一种8a型禽腺病毒毒株、灭活疫苗及其制备方法和应用与流程

技术特征：
1.一种8a型禽腺病毒毒株，其特征在于，所述毒株命名为dk02株，保藏编号为cctcc no:v202170，其中，所述病毒毒株为禽ⅰ群腺病毒中的e种，血清型为8a型，所述病毒可经9～10日龄鸡胚尿囊腔、绒毛尿囊膜、6日龄鸡胚卵黄囊途径培养，也可在鸡肝癌细胞lmh细胞上增殖；禽腺病毒dk02株分离自禽包涵体肝炎
‑
心包积水综合征病死鸡肝脏组织，采用鸡胚分离增殖获得，通过克隆及传代适应能在鸡肝癌细胞上适应增殖，毒株增殖能力强，免疫原性好，适合做疫苗毒株生产灭活疫苗。2.根据权利要求1所述的毒株，其特征在于，所述毒株制备的生物制品疫苗，含悬浮鸡肝癌细胞培养的禽i群腺病毒dk02株灭活抗原，含量为灭活前≥10
8.5
tcid
50
/0.1ml。3.根据权利要求1所述毒株的制备方法，其特征在于，所述毒株是通过蚀斑克隆纯化得到，具体制备方法包括以下步骤：(1)选取铺满单层的lmh贴壁细胞，弃掉原培养液，加入含有1％禽腺病毒dk02株病毒液的细胞维持液，置于37℃，5％co2培养，当细胞病变达80％以上时，冻融2次，收获病毒液，即为f1代病毒，将f1代病毒在lmh贴壁细胞上传代至f5，进行驯化培养；(2)将f5代禽腺病毒dk02株病毒液用dmem进行10倍梯度稀释至10
‑5～10
‑9后接种至生长成致密单层的lmh细胞，吸附1h后，弃掉液体，加铺约3mm厚的第一层营养琼脂，所述第一层营养琼脂含有终浓度为1％低熔点琼脂糖和含2％胎牛血清的dmem，置co2培养箱，37℃，5％co2条件下倒置培养48h后，待细胞出现病变时加铺第二层营养琼脂，所述第二层营养琼脂含有终浓度为1％低熔点琼脂糖和含2％胎牛血清的1
×
dmem，37℃，5％co2条件下避光倒置培养；(3)待蚀斑形成后用滴头吸出，连同琼脂糖一起放入1.0ml的不含血清dmem中，反复冻融3次，使病毒充分释放，接种新的空白lmh细胞，进行病毒增殖，如此重复克隆三次，随机挑选第四代克隆的五个蚀斑，即f9代病毒进行培养，测定病毒含量，分别挑选病毒含量最高的一株毒，通过lmh细胞继续传代，即可获得纯化后的禽i群腺病毒dk02株病毒液。4.根据权利要求1所述的毒株，其特征在于，该毒株适应于贴壁及悬浮lmh细胞培养，所述方法包括以下步骤：(1)贴壁lmh细胞制备及病毒接种、收获：选取长势良好的lmh贴壁细胞，弃掉原培养液，加入含有1％禽腺病毒dk02株病毒液的细胞维持液，置于37℃，5％co2培养，当细胞病变达80％以上时，冻融2次，收获病毒液，即为适应于贴壁lmh细胞培养的dk02株病毒液；(2)悬浮lmh细胞制备及病毒接种、收获：选取初始密度约为200万的悬浮lmh细胞，将由贴壁lmh细胞扩繁得到的禽腺病毒dk02株基础种毒用dmem进行适当稀释后接种至悬浮lmh细胞中，于37℃，120rpm振摇培养72～96h后，冻融2次，收获病毒液，分装注明毒种代次及收获时间。5.根据权利要求1所述的毒株，其特征在于，所述禽腺病毒dk02株在制备预防由禽i群8a型腺病毒引起包涵体肝炎的兽用疫苗上的应用。6.一种i群e种8a型禽腺病毒的灭活疫苗，其特征在于，所述疫苗的抗原来自禽腺病毒dk02株。7.根据权利要求6所述的灭活疫苗，其特征在于，所述灭活疫苗的制备方法包括如下步骤：油相制备：
取矿物油95份，硬脂酸铝1份，在油相制备管中混合均匀并加热至75～85℃后，再加5份司本80，至温度达到110～120℃时维持20～40分钟，冷却后完成油相制备；水相制备：将所述dk02株接种悬浮lmh细胞，培养72～96h，收获培养物为病毒液；取灭活的禽腺病毒血清8a型病毒抗原液95份，灭菌的5份吐温80，充分混匀；乳化：取2份油相，1份水相，放入乳化罐中搅拌，即得所述灭活疫苗。

技术总结
本发明涉及兽用生物制品技术领域，具体公开了一种8a型禽腺病毒毒株、灭活疫苗及其制备方法和应用。该毒株属于I群E种8a型，命名为DK02株，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:V202170。实验表明，本发明DK02株适应于悬浮LMH细胞(鸡肝癌细胞)且产毒量高，致病力强，免疫原性好。本发明还提供的DK02株在制备预防包涵体肝炎的疫苗上的应用。本发明提供一种禽I群腺病毒血清8a型的灭活疫苗，用于预防包涵体肝炎。免疫实验鸡后，能够很好地预防近年来由禽I群8a型腺病毒引起的鸡“包涵体肝炎”，攻毒保护率高，安全性高，抗体产生快，效力稳定。效力稳定。效力稳定。


技术研发人员：夏梦圆 罗意 罗峻 何怡 许俊才
受保护的技术使用者：贵州福牧生物技术研究有限公司
技术研发日：2021.10.18
技术公布日：2021/12/7