裂解性大肠杆菌噬菌体制剂及其制备和应用的制作方法

1.本发明属于生物技术领域，具体涉及裂解性大肠杆菌噬菌体制剂及其制备和应用。


背景技术：

2.大肠杆菌o157：h7(atcc:43895)(购买于testobio，产品编号ts205491)作为一种人畜共患病原菌，可引起人类出血性结肠炎(hc)，有时并发溶血性尿毒综合征(hus)，严重者并发肾功能衰竭，死亡率较高。大肠杆菌atcc:43895在猪、牛粪、猪肉和牛肉中的分离率非常高。其主要通过食物传播，对公众健康构成威胁。同时，研究发现，大肠杆菌atcc:43895自1997年后在世界各地出现耐药菌株。因此，迫切需要新的抗生素替代品来预防和治疗大肠杆菌atcc:43895疾病。
3.作为一种有效杀灭细菌的病毒，噬菌体在治疗细菌感染相关疾病方面的应用价值得到了重新评估。噬菌体作为一种天然抗菌药物，其固有毒性低，可自我复制，与宿主高度特异性结合，可与宿主共同进化，可有效治疗耐药菌引起的感染。与抗生素治疗大肠杆菌感染的小鼠模型相比，噬菌体疗法不仅可以降低体内大肠杆菌的含量，保证小鼠的正常生长，而且不会影响肠道菌群。这为今后治疗耐药菌引起的胃肠道感染提供了新思路。但是，目前来说，细菌对单个噬菌体容易产生抗性使单个噬菌体在应用上受到了很大的限制，即现有单个噬菌体对宿主菌刚开始裂解效果良好，但很快就会有抗性细菌产生，导致单个噬菌体失去对抗性细菌的裂解作用，不能满足生产需要。


技术实现要素：

4.本发明目的在于提供裂解性大肠杆菌噬菌体制剂及其制备和应用，噬菌体制剂的宿主菌为大肠杆菌o157：h7(atcc:43895)，其对大肠杆菌atcc:43895不同年龄的生物被膜具有有效的清除能力，在小鼠肠道中的应用实例也证实，当其用做于体内抑菌剂时具备良好的效果。
5.本发明目的之一在于提供一种裂解性大肠杆菌噬菌体制剂，所述制剂包括噬菌体pnj1902、psd2001和psd2002；其中，噬菌体pnj1902的保藏编号为gdmcc no：61890
‑
b1，噬菌体psd2001的保藏编号为gdmcc no：61891
‑
b1，噬菌体psd2002的保藏编号为gdmcc no：61892
‑
b1。
6.在一些实施例中，本技术所述的噬菌体制剂中噬菌体pnj1902、噬菌体psd2001和噬菌体psd2002的效价比例为(1～3)：(1～3)：(1～3)，优选的，噬菌体pnj1902、噬菌体psd2001和噬菌体psd2002的效价比例为1：1：1。
7.申请人从江苏省南京市鸡场分离到噬菌体pnj1902，从山东省菏泽市鸭场中筛选出为噬菌体psd2001和噬菌体psd2002，已于2021年8月26日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼)，所述的pnj1902的命名为：大肠杆菌o157：h7噬菌体pnj1902，分类命名为escherichia coli phage，其保藏编号为gdmcc no：
61890
‑
b1；所述的psd2001的命名为：大肠杆菌o157：h7噬菌体psd2001，分类命名为escherichia coli phage，其保藏编号为：gdmcc no：61891
‑
b1；所述的psd2002的命名为：大肠杆菌o157：h7噬菌体psd2002，分类命名为escherichia coli phage，其保藏编号为：gdmcc no：61892
‑
b1。
8.本发明中的噬菌体pnj1902属于长尾科噬菌体(siphoviridae)。有一个长的、不可收缩的尾鞘，外壳属于规则多面体。头部径长(l)＝60nm，头部横向直径(w)＝55nm，l/w＝1.09，带尾鞘，尾长＝196nm，宽度＝11nm。
9.本发明中的噬菌体psd2001属于肌尾科噬菌体(cercoviridae)。psd2001具有多面体对称的头部和可伸缩的尾部。头部径长(l)＝118nm，头部宽度(w)＝79nm，l/w＝1.49。收缩尾巴(尾长＝116nm,尾宽＝19nm)。
10.本发明中的噬菌体psd2002属于肌尾科噬菌体(cercoviridae)。psd2002具有多面体对称的头部和可伸缩的尾部。头部径长(l)＝121nm，头部宽度(w)＝83nm，l/w＝1.46。收缩尾巴(尾长＝121nm,尾宽＝20nm)。
11.本发明所述的噬菌体制剂中的三种噬菌体对大肠杆菌atcc:43895均有较强的裂解性。将三种噬菌体混合后，发现噬菌体之间存在协同作用，较之于单个噬菌体具有更高效的抑制作用。
12.本发明的另一目的是提供了所述噬菌体制剂在制备大肠杆菌抑制剂中的应用。
13.本发明的另一目的是提供了所述噬菌体制剂在制备大肠杆菌生物被膜清除剂中的应用。
14.本发明的另一目的是提供了所述噬菌体制剂在制备治疗大肠杆菌造成的疾病的药物中的应用。
15.本发明所述的大肠杆菌为大肠杆菌atcc:43895。
16.本发明另一个目的是提供三种裂解性大肠杆菌噬菌体，分别为噬菌体pnj1902、噬菌体psd2001和噬菌体psd2002；其中，噬菌体pnj1902的保藏编号为gdmcc no：61890
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b1，噬菌体psd2001的保藏编号为gdmcc no：61891
‑
b1，噬菌体psd2002的保藏编号为gdmcc no：61892
‑
b1。
17.与现有技术相比，本发明具有以下优点和有益效果：
18.(1)在本发明中，由噬菌体pnj1902、psd2001和psd2002组成的噬菌体鸡尾酒在lb培养基中对浮游态大肠杆菌atcc:43895的抑制作用具有协同作用。
19.(2)在本发明中，由噬菌体pnj1902、psd2001和psd2002组成的噬菌体鸡尾酒在lb培养基中对浮游态大肠杆菌atcc:43895具有长时间显著抑菌效果。
20.(3)在本发明中，由噬菌体pnj1902、psd2001和psd2002组成的噬菌体鸡尾酒可以有效清除大肠杆菌atcc:43895不同年龄的生物被膜。
21.(4)由噬菌体pnj1902、psd2001和psd2002组成的噬菌体鸡尾酒可以用于小鼠肠道感染大肠杆菌atcc:43895的8h后的疾病治疗。
22.(5)由噬菌体pnj1902、psd2001和psd2002组成的噬菌体鸡尾酒对感染大肠杆菌atcc:43895的小鼠具有较高的保护率，且与抗生素治疗相比，该噬菌体鸡尾酒能更快的促进小鼠增重，更快的促进炎性因子恢复到正常水平。
附图说明
23.图1是噬菌体pnj1902、psd2001和psd2002的透射电子显微镜照片(比例尺代表200nm)；
24.图2是噬菌体鸡尾酒对大肠杆菌atcc:43895的体外裂解能力(每组条件n＝10，**p≤0.01，***p≤0.001。所示值是3个独立实验的平均值)；
25.图3是噬菌体鸡尾酒对大肠杆菌atcc:43895生物被膜的清除效果(每组条件n＝10，**p≤0.01，***p≤0.001。所示值是3个独立实验的平均值)；
26.图4是噬菌体鸡尾酒对感染大肠杆菌atcc:43895小鼠的保护率；
27.图5是比较噬菌体鸡尾酒和恩诺沙星治疗大肠杆菌atcc:43895感染时对小鼠体重的影响；
28.图6是比较噬菌体鸡尾酒和恩诺沙星对大肠杆菌atcc:43895诱导炎症反应的抑制作用。
29.具体实施例方式
30.以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。
31.以下实施例中用到的培养基的配置：
32.luria bertani(lb)液体培养基：在950ml去离子水中加入胰蛋白胨10g，酵母提取物5g和nacl 10g混匀溶解。用5mol/lnaoh调ph至7.0。用ddh2o定容至1l。在121℃高压蒸汽灭菌20min。
33.lb固体培养基：在950ml去离子水中加入胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，nacl10g，和琼脂粉20g混匀溶解。用5mol/lnaoh调ph至7.0。用ddh2o定容至1l。在121℃高压蒸汽灭菌20min。
34.lb半固体培养基：在lb液体培养基中加入0.5％的琼脂搅拌均匀后，121℃灭菌20min，待冷却至50℃左右立即使用。
35.sodium
‑
magnesium(sm)液：称取0.58g nacl，0.2g mgso4·
7h2o，再量5ml 1m tris
‑
hcl(ph7.5)和5ml 2％明胶，加入80ml ddh2o中，搅拌均匀充分溶解后定容至100ml，121℃灭菌20min，4℃保存备用。
36.pbs缓冲液：准确称取kh2po
4 0.2g、na2hpo
4 2.13g、nacl 8.0g、kcl 0.2g，用500ml蒸馏水溶解后，定容至1l，121℃高压灭菌15min，常温保存。
37.以下实施例中用到的主要仪器：超净工作台(苏净安泰sw
‑
cj
‑
2fd)、常温台式离心机(eppendorf 5424)、冷冻台式离心机(eppendorf 5424r)、常温摇床(德国wiggens ws
‑
600)、微生物培养箱(thermo fisher igs100)、恒温水浴锅(thermo fisher gp 05)、高速台式冷冻离心机(thermo fisher multifuge x1r)、涡旋混匀仪(scilogex mx
‑
s)、4度冷藏柜(thermo fisher plr386)、超低温冰箱(中科美菱528l)、、纯水系统(密理博elix essential 5 milli
‑
q reference)、大容量恒温振荡器(摇床)(太仓华美thz
‑
25)、电磁炉、微波炉等。
38.实施例1三种噬菌体的形态观察及序列测定
39.1.1电镜形态观察
40.吸取10μl噬菌体悬液于铜网上，沉淀10min，用滤纸吸去多余的液体，然后滴加10μl磷钨酸(pta)染色5
‑
10min，自然干燥，在透射电镜(tem)下观察噬菌体形态。
41.1.2基因组测序和分析
42.噬菌体基因组的原始测序数据使用trimmomatic v0.39进行质量过滤，以在4bp的浮动范围内去除接头序列和质量小于15的数据。然后将原始数据与分离宿主(大肠杆菌atcc:43895)的基因组进行比对，以使用bbduk(一种bbmap包的工具)过滤细菌基因组的任何残留污染。过滤的原始数据使用unicycler v0.43组装，最小重叠群长度为1000bp。组装的基因组使用rast服务器v2.0进行注释。还使用vibrant检查了噬菌体基因组的裂解特征，并使用在abricate(https://github.com/tseemann/abricate)中实施的噬菌体的各种抗性和毒力基因查找器数据库检查了抗生素抗性和毒力基因的存在。
43.2结果
44.2.1噬菌体形态学观察
45.pnj1902属于长尾科噬菌体(siphoviridae)。有一个长的、不可收缩的尾鞘，外壳属于规则多面体；头部径长(l)＝60nm，头部横向直径(w)＝55nm，l/w＝1.09；带尾鞘，尾长＝196nm，宽度＝11nm。psd2001和psd2002噬菌体均属于肌尾科噬菌体(cercoviridae)。psd2001为规则多面体结构，具有三维对称的头部；头部径长(l)＝118nm，头部宽度(w)＝79nm，l/w＝1.49；具有收缩的尾部(尾长＝116nm,尾宽＝19nm)。psd2002同样为规则多面体结构，具有三维对称的头部，头部径长(l)＝121nm，头部宽度(w)＝83nm，l/w＝1.46；具有收缩的尾部(尾长＝121nm,尾宽＝20nm)。噬菌体pnj1902、psd2001和psd2002的形态如图1所示。
46.2.2噬菌体测序
47.将噬菌体pnj1902、psd2001和psd2002的基因组在ncbi上进行核酸序列比对，结果表明：
48.pnj1902与salmonella phage vb_sals_abtnlsp9、salmonella phage vb_sals_abtnlsp4、salmonella phage se8、salmonella phage vb_sen
‑
e22、escherichia phage t5_ev212和salmonella phage se11比对的覆盖率分别为91％、90％、90％、90％，90％，90％一致性分别为98.46％、96.45％、97.44％、96.85％、96.98％、97.35％。但pnj1902编码的尾丝蛋白的基因与这几个相似性较高的噬菌体具有较大的差异，同源性<12％。pnj1902的尾丝蛋白的基因序列如seq id no.1所示。
49.psd2001与噬菌体escherichia phage p479、escherichia phage upec01、escherichia phage mn01、escherichia phage upec07比对的覆盖率分别为92％、91％、90％、90％，一致性分别为97.13％、96.17％、96.45％、95.91％。psd2001编码的尾丝蛋白的基因与这几个相似性较高的噬菌体具有较大的差异，同源性<30％。psd2001的尾丝蛋白的基因序列如seq id no.2所示。
50.psd2002与噬菌体escherichia phage wg01、escherichia phage vb_ecom_fb、shigella phage psd9、enterobacteria phage ql01、enterobacteria phage vb_ecom_ime540、enterobacteria phage bp7、enterobacteria phage js98、escherichia phage mn04、escherichia phage mx01、salmonella phage vb_salm_abtnlsp5比对的覆盖率分别为95％、92％、92％、91％、91％、90％、90％、90％、90％、90％，一致性分别为98.36％、
97.14％、95.36％、95.38％、97.92％、96.42％、92.77％、93.44％、95.36％、95.35％。
51.三株噬菌体的基因组注释结果和比较基因组分析结果表明，噬菌体pnj1902和psd2001与对应的基因组相似性较高的噬菌体在编码与结构组装、dna复制以及调控等功能上的基因有一定的差异，特别是编码尾丝蛋白的基因不同。表明两株噬菌体均为新的噬菌体。而噬菌体psd2002则与噬菌体escherichia phage wg01、escherichia phage vb_ecom_fb和shigella phage psd9高度相似。
52.另外，对其基因组进行毒力因子和耐药基因的分析，没有发现编码与毒力或耐药性相关的基因，结果表明将该混合噬菌体应用于动物肠道中的生物安全防控中没有潜在的安全风险。
53.实施例2噬菌体鸡尾酒体对大肠杆菌atcc:43895的体外裂解能力的测定
54.大肠杆菌atcc:43895在lb液体中培养至od
600nm
值为1，浓度约为108cfu/ml。用双层琼脂法培养新鲜噬菌体溶液，调整浓度至107pfu/ml。将200μl大肠杆菌atcc43895和单个噬菌体或噬菌体混合物1:1:1等体积(简称噬菌体鸡尾酒)加入96孔板中并充分混合，之后将96孔板置于37℃的恒温振荡器中，转速为180rpm/min。每1h测量一次混合溶液的od
600nm
值(无菌lb液为0)，记录数据。实验设对照组，加等量lb液。
55.试验结果表明，相比于应用单一噬菌体，所述的噬菌体鸡尾酒可以在35h内显著抑制浮游态大肠杆菌atcc43895的生长且不易产生抗性菌株(图2，大肠杆菌atcc43895在37℃下单独孵育(圆圈)；大肠杆菌atcc43895分别与噬菌体pnj1902(正方形)、psd2001(正三角)、psd2002(倒三角)或噬菌体鸡尾酒(菱形)一起孵育，每1h读取一次od
600 nm
值)。且裂解能力持续稳定，具有长时间的抑菌效果，至少35h都有良好的抑制效果。
56.实施例3噬菌体鸡尾酒对大肠杆菌atcc:43895生物被膜的清除能力
57.三种噬菌体按1:1:1比例混合制成噬菌体鸡尾酒。将大肠杆菌atcc:43895在96孔板上培养12h、24h、48h和60h后，分别用pbs洗涤3次以去除浮游细菌和培养基，然后每孔添加200μl噬菌体鸡尾酒(107pfu/ml)孵育24h。结晶紫染色法用于证实噬菌体对细菌生物被膜的清除作用。用噬菌体鸡尾酒处理的生物被膜样品用pbs缓慢洗涤3次以去除浮游细菌和培养基。之后每孔加入200μl 95％甲醇溶液，室温固定30min，然后用pbs漂洗3次。各孔加入0.1％结晶紫溶液30min，每孔用流水冲洗3次，最后每孔加入200μl 30％冰醋酸15min。使用分光光度计测量od
600nm
并记录数据。
58.试验结果表明，与对照相比，年龄为24h,36h,48h和60h的生物被膜显著减少(图3)。显着性分析结果显示：24h生物被膜(p≤0.01)、36h生物被膜(p≤0.01)、48h生物被膜(p≤0.001)和60h生物被膜(p≤0.001)。另外，噬菌体psd2002几乎没有生物被膜清除能力。但是，噬菌体pnj1902、psd2001和本技术的噬菌体鸡尾酒具有很强的去除不同年龄的大肠杆菌atcc:43895生物被膜的能力。
59.实施例4噬菌体鸡尾酒对感染大肠杆菌atcc:43895的小鼠治疗效果测定
60.三种噬菌体按1:1:1比例混合制成噬菌体鸡尾酒。将40只4周龄spf级icr小鼠(雌性)分为4组(10只小鼠/组)：第1组，小鼠口服灌胃200μl大肠杆菌atcc43895(1.29
×
109cfu/ml/只)，8h后灌胃200μl噬菌体鸡尾酒(3.6
×
108pfu/ml/只)进行治疗(大肠杆菌 噬菌体鸡尾酒组)；第2组，小鼠经口灌胃200μl pbs，8h后给予相同体积噬菌体鸡尾酒治疗(pbs 噬菌体鸡尾酒组)；第3组，小鼠经口灌胃等体积大肠杆菌atcc43895，8h后用等体积
pbs处理(阳性对照组)；第4组，小鼠经口灌胃等体积的pbs。灌胃前使其适应2
‑
3d。
61.在试验的第0d，小鼠经口接受100μl 1m碳酸氢钠中和胃酸，中和5min后，用200μl细菌培养液(1.29
×
109cfu/ml)接种攻菌后噬菌体鸡尾酒治疗组和攻菌后pbs对照组小鼠。8h后用噬菌体鸡尾酒(3.6
×
108pfu/ml)灌胃攻菌后噬菌体鸡尾酒治疗组和单纯噬菌体鸡尾酒组，24h后重复灌胃噬菌体鸡尾酒，重复2次。同时200μl pbs灌胃攻菌后pbs对照组和单纯pbs对照组，24h后重复灌胃pbs，该试验重复4次。之后连续观察2周，确定各组小鼠的存活情况，并绘制存活曲线。
62.试验结果：口服噬菌体鸡尾酒后，pbs 噬菌体鸡尾酒组和阴性对照组小鼠均未死亡，4次试验存活率均为100％；大肠杆菌 噬菌体鸡尾酒组2次存活率为100％，2次为90％。阳性对照组10只小鼠全部死亡，四次试验存活率均为0％(图4，每组小鼠的数量为10只。对于每组小鼠，显示的结果来自至少2个独立实验)，表明该噬菌体鸡尾酒对感染大肠杆菌atcc43895的小鼠具有较高的保护率。
63.实施例5噬菌体鸡尾酒治疗对小鼠增重的影响
64.三种噬菌体按1:1:1比例混合制成噬菌体鸡尾酒。实验将30只雌性spf icr小鼠(4周龄)随机分为3组(10只小鼠/组)：(1)大肠杆菌 噬菌体鸡尾酒(噬菌体治疗组)；(2)大肠杆菌 恩诺沙星(抗生素治疗组)；(3)pbs pbs(阴性对照组)。实验前，所有小鼠灌胃100μl 1m nahco3以中和胃酸。5min后，给小鼠灌胃200μl大肠杆菌(1.29
×
109cfu/ml)或pbs。8h后，不同组的小鼠分别灌胃200μl噬菌体鸡尾酒(3.6
×
108pfu/ml)、恩诺沙星(10mg/kg)或pbs。以24h的间隔重复第2次灌胃相同剂量噬菌体鸡尾酒和恩诺沙星，共重复2次。随后2周内，每天对小鼠的体重进行监测。
65.试验结果：小鼠体重变化监测结果显示，感染大肠杆菌后，第3天小鼠体重较阴性对照组均有显著下降(p≤0.01)(图5)。经过治疗后，第17天噬菌体治疗组的小鼠体重和阴性对照组无显著差异(p≥0.05)，而抗生素治疗组体重则显著低于阴性对照组(p≤0.001)。试验结果表明，与抗生素治疗相比，该噬菌体鸡尾酒的治疗更有利于小鼠体重的恢复。
66.实施例6噬菌体鸡尾酒治疗对小鼠体内炎症因子表达水平的影响
67.试验将30只雌性spf icr小鼠(4周龄)随机分为3组(10只小鼠/组)：试验分组与处理方式与实施例5中一样，随后每隔2天对小鼠十二指肠和结肠的il
‑
6、il
‑
1β和tnf
‑
α炎性因子水平进行监测，炎症因子转录水平的检测用elisa试剂盒(njjcbio，china)进行，每个测试进行3次。
68.试验结果：结果显示，感染大肠杆菌后，与阴性对照组相比，小鼠体内炎症因子il
‑
1β、il
‑
6和tnf
‑
α的水平在第1天显著增加(p≤0.05)(图6)。而经过治疗后，噬菌体治疗组中所有炎症因子水平均比抗生素治疗组下降得更快，且更趋近于阴性对照组的水平(图6)。结果表明，与抗生素相比，噬菌体治疗可使小鼠体内的炎性因子的表达更快的回复到健康水平。