一种ACE2环肽模拟物及其在抑制新冠假病毒中的用途的制作方法

一种ace2环肽模拟物及其在抑制新冠假病毒中的用途
技术领域
1.本发明涉及一种在微摩尔级别有效抑制新冠假病毒的ace2环肽模拟物及其用途。


背景技术：

2.对抗新冠病毒的最有效的途径之一是阻断新冠病毒表面刺凸蛋白rbd与ace2受体间的蛋白质
‑
蛋白质相互作用。绝大多数抑制新冠病毒的抗体药物都是通过阻碍病毒rbd与ace2的相互作用而发挥生物活性。需要指出，抗体药物存在其内在的缺陷，包括组织穿透性差，保存和运输需要低温，价格十分昂贵。相比而言，多肽药物有几个显著的优势，例如组织穿透力好，可以在常温下运输和保存，生产成本低。ace2主要通过其一段螺旋结构的肽与新冠病毒的rbd发生相互作用。基于此，人们提出了使用ace2的螺旋结构多肽来达到抑制新冠病毒的目的。不幸地是，前人已经报道的ace2的螺旋肽模拟物几乎都不能抑制新冠假病毒，不能够有效阻碍新冠病毒感染人细胞。


技术实现要素：

3.本发明针对上述现有技术所存在的问题，提供了一种ace2环肽模拟物及其在抑制新冠假病毒中的用途。基于ace2的一个螺旋区域的多肽序列，本发明通过结合氨基酸的优化，侧链
‑
侧链共价交联，和多肽酰基肼与苯二甲醛的还原胺基化反应，得到一个能在微摩尔级别抑制新冠假病毒的ace2环肽模拟物。与ace2的天然螺旋肽相比，本发明涉及的多肽能够显著抑制新冠假病毒，预期将为新冠病毒的治疗和快速体外检测提供有前景的候选分子。
4.本发明ace2环肽模拟物为一种环肽的二聚化结构；所述环肽是侧链
‑
侧链环化的多肽，其c端含有酰基酰肼结构，多肽序列中两个cys的侧链巯基与4，4
’‑
二溴甲基联苯反应后形成两个硫醚键；所述环肽的c端第一个氨基酸为6
‑
氨基己酸(ahx)；所述二聚化结构是指在nacnbh3作用下，两个多肽酰肼与苯二甲醛(包括邻位，间位和对位苯二甲醛)发生还原胺基化而产生的共价二聚体。
5.本发明ace2环肽模拟物，其结构如下所示：
[0006][0007]
本发明ace2环肽模拟物是以线性酰肼肽为原料，依次通过侧链
‑
侧链交联和酰肼肽与苯二甲醛的还原胺基化改造而获得的环肽分子。制备过程包括如下步骤：
[0008]
步骤1：制备肼
‑2‑
cl
‑
trt树脂
[0009]
使用dmf溶胀2
‑
ci
‑
trt
‑
cl树脂，用5％水合肼的dmf溶液重复处理2
‑
cl
‑
trt
‑
cl树脂，随后树脂被dcm和meoh处理，干燥后得到目标肼
‑2‑
cl
‑
trt树脂。
[0010]
步骤2：固相组装酰肼肽
[0011]
新制的肼
‑2‑
cl
‑
trt树脂转移到干净的固相合成管，dmf洗涤树脂3次，采用经典的fmoc法固相组装目标多肽序列。完成序列拼接后，tfa切割试剂裂解树脂2小时，通过冰乙醚沉淀线性酰肼肽。酰肼肽的序列为：
[0012]
acnh
‑
pro
‑
thr
‑
ile
‑
glu
‑
glu
‑
gln
‑
val
‑
lys
‑
tyr
‑
phe
‑
cys
‑
glu
‑
trp
‑
phe
‑
asp
‑
ala
‑
glu
‑
cys
‑
glu
‑
asp
‑
lys
‑
phe
‑
tyr
‑
leu
‑
ser
‑
ahx
‑
conhnh2(ahx＝6
‑
氨基己酸)。
[0013]
步骤3：侧链
‑
侧链环化修饰
[0014]
采用高效液相色谱纯化粗产品酰肼肽，得到粉末状纯净物；在新配的dmf/h2o/nh4hco3中，纯的酰肼肽与4,4
‑
二溴甲基联苯发生反应，形成侧链
‑
侧链环化的酰肼肽。
[0015]
步骤4：酰肼肽与苯二甲醛的还原胺基化
[0016]
在acoh/meoh中，氰基硼氢化钠的作用下，侧链
‑
侧链环化的酰肼肽与1,3
‑
苯二甲醛、1，2
‑
苯二甲醛或1，4苯二甲醛发生还原胺基化，形成目标产物环肽二聚物。
[0017]
具体过程如下：
[0018]
(1)肼
‑2‑
cl
‑
trt树脂的制备
[0019]
称134mg 2
‑
ci
‑
trt
‑
cl树脂(载量0.56mmol/g，75μmol)，转至固相合成管；4ml的dmf溶胀30分钟后，分别用dcm和dmf清洗树脂三次；加入新制的1.75ml 5％水合肼，常温震荡树脂30min，重复该操作后，加入2.5ml 20％meoh/dmf，常温震荡树脂20min后，dmf洗涤树脂5次，得到肼
‑2‑
cl
‑
trt树脂。
[0020]
(2)fmoc法拼接酰肼肽
[0021]
肼
‑2‑
cl
‑
trt树脂转到固相合成管中，加入新制备的dic/oxyma/6
‑
氨基己酸混合液(10当量dic:10当量oxyma：10当量6
‑
氨基己酸，2ml dmf)，在55℃震荡40分钟后，dcm充分洗涤树脂；加1ml醋酸酐试剂(醋酸酐：2,6
‑
二甲基吡啶：dmf＝5:6:89)，震荡2min后，树脂被
dmf充分洗涤三次；20％哌啶溶液加入，震荡树脂8min后，丢弃20％哌啶，哌啶处理步骤重复一次；dmf充分洗涤树脂三次，加新配制的dic/oxyma/fmoc
‑
ser(tbu)
‑
oh混合液(10eq dic:10eq oxyma：10eq fmoc
‑
ser(tbu)
‑
oh，2ml dmf)，在55℃震荡40min。按照多肽的序列信息重复上面的操作，直至所有的肽缩合完成。2ml封闭试剂(醋酸酐：2,6
‑
二甲基吡啶：dmf＝5:6:89)被用来乙酰化n末端胺基。
[0022]
依次用dmf和dcm充分洗涤树脂；晾干树脂后，6ml tfa切割加入(tfa：间甲酚：水：tips＝88:5:5:2，v/v)，常温震荡2小时后，汇集切割液，加入预先冰冷的乙醚，离心获得粉末状粗肽；经过半制备hplc纯化，真空冷冻干燥后得到粉末状纯化酰肼肽。
[0023]
(3)侧链
‑
侧链环化修饰
[0024]
10mg线性酰肼肽溶在2.0ml dmf：h2o混合物(2:1，v:v)中；称1.4mg 4,4
‑
二溴甲基联苯，溶解在0.1ml dmf溶解；两液体混合后，用1.0m nh 4
hco3调节ph值至8.0，常温反应2h后，加入3ml乙腈:h2o(1:1，v:v，0.1％tfa)，通过制备型hplc纯化和冷冻干燥，获得白色粉末(～3mg，30％)。侧链环化酰肼多肽序列如下：
[0025][0026]
(4)酰肼肽与苯二甲醛的还原胺基化
[0027]
3mg环化酰肼多肽(～0.9μmol)溶于600μl乙酸：甲醇(1:1，v:v)中；取4.1mg1,3
‑
苯二甲醛或者1,2
‑
苯二甲醛或者1,4
‑
苯二甲醛溶于1.0ml乙酸：甲醇(1：1)；取10μl新制备的苯二甲醛添加到环化酰肼多肽中，常温反应1h后，300μl h2o(含3.0mg nabh3cn)加入反应体系，常温震荡1h后，加入4ml乙腈:h2o(1:1，v:v，0.1％tfa)；经制备hplc纯化并且冷冻抽干后，获得目的ace2换肽模拟物，为白色粉末(0.6mg，20％)。
[0028]
本发明ace2环肽模拟物的用途，是用于制备多肽药物，所述多肽药物对新冠病毒具有显著的抑制作用。
[0029]
本发明ace2环肽模拟物的用途，是用于制备新冠病毒检测试剂盒。
[0030]
已经公开报道的ace2多肽模拟物几乎不能有效抑制新冠病毒。与抗体药物相比，本发明涉及的ace2环肽模拟物具有更高的热稳定性，更低的免疫原性，且易于低成本生产。
附图说明
[0031]
图1是抑制新冠假病毒的ace2环肽模拟物结构示意图。
[0032]
图2是本发明涉及的目标多肽合成路线图。
[0033]
图3是侧链
‑
侧链环化酰肼肽的ms图和高效液相色谱图。
[0034]
图4是ace2环肽模拟物的ms图和高效液相色谱图。
[0035]
图5是ace2环肽模拟物抑制新冠假病毒的活性。
[0036]
具体实施方法
[0037]
以下通过实施例来对本发明进一步说明：
[0038]
本发明涉及的缩写含义如下：
[0039]
英文缩写中文含义fmoc9
‑
芴甲氧羰基
tbu叔丁基trt三苯甲基dcm二氯甲烷dmfn,
‑
n二甲基甲酰胺acoh乙酸tfa三氟乙酸dicn,n
‑
二异丙基碳化二亚胺oxyma2
‑
肟氰乙酸乙酯tips三异丙基硅烷tris三羟甲基氨基甲烷nacnbh3腈基硼氢化钠hplc高效液相色谱esi
‑
ms电喷雾离子源液相质谱
[0040]
实施例1：肼
‑2‑
cl
‑
trt树脂的制备
[0041]
称134mg 2
‑
ci
‑
trt
‑
cl树脂(载量0.56mmol/g,75umol)，放入固相合成管中。3ml dmf溶胀20分钟后，树脂依次被dcm和dmf清洗三次。加入新制的3.5ml 5％水合肼(125μl水合肼 3.33mldmf)。常温下震荡30min，弃去反应液，重复该过程一次。加入新制的2.5ml 20％meoh/dmf(2ml dmf 0.5ml meoh)。在常温震荡20min后，树脂被dmf充分洗涤5次，得到目标的肼
‑2‑
cl
‑
trt树脂。
[0042]
实施例2：fmoc固相拼接酰肼肽
[0043]
肼
‑2‑
cl
‑
trt树脂树脂放入固相合成管。加入dic/oxyma/6
‑
氨基己酸的dmf混合液(10eq dic:10eq oxyma：10eq 6
‑
氨基己酸，2ml dmf)。在55℃震荡40分钟后，dmf充分洗涤树脂。加入2ml封闭试剂(醋酸酐：2,6
‑
二甲基吡啶：dmf＝5:6:89)。常温震荡2min后，dmf充分洗涤树脂。加入20％哌啶的dmf，常温8min。丢弃20％的哌啶溶液，重复一次哌啶处理。dmf充分洗涤树脂三次。加入配制dic/oxyma/fmoc
‑
ser(tbu)
‑
oh的dmf混合液(10eq dic:10eq oxyma：10eq fmoc
‑
ser(tbu)
‑
oh，2ml dmf)。55℃震荡40分钟，完成氨基酸的固相拼接。按照上述操作完成余下氨基酸的固相拼接。加入2ml封闭试剂(醋酸酐：2,6
‑
二甲基吡啶：dmf＝5:6:89)乙酰化多肽的n末端胺基。依次dmf和dcm充分洗涤后，自然晾干10min。加入6ml tfa的切割液(tfa：间甲酚：水：tips＝88:5:5:2,v/v)于树脂中。常温震荡2小时，汇集tfa切割液体，加入10倍以上体积预先冰冷的乙醚。离心获得白色粉末状态的酰肼多肽。经半制备hplc进行分离纯化，真空冷冻干燥后得到纯的酰肼肽。
[0044]
实施例3：酰肼肽的侧链环化
[0045]
取10mg酰肼肽溶在2.0ml dmf：h2o混合溶剂(2:1，v:v)中。取1.4mg 4,4
‑
二溴甲基联苯溶解在0.1ml dmf中。两液体混合。使用1.0m nh 4
hco3调节ph至8.0(精密ph纸确定)。常温反应2h后，加入3ml乙腈:h2o混合溶剂(1:1，v:v，0.1％tfa)。hplc纯化分离侧链环化的酰肼肽。冷冻抽干后，获得侧链环化的多肽酰肼(～3mg，30％)，如图3所示。侧链环化酰肼肽示意图如下：
[0046][0047]
实施例4：侧链环化酰肼肽的二聚体制备
[0048]
取3mg侧链环化酰肼肽(～0.9μmol)，溶于600μl乙酸：甲醇(1:1,v:v)。取4.1mg1,3
‑
苯二甲醛溶解在1.0ml乙酸：甲醇中。取10μl 1,3
‑
苯二甲醛液体，加入侧链环化酰肼肽溶液中。常温反应1h后，加入3.0mg nacnbh3(溶解在300μl)。常温震荡1h，加4ml乙腈:h2o(1:1，v:v，0.1％tfa)。经hplc分离纯化和冷冻干燥后，ace2环肽模拟物以粉末形成获得(0.6mg，20％)，如图4所示。
[0049]
实施例5：假病毒中和试验
[0050]
采用lipofectamine 3000转染试剂将pcdna3.1( )
‑
hncov
‑
s或pcdna3.1( )
‑
sars
‑
s质粒与hiv骨架质粒pnl4
‑
3r
‑
e
‑
共转染hek 293t细胞(invitrogen)，制备sars
‑
cov
‑
2和sars
‑
cov假病毒。48小时后，去除细胞碎片的上清液作为病毒原液。通过脂质体6000转染试剂(碧云天生物)转染pcdna3.1( )
‑
3xflag
‑
hace2，建立表达重组人ace2的239t
‑
ace2或huh7
‑
ace2细胞。将239t
‑
hace2或huh7
‑
hace2细胞以每孔2x104个细胞的密度接种在96孔板中，37℃过夜。将稀释的ace2环肽模拟物与一定滴度的假病毒(96孔板中每孔的相对发光单位(rlu)范围为20,000至40,000)孵育1小时，然后加入到239t
‑
hace2或huh7
‑
hace2细胞中。在37℃培养2天后，通过含有荧光素酶检测试剂的细胞裂解缓冲液收获细胞，并按照制造商的方案(bright
‑
glotm荧光素酶检测系统，promega)进行检测。实验中荧光素酶检测的读取时间为1s。
[0051]
最后测得ace2环肽模拟物抑制新冠假病毒的ic
50
为850nm，如图5所示。