一种生物刺激素及其制备方法与流程

1.本发明涉及一种生物刺激素及其制备方法。


背景技术：

2.生物刺激素在作物的生长过程中，细胞分裂，叶绿素转化，细胞壁的形成，作物的抗逆性均有较大的影响，可以辅助作物生长，也可以改善作物的品质和提高作物的产量，一直受到市场的关注。然而，生物刺激素效果的发挥跟其提取工艺有关，针对同一种物质提取工艺的不同，可能带来的是使用效果的大大的不同，因此，探索一种生物刺激素的提取方法尤为重要。
3.同时，为了使生物刺激素具有较好的功能，通常通过几种生物刺激素的复配，发挥它们的协同效应，茶皂素应用于农业常作为农药润湿剂，改善农药的物理性能，提高药液在生物或植物体表的附着力，起到对农药的增效作用。其自身也有一定的杀虫作用，然而其应用于杀虫，仅能够杀虫，不能对经虫破坏的植物进行营养补充，因此，其需要与其他生物刺激素复配，从而达到在杀虫的同时，避免作物的减产。
4.海藻提取物具有很好的促进作物生长，提高作物抗逆性的功能，但是并不是仅促进作物生长就可以增产的，还要避免病害以及害虫的侵袭，因此，将具有杀虫功效的茶皂素与具有促进作物生长的海藻提取物结合成为现在研究的主要方向。
5.然而海藻提取物的提取方式是多样的，不同制备工艺获得的海藻提取物的成分也不同，与茶皂素配合使用后，其使用效果也不同，因此，筛选一种能够与茶皂素配合，进一步提高使用效果的海藻提取物，成为了行业中的难点。


技术实现要素：

6.本发明提供一种生物刺激素及其制备方法，解决技术问题是筛选一种与茶皂素配合的海藻提取物，该提取物与茶皂素配合，具有较好的使用效果。
7.为了解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：一种生物刺激素，包括茶皂素和海藻提取物；所述海藻提取物包括海藻提取液和海藻粉；所述海藻提取物按照以下步骤进行：将海藻和酶加入到水中，经酶解，即得海藻提取液；将海藻提取液干燥，即得海藻粉；所述酶至少包括纤维素酶、木质素过氧化物酶和氧化酶，所述氧化酶通过催化底物获得过氧化氢，所述底物为海藻自身含有的有机物或人工添加的有机物；所述底物占海藻质量的4%～30%；海藻、酶和水的质量比是20～35:0.01～0.5:65～80；茶皂素和海藻提取物的质量比为1～99:1～99。
8.所述酶解为将木质素过氧化物酶和氧化酶同时加入，进行酶解；酶解条件为酶解温度为30～62℃，酶解时间为6～96h。
9.酶解后，还包括灭酶，灭酶温度是90～120℃，灭酶时间是2～5min。
10.所述干燥，干燥温度小于85℃。
11.将茶皂素和海藻粉混匀，即得生物刺激素；将茶皂素加入到海藻提取液中，溶解，即得生物刺激素。
12.发明具有以下有益技术效果：1.本技术通过加入纤维素酶对纤维素进行水解，获得多糖以及葡萄糖，获得的多糖以及葡萄糖可以避免茶皂素的水解，从而延长茶皂素的药效，这是因为茶皂素的结构为酯皂甙，即配基上羟基与有机酸形成酯，故其结构由配体、糖体和有机酸三部分组成，其中糖体部分包括葡萄糖醛酸、阿拉伯糖、木糖和半乳糖，因此通过增加茶皂素水解产物的浓度，可以抑制茶皂素的水解，延长茶皂素的药效；通过纤维素酶酶解海藻的产物主要是糖类，这就为微生物的生长提供了有利的条件，这个微生物包括有害菌和有益菌，就给植物生长带来了安全隐患，通过茶皂素的抑菌作用，可以进一步保证作物的正常生长，从而使通过纤维素酶水解获得的海藻提取物和茶皂素起到相辅相成的作用。
13.2.本技术通过加入木质素过氧化物酶和氧化酶，木质素过氧化物酶通过催化氧化酶氧化底物产生的h2o2，对黑色素进行脱色，从而制备的海藻提取液，颜色浅，具有较好的透光性，喷于叶面可以减少叶面肥对光照的影响，减少对植物叶片光合作用的影响，在茶皂素杀虫后可以快速修复因虫害对植物的破坏，使作物尽快恢复生长。
14.3.本技术酶解为将木质素过氧化物酶和氧化酶同时加入，这是因为本技术通过木质素过氧化物酶催化氧化酶氧化底物产生的h2o2使木质素进行降解，同时，h2o2催化木质素过氧化物酶对黑色素脱色，获得颜色较浅的海藻提取液；在制备方法中，如果先加入木质素过氧化物酶，则木质素过氧化物酶则会因没有h2o2催化，使酶解反应无法进行，或者进展缓慢，同时，也会对木质素过氧化物酶的酶活力造成损失，影响氧化酶加入后的酶解效果和酶解时间；而先加入氧化酶，则氧化酶催化产生h2o2, h2o2不稳定易分解，这就造成木质素过氧化物酶加入后因h2o2减少而影响木质素过氧化物酶加入后的酶解效果。
具体实施方式
15.下面结合具体实例进一步说明本发明。
16.实施例1一种生物刺激素，由茶皂素和海藻提取液组成；茶皂素和海藻提取液的质量比为5:95。
17.一种海藻提取液的制备方法，按照以下步骤进行：将海藻和酶1加入到水中，在温度为58℃
±
2℃条件下，酶解72h，在温度为100℃条件下，灭酶2min，获得海藻液，向海藻液中加入葡萄糖和酶2，在温度为58℃
±
2℃条件下，酶解24h，在温度为100℃条件下，灭酶2min，即得海藻提取液；所述酶1是纤维素酶和酸性蛋白酶按照质量比2:1的组合物；所述酶2是木质素过氧化物酶和葡萄糖氧化酶按照质量比1:1的组合物；酶1和酶2的质量比为1:1。
18.海藻、葡萄糖、酶1、酶2和水的质量比为30:6:0.03:0.03:63.94。
19.将茶皂素加入到海藻提取液中，即得生物刺激素；
所述海藻是海带，所述茶皂素购自西安通泽生物科技有限公司，水溶性茶皂素，棕色粉末。
20.实施例2一种生物刺激素，由茶皂素和海藻粉组成；茶皂素和海藻粉的质量比为90:10。
21.一种海藻粉的制备方法，按照以下步骤进行：将海藻和酶1加入到水中，在温度为58℃
±
2℃条件下，酶解72h，在温度为100℃条件下，灭酶2min，获得海藻液，向海藻液中加入葡萄糖和酶2，在温度为58℃
±
2℃条件下，酶解24h，在温度为100℃条件下，灭酶2min，即得海藻提取液；将海藻提取液在温度为80℃的条件下，经喷雾干燥，得海藻粉；所述酶1是纤维素酶和酸性蛋白酶按照质量比2:1的组合物；所述酶2是木质素过氧化物酶和葡萄糖氧化酶按照质量比1:1的组合物；酶1和酶2的质量比为1:1。
22.海藻、葡萄糖、酶1、酶2和水的质量比为30:6:0.03:0.03:63.94。
23.将茶皂素和海藻粉混匀，即得生物刺激素；所述海藻是海带，所述茶皂素购自西安通泽生物科技有限公司，水溶性茶皂素，棕色粉末。
24.实施例3一种生物刺激素，由茶皂素和海藻粉组成；茶皂素和海藻粉的质量比为40:60。
25.一种海藻粉的制备方法，按照以下步骤进行：将海藻和酶加入到水中，在温度为45℃
±
2℃条件下，酶解90h，在温度为101℃条件下，灭酶2min，即得海藻提取液；将海藻提取液在温度为80℃的条件下，经喷雾干燥，得海藻粉；所述酶是纤维素酶、木质素过氧化物酶和l氨基酸氧化酶按照质量比3:1:1的组合物；海藻、酶和水的质量比为30:0.05:69.95。
26.将茶皂素和海藻粉混匀，即得生物刺激素；所述茶皂素购自西安通泽生物科技有限公司，水溶性茶皂素，棕色粉末。
27.所述海藻是马尾藻。
28.实施例4一种生物刺激素，由茶皂素和海藻粉组成；茶皂素和海藻粉的质量比为70:30。
29.一种海藻粉的制备方法，按照以下步骤进行：将海藻和酶加入到水中，在温度为57℃
±
2℃条件下，酶解85h，在温度为100℃条件下，灭酶2min，即得海藻提取液；将海藻提取液在温度为75℃的条件下，经喷雾干燥，得海藻粉；所述酶是果胶酶、纤维素酶、木质素过氧化物酶和l氨基酸氧化酶按照质量比1:1:1:1的组合物；海藻、酶和水的质量比为27:0.2:72.8。
30.将茶皂素和海藻粉混匀，即得生物刺激素
所述海藻是坛紫菜。
31.实施例5一种生物刺激素，由茶皂素和海藻提取液组成；茶皂素和海藻提取液的质量比为10:90。
32.一种海藻提取液的制备方法，按照以下步骤进行：将海藻和酶加入到水中，在温度为57℃
±
2℃条件下，酶解85h，在温度为100℃条件下，灭酶2min，即得海藻提取液；所述酶是纤维素酶、木质素过氧化物酶和l氨基酸氧化酶按照质量比2:1:1的组合物；海藻、酶和水的质量比为15:0.02:84.98。
33.将茶皂素加入到海藻提取液中，即得生物刺激素；所述茶皂素购自西安通泽生物科技有限公司，水溶性茶皂素，棕色粉末。
34.所述海藻是石花菜。
35.实施例6一种海藻提取液的制备方法，将酶和葡萄糖加入到海藻液中，在温度为57℃
±
2℃条件下，酶解24h，在温度为100℃条件下，灭酶2min，即得海藻提取液；所述酶是木质素过氧化物酶和葡萄糖氧化酶按照质量比1:1的组合物；海藻液、酶和葡萄糖的质量比是98.79:0.01:1.2；所述海藻液购自烟台嘉特生物技术有限公司，其制备方法为化学法，颜色为黑色，海藻液在50℃真空烘箱中烘干后，白度为2.23。
36.将茶皂素加入到海藻提取液中，即得生物刺激素；所述茶皂素购自西安通泽生物科技有限公司，水溶性茶皂素，棕色粉末。
37.所述海藻是石花菜。
38.实施例7一种海藻提取液的制备方法，按照以下步骤进行：将海藻和酶加入到水中，在温度为57℃
±
2℃条件下，酶解85h，在温度为100℃条件下，灭酶2min，即得海藻提取液；所述酶是纤维素酶、木质素过氧化物酶和l氨基酸氧化酶按照质量比1:2:1的组合物；海藻、酶和水的质量比为32:0.4:67.6。
39.将茶皂素加入到海藻提取液中，即得生物刺激素；所述茶皂素购自西安通泽生物科技有限公司，水溶性茶皂素，棕色粉末。
40.所述海藻是石花菜。
41.本技术中使用的纤维素酶、葡萄糖氧化酶和酸性蛋白酶采购于泰安信得利生物工程有限公司，酶活分别为200000u/g、10000u/g和200000u/g，木质素过氧化物酶购自山东诺杰生物科技有限公司，酶活为10000u/g。
42.下面结合实验数据进一步说明本发明的有益效果：实验一1.1试验地点：山东爱果者生物技术有限公司。
43.1.2实验检测：固含量、海藻提取液颜色和海藻粉的白度；海藻粉的制备：将海藻提取液在50℃真空烘箱中烘干至水分低于0.4，即得海藻
粉。
44.1.3供试材料：对比1（除未加入木质素过氧化物酶、葡萄糖氧化酶和葡萄糖外，其它制备方法均与实施例1一致）制备的海藻提取液，记做对比1，对比2（除将实施例1海藻提取液制备方法为先加入纤维素酶、酸性蛋白酶和木质素过氧化物酶，在温度为58℃
±
2℃条件下，酶解72h，灭酶后加入葡萄糖氧化酶和葡萄糖，在温度为58℃
±
2℃条件下，酶解24h外，其它均与实施例1一致）制备的海藻提取液，记做对比2，对比3（除先加入纤维素酶、酸性蛋白酶、葡萄糖氧化酶和葡萄糖，在温度为58℃
±
2℃条件下，酶解72h，灭酶后加入木质素过氧化物酶，在温度为58℃
±
2℃条件下，酶解24h外，其它均与实施例1一致）制备的海藻提取液，记做对比3，对比4（购自烟台嘉特生物技术有限公司的海藻液，采用化学法），记做对比4，实施例1制备的海藻提取液，记做实施例1，实施例6制备的海藻液，记做实施例6。
45.1.4实验实施：固含量为将制备的海藻提取液静置24h，取上层溶液，按照涂料固体含量测定法 gb1725
‑
79，颜色为肉眼观察，白度采用白度仪进行检测。
46.本技术除各处理不同外，其它实施均一致。
47.2结果与分析固含量、海藻提取液颜色和海藻粉的白度，见表1表1由表1可以看出，木质素过氧化物酶和氧化酶，可以降低海藻提取液的颜色深度。木质素过氧化物酶和氧化酶的加入顺序的不同，对白度产生的影响也不同。
48.实验二1.1试验地点：寿光孙集街道石门董村。
49.1.2实验检测：叶绿素含量（spad）。
50.1.3供试材料：将对比1（除未加入木质素过氧化物酶、葡萄糖氧化酶和葡萄糖外，其它制备方法均与实施例1一致）制备的海藻提取液，对比2（除将实施例1海藻提取液制备方法为先加入纤维素酶、酸性蛋白酶和木质素过氧化物酶，在温度为58℃
±
2℃条件下，酶解72h，灭酶后加入葡萄糖氧化酶和葡萄糖，在温度为58℃
±
2℃条件下，酶解24h外，其它均与实施例1一致）制备的海藻提取液，对比3（除先加入纤维素酶、酸性蛋白酶、葡萄糖氧化酶和葡萄糖，在温度为58℃
±
2℃条件下，酶解72h，灭酶后加入木质素过氧化物酶，在温度为58℃
±
2℃条件下，酶解24h外，其它均与实施例1一致）制备的海藻提取液，对比4（购自烟台嘉特生物技术有限公司的海藻液，采用化学法），实施例1制备的海藻提取液，实施例6制备
的海藻提取液，分别加入到尿素、磷酸二氢钾和水按照质量比30:10:60的液体水溶肥中，海藻提取液和液体水溶肥的质量比为5:95，分别记做对比1肥，对比2肥，对比3肥，对比4肥，实施例1肥和实施例6肥。
51.1.4实验实施：将一亩移栽50天的釜山88试验田分为6个小区，每小区100平方米，分别匹配对比1肥，对比2肥，对比3肥，对比4肥、实施例1肥和实施例6肥，分别称取对比1肥，对比2肥，对比3肥，对比4肥、实施例1肥和实施例6肥各30g，分别采用水稀释至25kg，得稀释液，将稀释液采用喷施的方式，喷于叶面。
52.其中叶绿素采用紫外可见分光光度计测定。每实验小区分别摘取100片叶子，叶子摘取部位为从顶部向下数第3枝杈中部，此部位接受阳光比较充足，叶绿素变化明显。
53.注：每株最多摘取一片叶子。
54.本技术除各处理不同外，其它实施均一致。
55.2结果与分析叶绿素含量（spad），见表2表2 处理前叶绿素（spad）处理后叶绿素（spad）对比1肥 48.6
ꢀꢀ
54.6对比2肥 48.3
ꢀꢀ
58.7对比3肥 48.9
ꢀꢀ
56.4对比4肥 48.7
ꢀꢀ
52.5实施例1肥 48.5
ꢀꢀ
60.6实施例6肥 48.6
ꢀꢀ
56.7由表1和表2数据可以看出，木质素过氧化物酶和氧化酶加入影响到了海藻提取液的白度，对海藻提取液的固含量影响不大，而这个白度则影响了海藻提取液的使用效果，当然经过氧化物酶和氧化酶处理后，产品的物质组成也有变化，限于申请人的研发实力，并不能做各种成分的变化数据，只能对使用后的效果进行验证，由白度变化可以看出将木质素过氧化物酶和氧化酶同时加入，对白度影响最大，同时，使用效果也最好。
56.同时，通过对比4肥和实施例6肥的数据比较，可以看出，经木质素过氧化物酶和氧化酶处理后的实施例6肥相比与未经处理的对比4肥，可以明显提高叶片中叶绿素含量，即具有较好的使用效果。
57.实验三1.1试验地点：山东爱果者生物技术有限公司实验室。
58.1.2实验检测：玉米株高（cm）、茎粗（mm）、根长（cm）、地上鲜重（g）和地下鲜重（g）。
59.1.3供试材料：玉米，品种 隆平206，实验日期5.15至6.10。
60.1.4实验实施：将25个花盆分为5组，每组5个，分别对应对比5（除海藻提取液制备中未加入木质素过氧化物酶、葡萄糖氧化酶和葡萄糖外，其它制备方法均与实施例1一致）制备的生物刺激素，记做对比5，对比6（除将实施例1海藻提取液制备方法为先加入纤维素酶、酸性蛋白酶和木质素过氧化物酶，在温度为58℃
±
2℃条件下，酶解72h，然后加入葡萄糖氧化酶和葡萄糖，在温度为58℃
±
2℃条件下，酶解24h外，其它均与实施例1一致）制备的生物刺激素，记做对比6，对比7（除海藻提取液制备方法为先加入纤维素酶、酸性蛋白酶、葡
萄糖氧化酶和葡萄糖，在温度为58℃
±
2℃条件下，酶解72h，然后加入木质素过氧化物酶，在温度为58℃
±
2℃条件下，酶解24h，其它均与实施例1一致）制备的生物刺激素，记做对比7，对比8（除海藻提取液使用购自烟台嘉特生物技术有限公司，采用化学法制备的海藻提取液外，其它制备方法与实施例2一致）制备的生物刺激素，记做对比8，实施例1制备的生物刺激素，记做实施例1。
61.本技术除各处理不同外，其它实施均一致。
62.2结果与分析玉米株高（cm）、茎粗（mm）、根长（cm）、地上鲜重（g）和地下鲜重（g）见表3表3 株高（cm）茎粗（mm）根长（cm）地上鲜重（g）地下鲜重（g）对比572.27 8.43 44.31 12.86 4.51对比672.16 8.41 44.26 12.79 4.48对比7 71.23 8.37 44.15 12.56 4.47对比8 67.15 8.15 41.76 11.67 4.05实施例1 74.528.57 45.13 13.02 4.62由表2可以看出，不同的制备工艺获得的海藻提取液与茶皂素复配，获得的种植效果是不同的，与对比4（化学法制备的海藻提取液，采购于烟台嘉特生物技术有限公司）效果最差，本技术实施例1（将木质素过氧化物酶和葡萄糖氧化酶同时加入）效果最好，而将木质素过氧化物酶和葡萄糖氧化酶分开加入的对比2和对比3，其效果与未加入木质素过氧化物酶、葡萄糖氧化酶和葡萄糖的对比1效果差不多，即制备工艺的改变直接影响到了海藻提取液与茶皂素复配的使用效果。
63.实验四1.1试验地点：山东爱果者生物技术有限公司实验室。
64.1.2实验检测：观察用药后蛞蝓的活动情况，24h后统计蛞蝓死亡率，对实验油菜称重，由于蛞蝓忍耐性极强，长期不动是常事，肉眼很难观察其是否死亡，因此为24h后统一统计死亡率，判断方法为：将蛞蝓丢入盛有200ml水的烧杯中，观察其是否动，10min静止不动，统计为死亡，10min内有活动，则计为未死亡。
65.1.3供试材料：对比9（除海藻提取液制备中未加入木质素过氧化物酶、葡萄糖氧化酶和葡萄糖外，其它制备方法均与实施例2一致）制备的生物刺激素，记做对比9，对比10（除将实施例2海藻提取液制备方法为先加入纤维素酶、酸性蛋白酶和木质素过氧化物酶，在温度为58℃
±
2℃条件下，酶解72h，然后加入葡萄糖氧化酶和葡萄糖，在温度为58℃
±
2℃条件下，酶解24h外，其它均与实施例2一致）制备的生物刺激素，记做对比10，对比11（除海藻提取液制备方法为先加入纤维素酶、酸性蛋白酶、葡萄糖氧化酶和葡萄糖，在温度为58℃
±
2℃条件下，酶解72h，然后加入木质素过氧化物酶，在温度为58℃
±
2℃条件下，酶解24h，其它均与实施例2一致）制备的生物刺激素，记做对比11，对比12（除海藻提取液使用购自烟台嘉特生物技术有限公司，采用化学法制备的海藻提取液外，其它制备方法与实施例2一致）制备的生物刺激素，记做对比12，实施例2制备的生物刺激素，记做实施例2。
66.1.4实验实施：准备5个培养皿，每个培养皿中放5g油菜绿叶，然后放30只成年蛞蝓，体长为32～35mm，5个培养皿分别对应对比9（除海藻提取液制备中未加入木质素过氧化
物酶、葡萄糖氧化酶和葡萄糖外，其它制备方法均与实施例2一致）制备的生物刺激素，记做对比9，对比10（除将实施例2海藻提取液制备方法为先加入纤维素酶、酸性蛋白酶和木质素过氧化物酶，在温度为58℃
±
2℃条件下，酶解72h，然后加入葡萄糖氧化酶和葡萄糖，在温度为58℃
±
2℃条件下，酶解24h外，其它均与实施例2一致）制备的生物刺激素，记做对比10，对比11（除海藻提取液制备方法为先加入纤维素酶、酸性蛋白酶、葡萄糖氧化酶和葡萄糖，在温度为58℃
±
2℃条件下，酶解72h，然后加入木质素过氧化物酶，在温度为58℃
±
2℃条件下，酶解24h，其它均与实施例2一致）制备的生物刺激素，记做对比11，对比12（除海藻提取液使用购自烟台嘉特生物技术有限公司，采用化学法制备的海藻提取液外，其它制备方法与实施例2一致）制备的生物刺激素，记做对比12，实施例2制备的生物刺激素，记做实施例2。分别向培养皿中，喷入2
±
0.2g的稀释1000倍的处理液，将处理后的培养皿放置于黑暗处。
67.本技术除各处理不同外，其它实施均一致。
68.2结果与分析蛞蝓死亡率，实验前后的实验油菜称重、活动情况见表4表4 实验前油菜重（g）实验后油菜重（g）油菜差重（g）活动情况死亡数（只）死亡率（%）对比9 5.2332.9182.315活动降低2790对比10 5.1762.9072.269活动降低2790对比11 5.1542.8002.354活动降低2686.7对比12 5.1522.3852.767活动降低2480实施例2 5.1463.8741.272活动明显降低2996.7
注：活动情况，为通过肉眼观察，由于并非24h观察，且为人为观察，可能存在主观判断，仅具有参考价值。
69.由表3中蛞蝓的死亡率可以看出，不同的制备方法制备的海藻提取液，应用于杀虫，具有不同的效果，其中本技术实施例2制备的生物刺激素具有较好的杀蛞蝓的效果，由活动情况以及实验前后的油菜差重，可以看出，对比9、对比10、对比11、对比12和实施例2均对蛞蝓有毒害效果，可以减少蛞蝓的活动并且有灭杀能力，但是本技术的实施例2的可以更好地降低蛞蝓的活动并减少其摄食，灭杀效果更好。
70.市场反馈将本技术实施例2应用于市场，得到了市场反馈，具有较好的灭杀蛞蝓和蜗牛的效果，潍坊市安丘市凌河镇种植户李某使用后，非常认可本技术的效果，同时，他还反应使用本品灭杀蛞蝓和蜗牛后，植物恢复速度快，叶色浓绿。