芋球茎发育过程中内参基因筛选及其应用的制作方法

芋球茎发育过程中内参基因筛选及其应用
【技术领域】
1.本发明涉及植物基因技术领域，特别涉及芋球茎发育过程中内参基因筛选及其应用。


背景技术：

2.芋(colocasia esculenta)又称芋头、芋艿、毛芋，是天南星科芋属的多年生草本植物。芋最初产于东南亚，之后向东传播到远东亚洲和大洋洲，向西传播到地中海地区，目前在全球范围内广泛种植，是很多非洲和亚洲太平洋岛国居民的主要粮食，与其它块茎和块根植物相比，芋具有更高的营养价值。芋球茎的碳水化合物含量几乎是马铃薯的两倍，蛋白质含量也比山药、木薯、红薯高11％，由于存在如此丰富的营养物质含量，了解这些营养物质组成的遗传基础很重要。
3.但是目前对该作物的研究不多，近年来，随着高通量测序和分子生物学研究的不断发展，基因的表达分析也逐渐应用于揭示芋基因表达和调控机理的研究。随着芋基因组的测序，更加加快了芋相关性状的遗传机理解析。
4.实时荧光定量pcr(quantitative real
‑
time pcr,qrt
‑
pcr)是目前检测基因表达水平的主要分析手段。qrt
‑
pcr结果的可靠性受到初始样本量、rna完整性、cdna质量和扩增效率等因素的影响。因此，表达稳定的内参基因对比较不同样本目的基因表达水平至关重要，正确选择合适的内参基因进行校正和标准化，才能获得准确的qrt
‑
pcr结果。目前，植物中常用来作为内参基因的基因有肌动蛋白(actin)、微管蛋白基因(β
‑
tubulin,tub)、转录延伸因子基因(elongation factor,ef1a和ef1b)、真核起始因子(eukaryotic initiation factor,eif)、泛素结合酶基因(ubiquitin
‑
conjugating enzyme,ubc)、组蛋白(histone,h3
‑
1)、甘油醛
‑3‑
磷酸脱氢酶(glyceraldehyde
‑3‑
phosphate dehydrogenase,gapdh)等。但是随着研究的深入，以往认为的很多内参基因(如actin等)在一定的实验条件下其表达量并不稳定。因此，在实际研究中，需要针对样本的不同组织或者不同生长发育时间段进行取材来筛选出稳定表达的内参基因。
5.本技术基于课题组前期对芋球茎不同发育阶段的样本进行转录本测序的数据，利用qrt
‑
pcr分析候选基因在芋球茎8组不同发育时期表达稳定性，利用三种内参基因稳定性分析软件genorm、normfinder和bestkeeper分析候选内参基因在不同发育时期的稳定性并进行综合分析排序，为今后能更好开展芋球茎发育相关功能基因表达研究提供了参考依据。


技术实现要素：

6.鉴于上述内容，有必要挖掘芋的内参基因，可以很好的对芋的表达分析提供重要参考。
7.为达到上述目的，本发明所采用的技术方案是：
8.芋内参基因gene
‑
taro_030192，所述内参基因gene
‑
taro_030192的核苷酸序列如
序列表seq id no.1所示。
9.进一步的，所述引物对其上游序列如序列表seq id no.2所示，下游序列如序列表seq id no.3所示。
10.本发明还包括所述的芋内参基因gene
‑
taro_030192在芋球茎发育不同时期进行荧光定量表达分析的应用。
11.进一步的，所述芋球茎发育不同时期分别为：播种后30d、60d、90d、120d、150d、180d、210d、240d的球茎。
12.进一步的，所述荧光定量表达分析优选的引物对其上游序列如序列表seq id no.2所示，下游序列如序列表seq id no.3所示。
13.进一步的，所述荧光定量表达分析的pcr反应体系共20μl为：2x sybr green master mix 10μl、10μm上游引物0.4μl、10μm上游引物0.4μl、rnase
‑
free water 8.2μl、cdna1μl；pcr反应程序为95℃预变性3min；95℃变性10s，57℃退火15min，72℃延伸20s总共45个循环；采集荧光信号。
14.本发明的芋内参基因gene
‑
taro_030192，筛选方法为：1、对芋球茎整个发育期连续取样，每隔30d进行规律性取样，即分别取播种后30d、60d、90d、120d、150d、180d、210d、240d的球茎，共8组样本，标记为yts1、yts2、yts3、yts4、yts5、yts6、yts7、yts8为芋球茎材料，提取芋球茎rna；2、反转录合成相应的芋球茎cdna；3、根据不同基因设计不同引物并在荧光定量pcr仪上进行反应，绘制溶解曲线，进行稳定性分析，获得稳定性好、表达效果好的内参基因。
15.本发明具有如下有益效果：
16.本发明对芋球茎整个发育期连续取样，每隔30d进行规律性取样，即分别取播种后30d、60d、90d、120d、150d、180d、210d、240d的球茎，共8组样本，标记为yts1、yts2、yts3、yts4、yts5、yts6、yts7、yts8为芋球茎材料，根据rna
‑
seq测序数据分析，利用软件评估并分析各个候选内参基因在球茎的整个发育阶段中的表达稳定性，并利用目的基因验证，最终筛选出比常用的管家基因更为稳定的内参基因gene
‑
taro_030192，最大程度地减小了由于内参基因的选择造成样品之间和样品内部的差异，为后期利用q rt
‑
pcr探索芋球茎发育相关关键基因奠定了坚实的基础。
【附图说明】
17.图1是球茎样品rna琼脂糖凝胶电泳图，图中泳道1为yts1、2为yts2、3为yts3、4为yts4、5为yts5、6为yts6、7为yts7、8为yts8；
18.图2为候选内参基因gene
‑
taro_030192在球茎发育的pcr检测电泳图；
19.图3为候选内参基因gene
‑
taro_005478在球茎发育的pcr检测电泳图；
20.图4为候选内参基因gene
‑
taro_012907在球茎发育的pcr检测电泳图；
21.图5为候选内参基因gene
‑
taro_016279在球茎发育的pcr检测电泳图；
22.图6为候选内参基因gene
‑
taro_031479在球茎发育的pcr检测电泳图；
23.图2
‑
6中，m为marker dl2000；泳道1
‑
3为芋头yts1的3个平行样；泳道4
‑
6为芋头yts2的3个平行样；泳道7
‑
9为芋头yts3的3个平行样；泳道10
‑
12为芋头yts4的3个平行样；泳道13
‑
15为芋头yts5的3个平行样；泳道16
‑
18为芋头yts6的3个平行样；泳道19
‑
21为芋头
yts7的3个平行样；泳道22
‑
24为芋头yts8的3个平行样。
24.图7为候选内参基因gene
‑
taro_030192基因的qpcr的扩增曲线图；
25.图8为候选内参基因gene
‑
taro_005478基因的qpcr的扩增曲线图；
26.图9为候选内参基因gene
‑
taro_012907基因的qpcr的扩增曲线图；
27.图10为候选内参基因gene
‑
taro_016279基因的qpcr的扩增曲线图；
28.图11为候选内参基因gene
‑
taro_031479基因的qpcr的扩增曲线图；
29.图12为候选内参基因gene
‑
taro_030192基因的qpcr的溶解曲线图；
30.图13为候选内参基因gene
‑
taro_005478基因的qpcr的溶解曲线图；
31.图14为候选内参基因gene
‑
taro_012907基因的qpcr的溶解曲线图；
32.图15为候选内参基因gene
‑
taro_016279基因的qpcr的溶解曲线图；
33.图16为候选内参基因gene
‑
taro_031479基因的qpcr的溶解曲线图；
34.图17为五个候选内参基因在芋球茎不同发育时期的ct值箱线图；
35.图18为genorm软件对候选内参基因的表达稳定排序；
36.图19为genorm软件分析内参基因变异系数柱状图；
37.图20为gene
‑
taro_030192基因在芋头球茎中做为内参基因的表达情况图。
【具体实施方式】
38.为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合附图对本发明的具体实施方式做详细的说明。在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明。但是本发明能够以很多不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似改进，因此本发明不受下面公开的具体实施的限制。
39.实施例1：
40.本实施例为内参基因gene
‑
taro_030192的获得，其通过如下方法得到：
41.一、本实施例的试验材料：
42.本实施例的芋材料为广西农业科学院生物技术研究所选育的芋新品种桂芋2号。2020年3月份种植于广西农业科学院里建科研基地。球茎整个发育期连续取样，每隔30d进行规律性取样。分别取播种后30d、60d、90d、120d、150d、180d、210d、240d的球茎，共8组样本，标记为yts1、yts2、yts3、yts4、yts5、yts6、yts7、yts8。每组样本三个生物学重复。将采集的球茎削皮，切成2cm左右小块，放入50ml的无菌冷冻管中，液氮速冻后放入
‑
80℃冰箱中备用。
43.二、总rna提取、检测与c dna合成：
44.利用美基生物难提植物总rna小提试剂盒(r4165)提取球茎总rna，操作步骤参照试剂盒说明书操作。使用1.5％琼脂糖凝胶电泳检测提取rna的完整性，同时利用nanodrop2100检测rna的浓度和质量。使用诺唯赞公司的hiscript ii q rt supermix for qpcr( gdna wiper)(r223
‑
01)的反转录试剂盒，将1μg的总rna反转录成cdna。总反应体系8μl，4
×
gdna wiper mix 2μl，总rna1μg，加rnase
‑
free water纯水补足至8μl。轻柔混匀后进行反转录反应，反应条件设置为：50℃、15min，85℃、5s，随即将cdna 储存于
‑
20℃冰箱备用。
45.三、内参基因的选择与特异性引物的设计：
46.根据芋球茎不同发育阶段的转录组测序数据，挑选表达量值相对稳定，使用变异系数(cv)进行评估，选择cv值小于0.2，且cdna≧1000bp的基因作为候选内参基因。从候选内参基因中，根据芋基因的表达量值，选取了5个fpkm在25～35的基因，分别为gene
‑
taro_005478，gene
‑
taro_012907，gene
‑
taro_016279，gene
‑
taro_030192，gene
‑
taro_031479(表1)。利用primer premier 6软件设计5个候选内参基因的特异性引物，引物长度在146～185bp，引物由北京擎科生物技术有限公司(南宁)进行合成(表2)。
47.表1候选内参基因在球茎发育过程中的fpkm值
[0048] s1s2s3s4s5s6平均值gene
‑
taro_01627925.92376327.79324924.37470423.94210225.45329728.68302826.028357gene
‑
taro_03147927.44555429.94356726.51650627.2638124.11626927.43697227.120446gene
‑
taro_01290728.68737529.15111733.72609426.46127626.20829225.27509328.251541gene
‑
taro_00547834.74626233.32901832.0934525.12223130.08079835.48090531.808777gene
‑
taro_03019235.32780838.39828630.18963528.88595427.97134930.1092831.813719
[0049]
表2芋5个候选内参基因的引物
[0050][0051]
四、内参基因的qpcr：
[0052]
将cdna样品稀释10倍作为模板上机检测。定量pcr实验，采用的仪器为：aceq_qpcr_sybr green_master_mix定量pcr仪：德国analytikjena qtowere2.2。
[0053]
pcr反应体系共20μl：2x sybr green master mix 10μl、10μm上游引物0.4μl、10μm上游引物0.4μl、rnase
‑
free water 8.2μl、cdna1μl；
[0054]
pcr反应程序为95℃预变性3min；95℃变性10s，57℃退火15min，72℃延伸20s总共45个循环；采集荧光信号，每组样品各设三次生物重复和三次技术重复。
[0055]
上述pcr反应过程中各基因所用到的引物如上表2所示：
[0056]
五、数据处理与分析
[0057]
利用genorm、normfinder和bestkeeper三个算法不相同的软件单独分析候选内参基因的稳定性高低。genorm和normfinder是利用2
‑△
ct
值表示其内参基因的表达稳定性。而bestkeeper根据各候选内参基因的ct值评价其稳定性。最后通过几何平均值法进行综合排序。
[0058]
六、结果与分析
[0059]
总rna样品与引物特异性检测
[0060]
提取球茎发育8个阶段的rna后对其质量进行评估。如电泳结果所示(图1)，显示有两条完整条带，且28s亮度高于18s，说明rna完整性较好，无降解。nanodrop2100测得rna浓
度为161.5～339.0ng/μl，od260/280均在1.91～2.11之间，表示rna纯度较高。结果如图1所示，图1为各个样品的rna凝胶电泳图；图中从左到右的泳道依次为1为yts1、2为yts2、3为yts3、4为yts4、5为yts5、6为yts6、7为yts7、8为yts8。从图可见，上述8个条带均表现出图谱清晰，条带亮度高，总rna完整性好，符合试验要求。
[0061]
候选内参基因的特异性分析
[0062]
内参基因的pcr扩增产物电泳检测结果(如图2)所示，其余4个对比基因的pcr扩增产物电泳检测结果(如图3
‑
6)显示；图2
‑
6中m为marker dl2000；泳道1
‑
3为芋头yts1的3个平行样；泳道4
‑
6为芋头yts2的3个平行样；泳道7
‑
9为芋头yts3的3个平行样；泳道10
‑
12为芋头yts4的3个平行样；泳道13
‑
15为芋头yts5的3个平行样；泳道16
‑
18为芋头yts6的3个平行样；泳道19
‑
21为芋头yts7的3个平行样；泳道22
‑
24为芋头yts8的3个平行样。从图中可见，5个候选内参基因均可见与预期产物长度大小相一致的单一条带，不存在引物二聚体。
[0063]
对qrt
‑
pcr结果中5个候选基因的扩增曲线进行分析，结果如图7
‑
11所示；图7为gene
‑
taro_030192的扩增曲线、图8为gene
‑
taro_005478的扩增曲线、图9为gene
‑
taro_012907的扩增曲线、图10为gene
‑
taro_016279的扩增曲线、图11为gene
‑
taro_031479的扩增曲线；由图可知，5个候选内参基因的扩增曲线均很好。
[0064]
对5个候选基因的溶解曲线进行分析，结果如图12
‑
16所示，图12为gene
‑
taro_030192基因的溶解曲线、图13为gene
‑
taro_005478基因的溶解曲线、图14为gene
‑
taro_012907基因的溶解曲线、图15为gene
‑
taro_016279基因的溶解曲线、图16为gene
‑
taro_031479基因的溶解曲线；
[0065]
从图12
‑
图16的溶解曲线分析发现，溶解曲线均只有一个单峰，表明扩增条带单一，特异性强，没有非特异性扩增出现。因此，所设计的实时荧光定量pcr引物特异性强，扩增效率高，能够用于芋球茎发育的荧光定量pcr的内参引物试验。
[0066]
候选基因的ct值分析
[0067]
ct值是表达基因丰富度的重要衡量标准。ct值与表达丰富程度呈反比关系。对5个内参基因在芋球茎不同发育时期进行表达丰度分析发现(结果如图17所示)，5个候选内参基因的ct值全部介于26.38～32.68之间，表明这些基因的整体表达量比较接近。其中，gene
‑
taro_005478在球茎不同发育阶段的ct值为27.18～28.59，最大值和最小值相差1.46个循环；gene
‑
taro_012907在球茎不同发育阶段的ct值为27.86～29.62，最大值和最小值相差1.76个循环；gene
‑
taro_016279在球茎不同发育阶段的ct值为26.38～27.42，最大值和最小值相差1.03个循环；gene
‑
taro_030192在球茎不同发育阶段的ct值为27.73～29.35，最大值和最小值相差1.62个循环；gene
‑
taro_031479在球茎不同发育阶段的ct值为30.12～32.68，最大值和最小值相差2.55个循环。
[0068]
内参基因的稳定性分析
[0069]
本研究用内参分析软件genorm、normfinder及bestkeeper软件作为辅助，对上述5个候选内参基因从多方面一致评估分析。
[0070]
genorm软件对候选内参基因的稳定性评估
[0071]
genorm程序通过计算出每个内参基因稳定性的m值来筛选出稳定性较好的内参基因，判定标准为m值越小内参基因稳定性越好，反之，则稳定性越差，若m值大于1.5，则不考虑为内参基因。按照表达稳定性从高到低，依次为gene
‑
taro_030192(0.386)﹥gene
‑
taro_
012907(0.390)﹥gene
‑
taro_005478(0.455)﹥gene
‑
taro_016279(0.512)﹥gene
‑
taro_031479(0.621)。所有候选内参基因m值都小于1.5，均有可能是适合的内参基因。其中以gene
‑
taro_030192和gene
‑
taro_012907的m值最小，稳定性也越好(图18)。
[0072]
genorm软件还可计算引入1个新的内参基因后标准化因子的配对变异v值，被称作：“配对变量(vn/n 1)”。依据公式可判断内参基因的具体个数。为确保单一内参基因不引起偏差和波动，genorm软件基于计算得到配对差值vn/n 1来保证该条件下内参基因的最合适的数量。该公式中临界值定为0.15，若vn/n 1大于0.15，则选择的内参基因个数要满足n 1个；若vn/n 1小于0.15，则选择内参基因为n个时，就可满足该软件实验要求。genorm柱状图分析表明当选择v2/3值(0.112)﹤0.15(图19)，内参基因组合最佳数目是2个。因此，芋球茎不同发育时期最合适的内参基因有gene
‑
taro_030192和gene
‑
taro_012907。
[0073]
normfinder软件对候选内参基因的稳定性评估
[0074]
normfinder软件程序算法与genorm程序类似，也是先获得内参基因表达稳定值，再根据稳定值大小来筛选最合适的内参基因，判定标准为表达稳定值最小的候选内参基因为合适内参基因。normfinder程序不但可以比较候选内参基因的表达差异，还可以汁算样品组间的变异，但该程序只能筛选出一个最合适的内参基因。
[0075]
normfinder软件对5个候选内参基因的评估结果显示，内参基因表达稳定值gene
‑
taro_030192(0.045)﹥gene
‑
taro_012907(0.057)﹥gene
‑
taro_005478(0.225)﹥gene
‑
taro_016279(0.289)﹥gene
‑
taro_031479(0.399)，结果与genorm软件评估结果一致。在芋球茎不同发育过程最合适内参基因为gene
‑
taro_030192。
[0076]
bestkeeper对候选内参基因的分析结果
[0077]
bestkeeper软件通过计算样品数据，获得基因间相关配对系数(r)，标准偏差(sd)和变异相关系数(cv)，利用这3项参数判定内参的稳定性。当相关系数r越高、变异系数(cv)和标准偏差(sd)越低，则内参基因就越稳定。另外，当标准偏差sd大于1时，认为该候选内参基因表达不稳定，具体如表3。
[0078]
根据sd值排序，gene
‑
taro_016279﹥gene
‑
taro_005478﹥gene
‑
taro_030192﹥gene
‑
taro_012907﹥gene
‑
taro_031479，但所有候选的5个内参基因sd值均小于1，最合适的为gene
‑
taro_016279，gene
‑
taro_005478，gene
‑
taro_030192。
[0079]
表3 bestkeeper软件分析内参基因稳定值
[0080][0081][0082]
内参基因的稳定性分析
[0083]
通过对三种内参基因软件进行比较和分析，发现bestkeeper软件的分析结果与genorm、normfinder的分析结果有差异。由于genorm和normfinder统计算法是以ct值为原始数据，求2
‑
δct
值，得出的结果一致。在excel中对3款软件的分析结果进行综合性评价；几
何平均值越小，内参基因则越稳定。从表4可以看出gene
‑
taro_030192在三款软件的几何平均值为1.44，在5个候选基因中几何平均值最小，为最稳定的内参基因。因此，5个候选基因中，gene
‑
taro_030192为最合适的内参基因。
[0084]
表4 genorm、normfinder和bestkeeper三款软件综合分析结果
[0085] genorm排序nomfinder排序bestkeeper排序几何平均值gene
‑
taro_0054783322.62gene
‑
taro_0129072242.52gene
‑
taro_0162794412.52gene
‑
taro_0301921131.44gene
‑
taro_0314795555.00
[0086]
实施例2：
[0087]
根据实施例1筛选出来的稳定性最佳的基因gene
‑
taro_030192进行进一步的验证，保证得出真实可靠的定量数据。以gene
‑
taro_030192作为内参基因，选择球茎发育过程中淀粉合成关键酶基因ceagps1基因作为目的基因，分析目的基因在芋球茎发育的8个时期表达，具体如下：
[0088]
分别提取不同时期：即芋整个发育期，即播种后30d、60d、90d、120d、150d、180d、210d、240d的球茎(标记为yts1、yts2、yts3、yts4、yts5、yts6、yts7、yts8)时期的cdna为作为定量pcr的模板，以gene
‑
taro_030192基因为内参基因，以adp
‑
葡萄糖焦磷酸化酶小亚基基因ceagps1为目的基因设计引物，引物见表5：
[0089]
表5内参基因和目的基因的引物序列
[0090][0091]
在实时荧光定量pcr检测仪上进行荧光定量反应，反应的
[0092]
pcr反应体系共20μl：2x sybr green master mix 10μl、10μm上游引物0.4μl、10μm上游引物0.4μl、rnase
‑
free water 8.2μl、cdna1μl；
[0093]
pcr反应程序为95℃预变性3min；95℃变性10s，57℃退火15min，72℃延伸20s总共45个循环；采集荧光信号。
[0094]
反应结束后使用2
‑
δδ
ct法所有的数据均表示为平均值
±
标准偏差。实时荧光定量pcr数据分析用spss 17.0和microsoft office excel 2007进行统计分析，采用spss17.0软件方差分析，采用excel 2010软件制图。
[0095]
得到的反应结果如图20所示，表明：内参基因gene
‑
taro_030192在芋整个发育期，即播种后30d、60d、90d、120d、150d、180d、210d、240d的球茎均能稳定的表达，能很好反映ceagps1在球茎发育过程的表达量变化。
[0096]
综上所述，基因gene
‑
taro_030192可在芋球茎发育过程中进行稳定表达，能做为芋球茎发育不同时期荧光定量的内参基因，能为今后对芋重要功能性状基因的研究奠定基础。
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以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明的保护范围应以所附权利要求为准。