泡桐内桐皮总黄酮的提取方法及其应用与流程

1.本发明属于抗炎药物研发技术领域，具体涉及一种泡桐内桐皮总黄酮的提取方法及其应用。


背景技术：

2.炎症反应是有害刺激条件下激发的复杂的生理过程，如炎性损伤，是机体对于刺激的一种防御反应。机体的免疫系统对监测并消除这种有害刺激并愈合损伤。几种类型的免疫细胞通过调节炎症介质的水平来维持体内平衡。巨噬细胞是最重要的炎症调节细胞，在炎症反应中具有三大功能，即抗原呈递、吞噬和免疫调节，抑制各种炎症细胞因子和生长因子。因此，巨噬细胞在炎症的发生、维持和解决中起着关键作用。抗炎药物大致可以分为两大类，一类是解热镇痛药又称非留体抗炎药，具有解热、镇痛、抗炎、抗风湿的作用。例如：阿司匹林、对乙酰氨基酷、安乃近、布洛芬、双氯灭痛、氯灭酸、安乃近、氨基比弗、萘普生、吡罗昔康、塞米昔布等；第二类是甾体类抗炎药，属于皮质激素类药物，例如：糖皮质激素等。非甾体类抗炎药物作用弱，副作用主要是胃肠道反应，还有心血管疾病的风险；甾体类抗炎药的抗炎作用强，但存在水钠潴留、变虚胖、骨质疏松等副作用。因此,从传统中药材或天然产物中寻找低毒高效的抗炎药物已成为当今世界新药开发的热点。而非甾体抗炎药常用于调节上述信号通路，降低炎症介质水平。关于非甾体类抗炎药物的副作用也使得草药或传统草药作为治疗炎症的补充和替代药物的使用近年来有所增加。
3.兰考泡桐(paulownia elongata s. y. hu)是玄参科泡桐属植物，在民间，泡桐树皮的汁液常被人民用于治疗蜂蛰和蚊虫叮咬等急性炎症，疗效极佳，但其具体机制仍不清楚。


技术实现要素：

4.针对目前泡桐抗炎机制不清楚的问题，本发明提供一种泡桐内桐皮总黄酮的提取方法及其应用。本发明解决其技术问题所采用的方案是：一种泡桐内桐皮总黄酮提取方法，包括以下步骤：s1、将泡桐内桐皮干燥、粉碎、过筛制成泡桐内桐皮粉末；s2、向泡桐内桐皮粉末中加入石油醚进行浸泡，用乙醇溶液在60℃下回流提取2次，提取1h得提取液，静置；s3、将冷却上清液与残液分离后混合在转子蒸发器中过滤浓缩；s4、用大孔吸附树脂进行色谱分离，然后用乙醇溶液，洗脱馏分真空浓缩后进行真空干燥制得成品，并将成品低温保存。
5.上述的泡桐内桐皮总黄酮的提取方法，步骤s2和步骤s4中所用乙醇溶液为70%乙醇溶液。
6.上述的泡桐内桐皮总黄酮的提取方法，步骤s4中将洗脱馏分在在40℃真空浓缩后
在60℃条件下进行真空干燥。
7.上述的泡桐内桐皮总黄酮的提取方法，步骤s4中将成品置于
‑
20℃条件下保存。
8.本发明还提供一种泡桐内桐皮总黄酮的应用，泡桐内桐皮总黄酮能够有效抑制炎症因子的表达，能够用于制备抗炎药物。
9.上述的应用，能够有效抑制il
‑
6和il
‑
6 mrna及il
‑
1β mrna的表达。
10.本发明的有益效果：本发明提供的泡桐内桐皮总黄酮的提取方法提取出的总黄酮的抗炎活性最佳，经泡桐总黄酮预处理的细胞上清液中促炎细胞因子的表达被显著抑制，且呈剂量依赖性方式，说明泡桐总黄酮能够有效抑制il
‑
6蛋白和il
‑
6 mrna及il
‑
1β mrna的表达，具有极好的抗炎效用。
附图说明
11.图1为本发明芦丁标准曲线图。
12.图2为泡桐总黄酮处理24h后raw264.7巨噬细胞存活率。
13.图3为泡桐总黄酮对lps激活的raw264.7细胞系no生成的影响。
14.图4为lps和泡桐皮总黄酮干预的巨噬细胞的形态特征图。
15.图5为泡桐皮总黄酮对lps刺激的raw264.7 巨噬细胞的il
‑
6蛋白表达的影响。
16.图6为泡桐皮总黄酮对lps刺激的raw264.7 巨噬细胞相对il
‑
6 mrna表达的影响。
17.图7为泡桐皮总黄酮对lps刺激的raw264.7 巨噬细胞的il
‑
1β mrna表达的影响。
具体实施方式
18.下面结合附图和实施例对本发明进一步说明。
19.实施例1：本实施例提供一种泡桐内桐皮总黄酮的提取方法，该方法包括以下步骤：s1、将泡桐内桐皮干燥、粉碎、过筛制成泡桐内桐皮粉末；s2、向泡桐内桐皮粉末中加入石油醚进行浸泡，用70%乙醇溶液在60℃下回流提取2次，提取1h得提取液，静置；s3、将冷却上清液与残液分离后混合在转子蒸发器中过滤浓缩；s4、用大孔吸附树脂进行色谱分离，然后用70%乙醇洗脱，洗脱馏分在40℃真空浓缩，60℃真空干燥制得成品，根据芦丁标准曲线公式y=7.515x 0.2369，计算泡桐皮总黄酮的得率为4.62%；将成品置于
‑
20℃条件下保存。
20.实施例2：泡桐内桐皮总黄酮细胞毒性及抗炎效果测定1、细胞培养与细胞毒性测定raw264.7 细胞系为鼠巨噬细胞系, 购置于中科院上海细胞所。细胞培养于含15% fbs, 100 u/ml 青霉素和100 u/ml链霉素的dmem 培养基中，37
º
c，5% co2下培养48h后传代备用。
21.cck
‑
8测定法用于确定raw 264.7巨噬细胞中延性假单胞菌类黄酮的细胞毒性。巨噬细胞在96孔板（2
×
104个细胞/孔）中生长，然后用不同浓度的泡桐皮总黄酮（12.5μg/ ml，25μg/ ml，50μg/ ml和100μg/ ml）处理细胞24小时。之后加入10％cck
‑
8工作液后，将巨噬细胞再孵育1小时。使用酶标仪（multimode plate reader，envision，perkinelmer，
monza，意大利）在450nm处测定吸光度。
22.细胞存活率（%）=药物作用组吸光度/正常对照组吸光度
×
100%。
23.经测定，如图2所示，12.5μg/ml、25μg/ml、50μg/ml和100μg/ml泡桐皮总黄酮作用于细胞后的细胞存活率分别为99%、98%、96%和82%。
24.当浓度小于100μg/ml时，泡桐总黄酮对raw 264.7巨噬细胞几乎没有细胞毒性作用。 因此，选择50μg/ ml的泡桐总黄酮为最大测试浓度。
25.2、泡桐皮总黄酮对lps刺激的raw264.7细胞系no生成量的影响巨噬细胞raw264.7的细胞密度调整到2
×
10
5 cells/ml，并接种于96孔板，每孔100μl用于细胞毒性评价。次日，细胞用lps (0.5 μg/ml)、含终浓度为0.5 μg/ml lps的泡桐皮总黄酮(12.5μg/ml, 25 μg/ml, 50 μg/ml)孵育，含终浓度为0.5 μg/ml lps的阿司匹林（20
µ
g/ml）为阳性对照，作用24 h。不加任何药物的细胞组为空白对照组。 24h后1000 rpm at 4
ꢀº
c离心10 min 收集培养液上清，用于griess法测定no含量。
26.作为no的主要稳定产物，使用sittisart等人描述的griess分析法检测培养基中亚硝酸盐的水平。在96孔板中将50μl上述细胞的孵育上清液与等体积的griess试剂混合，并在室温下孵育15min，并使用酶标仪在540nm处检测。使用线性亚硝酸钠校准曲线在3.125
‑
100
ꢀµ
m的浓度范围内计算样品中一氧化氮的含量。
27.以nano2为标准绘制标准曲线。制备10mmol / l nano2溶液，然后用dmem分别稀释至100 μmol/ l、50 μmol/ l、25 μmol/ l、12.5 μmol/ l、6.25 μmol/ l和3.125 μmol/ l。 将50
ꢀµ
l上述浓缩溶液与等体积的griess试剂在96孔板中混合，然后在室温下放置15min。 用酶标仪在540nm处测量吸光度。以吸光度为y轴，以no2的摩尔浓度为x轴，制作标准曲线。
28.在用lps刺激后，用泡桐皮总黄酮处理细胞后，确定培养基中的no浓度。对于对照组，raw264.7巨噬细胞中no的基础浓度为0.095μm，但在用0.5μg/ ml lps处理后，该值显着增加至4.96μm，表明raw264.7巨噬细胞中存在炎症反应。 然而，lps处理后的no浓度通过泡桐皮总黄酮的预处理以剂量依赖的方式显著降低，分别为1.5、2.08和3.27μm，阿司匹林组为0.35μm（见图3）。说明，随着泡桐皮总黄酮浓度的增大，细胞的炎症反应因子no的表达水平不断降低，且50μg/ ml组泡桐皮总黄酮的 no表达水平远低于阳性药物阿司匹林组，结果表明，泡桐皮总黄酮有显著的抗炎活性，3、药物干预后巨噬细胞形态学评价将收集上清后的细胞加入适量的dmem培养基，置于倒置显微镜下观察细胞形态并拍照。
29.raw264.7细胞用不同浓度的泡桐皮总黄酮预处理2h，然后再用lps激活24h。见图4，其中a为正常组；b为lps（0.5μg/ml）组； c为阿司匹林组（20 μg/ml）； d
‑
f为 lps（0.5μg/ml）联合泡桐皮总黄酮（12.5、25、50μg/ml）组。
30.在显微镜下观察到raw264.7细胞的形态变化，如图4所示。未激活的raw264.7细胞呈较为规则的圆形或近圆形（图4.a.），而lps激活的raw264.7细胞显示出肿胀，树突状，纺锤体或球形（图4.b.），这是激活的巨噬细胞的典型表型特征。先前的研究表明，巨噬细胞的形态变化与它们分泌的炎性细胞因子有关。泡桐皮总黄酮处理组的结果表明，随着泡桐皮总黄酮浓度的增加，巨噬细胞的形态从活化恢复为未活化（图4）。浓度为50μg/ ml的总黄酮组的巨噬细胞表型与对照组（图4a）和阿司匹林组（图4c）相似。说明泡桐皮总黄酮的干预作
用可降低巨噬细胞的炎症反应活化程度。
31.4、elisa法测定泡桐总黄酮对炎症因子表达水平的影响药物处理细胞的总rna 应用trizol
®ꢀ
试剂 (servicebio, wuhan, china) 提取分离获得，用cdna合成试剂盒合成cdna (g3330, servicebio, wuhan, china)。如前所述，使用磁感应循环仪（bms，澳大利亚）通过qpcr分析mrna水平。
32.il
‑
6基因引物序列为：顺5
’‑ꢀ
ccccaatttccaatgctctcc
‑3’ꢀ
,反5
’‑ꢀ
cgcactaggtttgccgagta
‑3’
。
33.il
‑
1β基因引物序列为：顺5
’‑ꢀ
cctcgtcccgtagacaaaatg
‑3’ꢀ
，反5
’‑
tgaggtcaatgaaggggtcgt
ꢀ‑3’
。
34.反应条件为：95
º
c10 min，40 个循环为15s at 95
º
c，60s at 60
º
c。relative fold change were calculated using themethod, where (a target sample) (a reference sample)。相对倍数变化使用2
‑
δδct
方法计算，其中δδct=δct （目标样品）
–
δct（参考样品）。
35.通过酶联免疫法（elisa法）测定并验证了泡桐皮总黄酮是否可以调节促炎细胞因子的产生。
36.用0.5 μg/ml的lps和不同浓度的泡桐皮总黄酮类化合物处理细胞，泡桐皮总黄酮浓度分别为12.5 μg/ml、25 μg/ml 和50 μg/ml。同时以20 μg/ml 阿司匹林作为阳性对照。数据代表三个独立实验的平均误差。与lps组比较，以双星号标记表示p<0.01，为极显著性差异，与 lps组比较，以单星号标记表示p < 0.05，为显著差异，并以 tukey 检验的单因子方差分析确定。
37.如图5
‑
7所示，elisa法结果显示，与正常对照组相比，lps处理显著增加了培养基中il
‑
6表达。而50μg/ml的泡桐皮总黄酮则显著降低了巨噬细胞的il
‑
6的表达水平，其表达水平低于阳性药物阿司匹林组。q
‑
pcr结果显示，泡桐总黄酮干预的lps诱导炎症反应模型细胞的il
‑
1β和il
‑
6的mrna的表达水平均在50μg/ml组显著降低，且均低于阳性对照阿司匹林组。
38.显然，经泡桐总黄酮预处理的细胞上清液中促炎细胞因子的表达被显著抑制，且呈剂量依赖性方式。结果表明，泡桐皮总黄酮是有着显著的抗炎活性的，能够用于制备抗炎药物有益于预防炎症性疾病。