一种食蟹猴PBMC分离方法与流程

一种食蟹猴pbmc分离方法
技术领域
1.本发明属于细胞生物学和免疫学领域，具体涉及一种食蟹猴pbmc分离方法。


背景技术：

2.pbmc即外周血单个核细胞，主要包括两大类：淋巴细胞和单核细胞，是免疫系统的重要组成部分，在特异性免疫和非特异性免疫中都发挥着重大作用。pbmc分离技术为免疫系统研究的一个基本的实验技术。目前常用的pbmc分离主要是基于密度梯度离心的方法，但是这种常规的pbmc分离法对技术人员的操作要求高，如果操作不熟练容易失败；而且耗时久，一般完成一次分离大概需要2小时左右，如果样本量大，那么耗时会特别久；常规的pbmc分离操作时，需要将稀释后的全血缓缓加入淋巴细胞分离液面上形成明显的分离液层和血样层，然后通过密度梯度离心后分离得到pbmc白膜层，因此需要控制加样速度，缓缓加入血样，以免血样冲入淋巴细胞分离液底部无法形成明显的分层；常规的pbmc分离法离心后，需要使用移液枪插入白膜层然后将白膜层吸出，这一步同样对操作要求较高，而且该步骤容易吸到红细胞，造成较严重的红细胞污染。因此急需一种更加优化的pbmc分离方法。
3.非人灵长类动物在亲缘关系上与人类最为接近，在组织结构、病理生理、免疫调节和能量代谢等方面与人类高度近似，因此食蟹猴等非人灵长类动物的研究价值明显优于其他种属的实验动物。


技术实现要素：

4.为了避免常规pbmc分离法对操作者要求高，分离时间长，导致细胞存活率低的问题，本发明提供一种食蟹猴pbmc分离方法，包括以下步骤：
5.步骤一、用杜氏磷酸盐缓冲液(dulbecco's phosphate buffered saline，dpbs)稀释食蟹猴外周血，得到稀释后的血样；
6.步骤二、将所述步骤一中的稀释后的血样加入含有密度梯度离心液的sepmate pbmc分离管中，1200g升速9降速6条件下离心10
‑
20min，然后将上清液倾倒入离心管中；
7.步骤三、向所述离心管中加入dpbs进行洗涤，离心，弃上清，得到的沉淀为食蟹猴pbmc。
8.进一步地，所述步骤一中采用dpbs将食蟹猴外周血稀释0.8
‑
1.2倍。
9.进一步地，所述步骤一中采用dpbs将食蟹猴外周血稀释1倍。
10.进一步地，所述步骤二中稀释后的血样与所述密度梯度离心液的体积比为1:1
‑
1.5。
11.进一步地，所述步骤二中稀释后的血样与所述密度梯度离心液的体积比为1:1.5。
12.进一步地，所述步骤二中的所述密度梯度离心液为ficoll分离液。
13.进一步地，所述步骤二具体为：将所述步骤一中的稀释后的血样加入含有密度梯度离心液的sepmate pbmc分离管中，1200g升速9降速6条件下离心20min，然后将上清液倾倒入离心管中。
14.进一步地，所述步骤三具体为：向所述离心管中加入dpbs进行洗涤，400g离心10min，弃上清，得到的沉淀为食蟹猴pbmc。
15.进一步地，还包括步骤四、用dpbs重悬所述步骤三得到的沉淀。
16.进一步地，所述步骤四中采用所述食蟹猴外周血1/3
‑
1/2倍体积的dpbs重悬所述步骤三得到的沉淀。
17.与现有技术相比，本发明优化方案使用sepmate pbmc分离管快速高效分离食蟹猴pbmc具备以下有益效果：
18.1.sepmate pbmc分离管内有分离隔层设计，可将血液样本与分离液隔开，因此可直接将血液样本倾倒于分离管中。一方面节约了时间，另一方面也降低了对操作人员的技术要求；
19.2.sepmate pbmc分离管的隔离层设计可防止管体底部液体回流，因此离心后只需要直接将上清液倒出即可，无需手动吸取pbmc白膜层。减少了操作时间并降低操作技术要求的同时，也提高了工作效率和通量；
20.3.由于缩短了操作时间，使用sepmate pbmc分离管提取的单个核细胞的活率相对传统分离pbmc方法提取的活率有所提高。
21.本发明通过优化离心条件和提高密度梯度离心液的用量，达到了更好的分离食蟹猴pbmc的效果，获得了细胞活率显著高于常规法分离pbmc的细胞。
22.使用sepmate pbmc分离管进行分离，并对降低了对技术人员的操作要求，同时明显缩短了操作时间，大大提高了工作效率，同时得到的pbmc的质量与原来的方法没有明显差别，甚至更高。
23.以下将结合附图对本发明的构思、具体结构及产生的技术效果作进一步说明，以充分地了解本发明的目的、特征和效果。
附图说明
24.图1是常规法分离pbmc密度梯度离心后的图片。
25.图2是使用sepmate pbmc分离，离心10分钟，含4.5ml ficoll密度梯度离心后的图片。
26.图3是使用sepmate pbmc分离，离心20分钟，含4.5ml ficoll密度梯度离心后的图片。
27.图4是使用sepmate pbmc分离，离心20分钟，含3ml ficoll密度梯度离心后的图片。
28.图5是加dpbs洗涤并离心后的图片。
29.图6是倾倒出血浆和pbmc后的图片。
具体实施方式
30.为了使发明实现的技术手段、创造特征、达成目的和功效易于明白了解，下面结合具体图示，进一步阐述本发明。但本发明不仅限于以下实施的案例。
31.须知，本说明书所附图式所绘示的结构、比例、大小等，均仅用以配合说明书所揭示的内容，以供熟悉此技术的人士了解与阅读，并非用以限定本发明可实施的限定条件，故
不具技术上的实质意义，任何结构的修饰、比例关系的改变或大小的调整，在不影响本发明所能产生的功效及所能达成的目的下，均应仍落在本发明所揭示的技术内容得能涵盖的范围内。
32.下面将结合实施例中的附图，对本技术优化方案进行清楚、完整地描述：
33.取一份edta管装的食蟹猴外周血，各取3ml血分别用3ml dpbs进行稀释，得到a,b,c,d 4份稀释后的血样。
34.用传统pbmc分离法将3ml稀释后血样a缓缓地加入含有3ml ficoll分离液中，形成明显的分离液和稀释血样的分离层，尽量使得血样不穿透分离液。430g升速6降速0条件下离心30分钟，得到图1所示的分离液。用移液枪插入白膜层然后将白膜层吸出后置于50ml离心管中，加入20ml dpbs进行洗涤，400g离心10分钟后如图5右管所示。弃上清，用1ml dpbs重悬计数，计数结果见表1。
35.将3ml稀释后血样b直接加入含有4.5ml ficoll分离液的sepmate pbmc分离管，1200g升速9降速6条件下离心10分钟，见图2。将直接将上清液直接倾倒入50ml离心管中，加入20ml dpbs进行洗涤，400g离心10分钟。弃上清，用1ml dpbs重悬计数，计数结果见表1。
36.将3ml稀释后血样c直接加入含有4.5ml ficoll分离液的sepmate pbmc分离管，1200g升速9降速6条件下离心20分钟，见图3。直接将上清液直接倾倒入50ml离心管中，加入20ml dpbs进行洗涤，400g离心10分钟后如图5左管所示。倾倒出上清液的sepmate pbmc分离管见图6。弃上清，用1ml dpbs重悬计数，计数结果见表1。
37.将3ml稀释后血样d直接加入含有3ml ficoll分离液的sepmate pbmc分离管，1200g升速9降速6条件下离心20分钟，见图4。直接将上清液直接倾倒入50ml离心管中，加入20ml dpbs进行洗涤，400g离心10分钟。弃上清，用1ml dpbs重悬计数，计数结果见表1。
38.表1：四种不同条件下得到的细胞计数结果
[0039][0040]
从表1可以看出，对于血样c所采用的离心条件和密度梯度离心液(ficoll)的用量能够获得更高的细胞数目和很好的细胞活率。而常规分离pbmc虽然细胞总数与血样b采用的方法相差不大，但是细胞活率显著低于其他三个血样的处理方法。而血样d的处理方法由于使用的ficoll较少，其得到的细胞总数明显少于血样b和血样c，甚至血样a的。同样的，血样b由于离心时间缩短了，也导致细胞总数相交血样c更少。这表明通过优化离心条件和提高密度梯度离心液的用量，能够达到更好的分离食蟹猴pbmc的效果，获得更高的细胞活率的pbmc。
[0041]
以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术无需创
造性劳动就可以根据本发明的构思作出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。