时钟基因RVE5在调控植物生长和开花时间中的应用的制作方法

时钟基因rve5在调控植物生长和开花时间中的应用
技术领域
1.本发明涉及基因工程领域，具体涉及一种时钟基因rve5在调控植物生长和开花时间中的应用。


背景技术：

2.生物钟广泛存在于生物体中，是生物的内在时间装置。它能够预测外部环境信息并相应地调整内部生物过程。生物钟系统主要包括信号输入、核心振荡器和信号输出3个部分。光照和温度的昼夜周期性变化是调节植物生物钟的两个主要输入信号，包括转录和翻译后两种水平。核心振荡器由转录反馈调控回路组成(harmersl.thecircadiansysteminhigherplants.annurevplantbiol.60(2009)357
–
377.)，cca1、lhy和toc1构成的核心回路；prr5/7/9组成的白昼回路；elf3、elf4、gi和lux形成夜晚回路(romanowskia,yanovskymj.circadianrhythmsandpost
‑
transcriptionalregulationinhigherplants.frontplantsci.6(2015)437.)。作为输出途径，生物钟调节昼夜下胚轴生长和光周期依赖性开花(farre,e.m.theregulationofplantgrowthbythecircadianclock.plantbiology.14(2012)401
‑
410)。之前有park等研究表明在温和高温下，植物中的生物钟通过感知并适应环境温度的变化控制下胚轴的生长，参与热形态建成。
3.pif4是植物热形态建成的中心调节因子，在转录和翻译后水平都受到多重调控(vu,l.d,etal.developmentalplasticityathightemperature.plantphysiology.181(2019)399
‑
411.)。它识别包含g
‑
box(cacgtg)的顺式元件并调节参与生长素生物合成和信号传导的下游基因的表达(sun,j.,etal.pif4
‑
mediatedactivationofyucca8expressionintegratestemperatureintotheauxinpathwayinregulatingarabidopsishypocotylgrowth.plosgenetics(2012)810.1371/journal.pgen.1002594.)。earlyflowering3(elf3)是生物钟的重要核心组件，与elf4和luxarrhythmo(lux)一起组装成ec复合体(huang,h.,etal.intotheevening:complexinteractionsinthearabidopsiscircadianclock.trendsingenetics.32(2016)674
‑
686.)。ec与pif4/5的启动子结合以抑制其基因表达，但这种抑制在温暖的温度条件下会减弱。在红光和温暖的温度条件下，cca1通过招募shorthypocotylunderblue1(shb1)与pif4的启动子结合以维持pif4表达来促进植物热形态建成(sun,q.b.,etal.shb1andcca1interactiondesensitizeslightresponsesandenhancesthermomorphogenesis.nat.commun.10(2019)3110.)。


技术实现要素：

4.本发明提供一种利用基因rve5改变植物开花时间和在温和高温(28～30℃，优选为29℃)下下胚轴生长速度的应用，并发掘能与rve5相结合的靶标基因。
5.本发明研究发现转录因子rve5在促进开花、抑制拟南芥热响应性下胚轴生长和
促进生物钟相关基因表达方面具有重要作用。
6.时钟基因rve5在调控植物生长和开花时间中的应用，所述的时钟基因 rve5的碱基序列如seq id no.1所示。
7.时钟基因rve5在调控拟南芥开花时间和热响应性下胚轴生长的应用， 所述的时钟基因rve5的碱基序列如seq id no.1所示。
8.时钟基因rve5，碱基序列如seq id no.1所示。时钟基因rve5的编 码区，碱基序列如seq id no.2所示。
9.所述的时钟基因rve5编码的蛋白质，其氨基酸序列如seq id no.3所 示。所述的时钟基因rve5的编码区编码的蛋白质，其特征在于，其氨基酸 序列如seq id no.3所示。
10.一种参与拟南芥开花时间调控的基因编码的蛋白质，其氨基酸序列如 seq id no.3所示。
11.一种参与拟南芥热形态建成的基因编码的蛋白质，其氨基酸序列如seqid no.3所示。
12.一种扩增出所述的时钟基因rve5所需的正反引物序列，正反引物序列 的碱基序列如seq id no.7和seq id no.8所示。
13.本发明提供的rve5基因是拟南芥第4号染色体上的一个myb转录因 子，其属于rve家族，基因编码为at4g01280。本实验使用的其它启动子 序列分别是来自第2号和第5号染色体的elf4和prr5基因，基因编号分 别为at2g40080、at5g24470。
14.rve5的基因组全长为4104bp，共含有8个外显子，7个内含子，序列 如seq id no.1所示，其结构图见图1。rve5基因编码区cds全长为912bp， 序列如seq id no.2所示；rve5基因编码303个氨基酸，具体序列如seqid no.3所示。rve5蛋白中含有一个myb
‑
like结构域(myb
‑
like domain)， 具体见图2所示。
15.本发明提供一种利用基因rve5改变开花时间和在温和高温下拟南芥下 胚轴伸长速度的应用，具体为：从nasc种子库购得t
‑
dna突变体rve5
‑
2: (gk_225c06)，提取dna，并设计引物鉴定突变体是否纯合，其系列为seqid no.4、seq id no.5、seq id no.6。针对rve5的基因组设计引物，其 系列为seq id no.7和seq id no.8，扩增出rve5的基因组序列并连接到 pcambia1300载体，通过农杆菌花序侵染法稳定转化rve5
‑
2，获得能够稳 定遗传的回补材料。
16.本发明提供设计并合成鉴定rve5
‑
2突变体所需的正反序列，其序列碱基 为：
17.rve5
‑
t
‑
dna
‑
f：cagagctctacgggacataaacgt(seq id no.4)
18.rve5
‑
t
‑
dna
‑
r：ctcgaagacgggagagaggt(seq id no.5)
19.gabi
‑
lb：atattgaccatcatactcattgc(seq id no.6)
20.rve5
‑
2突变体中t
‑
dna为反向插入，分别利用rve5
‑
t
‑
dna
‑
f/r， rve5
‑
t
‑
dna
‑
f/gabi，以rve5
‑
2基因组dna为模板进行扩增。具体为：在 95℃预变性5min；在95℃变性30sec，60℃退火30sec，72℃延伸1:30min， 在第2
‑
第4步循环35cycle。将pcr产物进行琼脂糖凝胶电泳检测条带，挑 选出用rve5
‑
t
‑
dna
‑
f/r扩增无条带，rve5
‑
t
‑
dna
‑
f/gabi有条带的line， 此为rve5
‑
2纯合突变体。
21.本发明提供设计并合成扩增出rve5的基因组所需的正反引物序列，其 序列碱基为：
22.rve5
‑
genomic
‑
f：ggggtacctagttccactcagttcacatggc(seqidno.7)
23.rve5
‑
genomic
‑
r：gcgtcgacccggaaacctgatcaaaccct(seqidno.8)
24.利用rve5
‑
genomic
‑
f/r，以野生型拟南芥dna为模板，使用kod酶扩增rve5基因组dna，具体为：在95℃预变性5min；在95℃变性30sec，60℃退火30sec，68℃延伸4min，在第2
‑
第4步循环35cycle。将扩增的双链插入到pcambia1300载体中，获得pcambia
‑
rve5载体。
25.本发明提供含有以上设计的pcambia1300载体。
26.本发明提供含有以上pcambia1300载体的大肠杆菌和农杆菌工程菌。
27.本发明提供利用农杆菌将重组的pcambia1300载体转化到rve5
‑
2突变体中，并筛选得到回补植株。具体方法如下：
28.(1)构建工程菌：将构建好的pcambia
‑
rve5载体通过热激法转化到农杆菌菌株gv3101中，通过卡那霉素和利福平筛选，获得含有此pcambia
‑
rve5载体的基因工程菌。
29.(2)农杆菌稳定转化拟南芥花序并筛选得到回补植株：挑取多个含有pcambia
‑
rve5载体的农杆菌，接种到含有利福平和卡那霉素的5mlyep液体培养基中，30
°
培养至od值在0.6
‑
1.0后，将菌液转入含有抗生素的400mlyep液体培养基中，30℃培养过夜。次日离心收集菌液，并用侵染液重悬菌体。用于转化拟南芥。挑选长势良好且处于盛花期的拟南芥，剪去果荚，将花序浸泡在侵染液中，5min后取出平放在托盘中，黑暗培养过夜，次日，将拟南芥放正，继续正常光照培养直至收种。将t1代种子放入到含有潮霉素的筛选板中，鉴定能够在筛选板上正常生长的阳性苗，获得回补株系。
30.(3)鉴定回补株系：设计引物鉴定是否含有目的载体，为引物序列为：
31.m1300
‑
r:gtaaaacgacggccagt(seqidno.9)
32.rve5
‑
genomic
‑
f3:gtccctactctgagcctttgttg(seqidno.10)
33.分别提取回补株系的dna，利用rve5
‑
genomic
‑
f和m1300
‑
r引物，进行扩增。具体为：在95℃预变性5min；在95℃变性30sec，60℃退火30sec，72℃延伸1min，在第2
‑
第4步循环30cycle。将pcr产物进行琼脂糖凝胶电泳检测条带，挑选出有条带的株系。
34.与现有技术相比，本发明具有如下优点：
35.本发明提供一种利用基因rve5改变拟南芥开花时间和在温和高温下下胚轴生长速度的应用。相较于野生型，rve5
‑
2突变体长日照条件下晚花，在温和高温下有明显的下胚轴伸长的表型，当rve5基因组dna回补到rve5
‑
2突变体后，晚花表型和温和高温下下胚轴明显伸长的表型消失。本发明显示rve5基因在调控拟南芥开花时间和温和高温下植物生长速度方面发挥重要作用。
附图说明
36.图1为rve5基因组结构图，其中，外显子用黑框表示，内含子用粗线条表示；
37.图2为rve5蛋白结构图，其中，myb
‑
likedomain用黑框表示；
38.图3为rve5
‑
2突变体及2个回补株系的开花时间表型及叶片数统计
39.图4为rve5
‑
2突变体及3个回补株系的下胚轴表型及长度统计；
40.图5为野生型和rve5
‑
2突变体中差异表达基因韦恩图；
41.图6为野生型和rve5
‑
2突变体中特异表达基因的go分析；
42.图7为rve5蛋白水平检测、与rve5相结合的靶标的chip
‑
seq分析；
43.图8为能与rve5相结合的生物钟相关基因的结合峰分布图；
44.图9为chip
‑
qpcr实验检验在不同温度下rve5与启动子的结合情况；
45.图10为对照野生型和rve5
‑
2突变体中的生物钟相关基因的表达情况；
46.图11为emsa和itc实验验证rve5能够与elf4启动子结合；
47.图12为rve5亚细胞定位实验；
48.图13为rve5转录活性检测；
49.图14为双荧光报告实验验证rve5抑制prr5和elf4启动子活性。
具体实施方式
50.以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
51.以下实施例中未注明具体条件的实验方法，均按照常规步骤进行，所用材料和试剂均为市售商品。
52.实施例1：利用rve5
‑
2突变体及回补材料，探究rve5基因在调控开花时间和温和高温下拟南芥下胚轴生长中的应用
53.以下实施案例采用拟南芥哥伦比亚型(arabidopsisthaliana.cv.columbia)为例。扩增出rve5的基因组序列并连接到pcambia1300载体，通过农杆菌花序侵染法稳定转化rve5
‑
2，筛选获得能够稳定遗传的回补材料。具体方法如下：
54.(1)pcambia
‑
rve5载体构建
55.设计并合成扩增出rve5的基因组所需的正反引物序列，其序列碱基为：
56.rve5
‑
genomic
‑
f：ggggtacctagttccactcagttcacatggc(seqidno.7)
57.rve5
‑
genomic
‑
r：gcgtcgacccggaaacctgatcaaaccct(seqidno.8)
58.利用rve5
‑
genomic
‑
f/r，以野生型拟南芥dna为模板，使用kod酶扩增rve5基因组dna，具体为：在95℃预变性5min；在95℃变性30sec，60℃退火30sec，68℃延伸4min，在第2
‑
第4步循环35cycle。将扩增的双链连接到pcambia1300载体中，获得pcambia
‑
rve5载体。
59.(2)pcambia
‑
rve5载体转化农杆菌
60.将构建好的pcambia
‑
rve5载体通过热激法转化到农杆菌菌株gv3101中，通过卡那霉素和利福平筛选，获得含有此pcambia
‑
rve5载体的基因工程菌。
61.(3)农杆菌稳定转化拟南芥花序
62.a：侵染液配方：2.2g/lms培养基 50g/l蔗糖 10μg/l6
‑
ba 200μl/lsilweet
‑
77,ph5.7
63.b：农杆菌转化拟南芥花序方法
64.挑取多个含有pcambia
‑
rve5载体的农杆菌，接种到含有利福平和卡那霉素的5mlyep液体培养基中，30
°
培养至od值在0.6
‑
1.0后，将菌液转入含有抗生素的400mlyep液体培养基中，30℃培养过夜。次日离心收集菌液，并用侵染液重悬菌体。用于转化拟南芥。挑选长势良好且处于盛花期的拟南芥，剪去果荚，将花序浸泡在侵染液中，5min后取出平放在托盘中，黑暗培养过夜，次日，将拟南芥放正，继续正常光照培养直至收种。将将t1代种子放入到含有潮霉素的筛选板中，待阳性苗长大后移入土中，继续生长。
65.(4)鉴定回补株系：设计引物鉴定是否含有目的载体，为引物序列为：
66.m1300
‑
r:gtaaaacgacggccagt(seqidno.9)
67.rve5
‑
genomic
‑
f3:gtccctactctgagcctttgttg(seq id no.10)
68.分别提取回补株系的dna，利用rve5
‑
genomic
‑
f和m1300
‑
r引物， 进行扩增。具体为：在95℃预变性5min；在95℃变性30sec，60℃退火30sec， 72℃延伸1min，在第2
‑
第4步循环30cycle。将pcr产物进行琼脂糖凝胶 电泳检测条带，挑选出有条带的株系。
69.(5)探究rve5在调控拟南芥开花时间中的功能
70.本发明提供一种利用基因rve5改变拟南芥开花时间的应用。rve5
‑
2突 变体在长日照条件下有明显的晚花表型，当rve5基因组dna回补到rve5
‑
2 突变体后，晚花的表型消失，开花时间和叶片数与野生型基本一致。具体见 图3所示。
71.图3为rve5
‑
2突变体及2个回补株系(com)的开花表型及开花时叶 片数统计。图例：wt、rve5
‑
2突变体及回补材料22℃从播种到开花，分别 统计开花时间和叶片数。误差线表示的标准差(n＝36)。
72.(6)探究rve5在温和高温下拟南芥下胚轴伸长中的功能
73.本发明提供一种利用基因rve5改变在温和高温下拟南芥下胚轴表型的 应用。rve5
‑
2突变体在温和高温下有明显的下胚轴伸长的表型，当rve5基 因组dna回补到rve5
‑
2突变体后，下胚轴明显伸长的表型消失，下胚轴长 度与野生型基本一致。具体见图4所示。
74.图4为rve5
‑
2突变体及3个回补株系(com)的下胚轴表型及长度统 计。图例：wt、rve5
‑
2突变体及回补材料22℃生长3天后，再分别进行22℃、 29℃处理，4天后拍照(a)并用imagej软件统计下胚轴长度(b)，统计学分 析方法为单因素方差分析，误差线表示的标准差(n＝22)。
75.(7)探究rve5调控开花时间和高温响应下生长的分子机理
76.图5为野生型和rve5
‑
2突变体中差异表达基因韦恩图。图例：将22℃ 生长5天野生型和rve5
‑
2突变体，进行22℃、29℃处理12h，取样进行 rna
‑
seq分析。维恩图显示的是各材料间上调(increased)和下调(decreased) 的基因数目。筛选差异表达的标准log2fc>＝1，p
‑
value<0.05。
77.图6为野生型和rve5
‑
2突变体中特异表达基因的go分析。图例：对 wt与rve5
‑
2突变体中特异上调的基因(a,b)；与wt与rve5
‑
2突变体中特 异下调的基因(c,d)进行go富集分析，纵坐标表示基因功能，横坐标表 示richfactor，richfactor越大，表示富集的程度越大。
78.图7为rve5蛋白水平检测、与rve5相结合的靶标基因的chip
‑
seq 分析。图例a：将rve5
‑
myc过表达材料22℃生长7天后，分别进行22℃、 29℃处理3h、6h、9h、12h、24h，取材，提取总蛋白，用anti
‑
myc检测在 不同温度下外源蛋白积累水平，tubulin为内参。图例b
‑
d:能够与rve5结合 靶标的chip
‑
seq分析；图b为chip
‑
seq信号的分布图，图c
‑
d为能够 与rve5结合的motifs。
79.图8为能与rve5直接结合的生物钟相关基因的结合峰分布图。图例： 将rve5
‑
myc过表达材料22℃生长13天后，29℃处理12h，取材并用甲醛 固定，进行chip
‑
seq实验。蓝色、红色分别代表input
‑
dna(1个重复)、 chip
‑
dna(3个重复)。基因结构图中，外显子用蓝框表示，内含子用蓝线 表示，黑箭头表示转录方向。
80.图9为chip
‑
qpcr实验检验在不同温度下rve5与启动子的结合情况。 图例：将rve5
‑
myc过表达材料22℃生长13天后，分别进行22℃、29℃ 处理12h、36h，取材并用甲醛固
定，进行chip
‑
qpcr实验。anti
‑
myc抗体 用于免疫沉淀反应，anti
‑
gst抗体的作为阴性对照。将沉淀下来的dna分 别进行q
‑
pcr实验。以ta3为内参，每个样品有三个生物学重复，误差线 表示标准误差(n＝3)。
81.图10为对照野生型和rve5
‑
2突变体中的生物钟相关基因的表达情况。 图例：将22℃生长5天野生型和rve5
‑
2突变体，进行22℃、29℃处理48h， 每4小时取样一次，以野生型22℃0h的基因表达量为对照，用2
‑
δδct
法计算 基因的相对表达量，以pp2a为内参，每个样品有三个生物学重复，误差线 表示标准误差(n＝3)。
82.图11为emsa和itc实验验证rve5能够与elf4启动子序列结合。 图例a：纯化带有mbp
‑
tag的rve5融合蛋白与elf4启动子进行凝胶迁 移实验，空mbp为阴性对照，用不同浓度的未标记的探针及有突变形式的 标记探针进行竞争实验。图b：等温滴定量热实验。使用vp
‑
itc仪，将 300μmelf4启动子的ee
‑
element(5
′‑
ataaatatcttt
‑3′
)分别滴定到25μm 的mbp
‑
rve5蛋白中。用origin软件获得解离常数k
d
、k
a
。
83.图12为rve5亚细胞定位实验。将含有yfp、rve5
‑
yfp的农杆菌分 别注射烟草，3天后，取烟草叶片置于激光共聚焦显微镜下观察。用含有 rve5
‑
yfp的农杆菌侵染拟南芥花序，筛选鉴定获得稳定表达的拟南芥，将 其放在1/2ms固体培养基上生长，7天后，取根观察rve5的定位，标尺为 50μm。
84.图13为rve5转录活性检测。图例a：将rve5构建到pgbkt7载体 上，转化酵母ah109感受态，分别让酵母在
‑
trp、
‑
trp
‑
his
‑
ade的营养缺陷 型培养基上生长，30℃培养箱培养3d后观察酵母的生长情况。co
‑
bd作 为阳性对照。图例b和c为effector
‑
reporter双荧光报告实验，effector为 lexa
‑
rve5，reporter为35s:olexa
‑
pcambia1300,分别转化农杆菌感受态， 注射烟草叶片，3天后检测luc和ren值，纵坐标为luc/ren,误差线表 示标准误差(n＝5)。
85.图14为effector
‑
reporter双荧光报告实验验证rve5抑制prr5、elf4 启动子的活性。图例a和c：effector为35s:rve5/cca1
‑
pskm，reporter 为35s:prr5/elf4
‑
pgreenii0800
‑
pcambia1300，分别转化农杆菌感受态， 注射烟草叶片，3天后检测luc和ren值，纵坐标为luc/ren。误差线 表示标准误差。图例b和d:分别western验证effector的蛋白表达量，用 anti
‑
myc抗体进行检测，内参为rbcs。