各为1.0μl、探针803的体积为0.5μl，余量为灭菌双蒸水；接着将所得到的扩增反
应体系溶液在荧光定量pcr仪中依次进行如下扩增反应程序：95℃预变性2min，扩增循环参数为95℃变性5s，60℃ 30s，共40个循环；（5）结果检测：通过荧光定量pcr仪自带软件绘制扩增曲线并读取相应的ct值并进行结果判定。3.根据权利要求2所述的用于基因水平abo嵌合体的检测方法，其特征在于：步骤（1）中，所述白蛋白基因组dna的od260/od280比值为1.8～1.9。4.根据权利要求2所述的用于基因水平abo嵌合体的检测方法，其特征在于：步骤（1）中，每个浓度梯度的dna模板均重复测定2次。

技术总结
本发明公开了一种用于基因水平ABO嵌合体的Taqman水解探针，其针对ABO双倍体基因型相关的3个核酸多态性位点，设计适合用于上述位点检测的三种特异性Taqman水解探针，同时结合专门设计的引物组，通过优化扩增反应条件，获得一套完整的用于基因水平ABO嵌合体的Taqman水解探针实时荧光定量PCR检测方法，其具有特异性强、敏感性高、重复性好等优点，能够用于基因组DNA或外周血网织红细胞mRNA的ABO嵌合体检测。检测。


技术研发人员：刘峰
受保护的技术使用者：广西医科大学第一附属医院
技术研发日：2021.09.24
技术公布日：2021/12/14