一种能解酒的菌株的筛选方法及应用与流程

1.本发明涉及生物工程发酵技术领域，具体涉及一种能解酒的菌株的筛选方法及应用。


背景技术：

2.每年全球有超过250万人的死因与酗酒有关，且这一数字一直呈上升趋势，可见酗酒已严重危害到人们的身体健康，甚至还可能引发一系列社会问题。
3.当人体饮酒后，除少部分酒精可随着呼吸、汗液或尿液等直接排出体外，其余大量酒精均需进入肝脏进行氧化分解，经乙醇脱氢酶将酒精转化为乙醛，再经肝乙醛脱氢酶氧化为乙酸，最后变成水和二氧化碳排出体外，这一过程对肝脏造成严重负担，极易造成肝损伤。乙醛是引起酒精性肝脏损伤最主要的毒性物质，可以引起肝细胞损伤、炎症以及细胞外基质产生和纤维化的形成。目前，国内外常见的解酒药物及保健品及食品大都是以中药材、食材等配制而成，多为利尿类化学合成药物，护肝养胃类中药，蛋白肽类药物等，但是药效见效太慢，解酒效果不好。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于提供一种能解酒的菌株的筛选方法及应用，以解决利尿类化学合成药物技术，药效见效太慢，解酒效果不好的技术问题。
5.为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
6.根据本发明的一个方面，提供了一种能解酒的菌株的筛选方法，包括以下步骤：
7.步骤一、对筛选培养基进行灭菌处理，并再完成灭菌处理后，向筛选培养基中加入无菌乙醛，再无菌接入天然发酵产物后进行厌氧培养，之后液相检测乙醛浓度，对乙醛浓度降低且菌体存活的微生物菌群进行单菌落平板分离；
8.其中，所述无菌乙醛在筛选培养基中的浓度为0.1％
‑
0.5％，所述平板上设有富营养培养基；
9.步骤二、挑取位于平板上的所述单菌落，再次使用筛选培养基进行纯培养，之后对所述单菌落破碎，检测发酵液中乙醛脱氢酶活性，并选择活性较高的菌株继续进行纯培养；
10.步骤三、对活性较高的菌株离心得到纯菌体后，使用pbs重悬，制备菌悬浮液，再次对菌体进行破碎，测其胞内的乙醛脱氢酶活性，选择活性较高的菌株为目标菌株。
11.进一步的，所述富营养培养基包括以下各浓度组分：
12.葡萄糖为5
‑
10g/l、乳糖为5
‑
10g/l、蛋白胨为10
‑
20g/l、酵母粉为 3
‑
5g/l、氯化钠为2
‑
4g/l、无水乙酸钠为0.5
‑
1.5g/l、维生素c为0.1
‑
0.5g/l、溴甲酚紫为0.04g/l和琼脂为20g/l。
13.更进一步的，所述富营养培养基的制取方法为：按比例调配，之后加入一定量纯化水混匀，再调节ph值后灭菌处理；
14.优选的，加入所述纯化水的量为1l，调节ph值为中性；
15.所述灭菌处理至少满足：灭菌时间20min，灭菌温度115℃。
16.进一步的，在步骤一中和步骤二中，所述无菌乙醛在筛选培养基中的培养温度为30
±
1℃，在厌氧环境下培养24h；
17.优选的，所述无菌乙醛在筛选培养基中的培养温度为30℃，所述筛选培养基的ph值范围为7.0
±
1。
18.更进一步的，所述筛选培养基由m17培养基加热溶于纯化水中，完成灭菌后制得；
19.优选的，所述筛选培养基由42.3g的m17培养基加热溶于1l的纯化水中制得；
20.优选的，制备条件至少满足：高压灭菌15min，灭菌温度115℃。
21.进一步的，在步骤一中，所述无菌乙醛采用以下方法制备：
22.使用无菌滤器过滤40％乙醛至无菌容器中，按照0.1％的终浓度计算，1l 的筛选培养基中含有2.5ml无菌的体积分数为40％的乙醛。
23.进一步的，在步骤二中，在挑取平板上所述单菌落进行纯培养时，保持培养温度为30℃，震荡厌氧培养24h；
24.所述发酵液采用超高压连续流细胞破碎仪直接破碎，再使用乙醛脱氢酶检测试剂盒检测乙醛脱氢酶的活性，并依据其在340nm下吸光度的增加值，测其相对活性。
25.进一步的，在步骤三中，得到的所述纯菌体使用灭菌生理盐水洗涤2次后，再使用灭菌的pbs溶液等体积悬重，再使用超高压连续流细胞破碎仪对菌悬浮液进行破碎，再使用乙醛脱氢酶检测试剂盒检测乙醛脱氢酶的活性，并依据其在340nm下吸光度的增加值，测其相对活性；
26.优选的，所述纯菌体在6000g下离心5min获得。
27.进一步的，所述目标菌株已由本发明的专利权人保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmcc no.22892，保藏日期是 2021年7月13日,保藏单位地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏分类命名为乳酸乳球菌lactococcus lactis。。
28.根据本发明的另一个方面，提供了一种菌株的应用，包括以下步骤：
29.步骤一、将纯牛乳与稳定剂、甜味剂混合后灭菌；
30.步骤二、向灭菌后的混合物内接入所述目标菌株的菌悬液，并在30℃恒温放置8
‑
12h；
31.步骤三、待步骤二所的产物凝乳后，再放置于冰箱中静置4
‑
8h，进行后熟；
32.步骤四、制得解酒酸奶。
33.与现有技术相比，本发明的有益效果是：
34.本发明中，进行高通量筛选，以耐受乙醛并能降解乙醛为目标。由于乙醛的最终产物是乙酸，本发明以泡菜、酸奶制品等天然发酵产物为初始目标，筛选耐受乙醛的菌株，并对得到的菌株进行降解乙醛能力的检测，挑取降解能力较强的作为目标菌株。
具体实施方式
35.下面将结合本发明的实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都
属于本发明保护的范围。
36.根据本发明的一个方面，提供了一种能解酒的菌株的筛选方法，包括以下步骤：
37.步骤一、对筛选培养基进行灭菌处理，并再完成灭菌处理后，向筛选培养基中加入无菌乙醛，再无菌接入天然发酵产物后进行厌氧培养，之后液相检测乙醛浓度，对乙醛浓度降低且菌体存活的微生物菌群进行单菌落平板分离；
38.其中，所述无菌乙醛在筛选培养基中的浓度为0.1％
‑
0.5％，所述平板上设有富营养培养基；
39.步骤二、挑取位于平板上的所述单菌落，再次使用筛选培养基进行纯培养，之后对所述单菌落破碎，检测发酵液中乙醛脱氢酶活性，并选择活性较高的菌株继续进行纯培养；
40.步骤三、对活性较高的菌株离心得到纯菌体后，使用pbs重悬，制备菌悬浮液，再次对菌体进行破碎，测其胞内的乙醛脱氢酶活性，选择活性较高的菌株为目标菌株。
41.本方案所利用的原理为：乙醇在人体内的代谢是通过乙醇脱氢酶来完成的，而乙醇脱氢酶为限速酶(是指整条代谢通路中催化反应速度最慢的酶)，极大的影响整条代谢途径的总速度，因此，为人体补充额外的乙醛脱氢酶是解除乙醇危害的一种有效方法。
42.本发明进行高通量筛选，以耐受乙醛并能降解乙醛为目标。由于乙醛的最终产物是乙酸，本发明以泡菜、酸奶制品等天然发酵产物为初始目标，筛选耐受乙醛的菌株，并对得到的菌株进行降解乙醛能力的检测，挑取降解能力较强的作为目标菌株。
43.为便于理解本发明的技术方案，通过以下实施例进一步说明。
44.实施例一：
45.一种能解酒的菌株的筛选方法，包括以下步骤：
46.步骤一、对筛选培养基进行灭菌处理，并再完成灭菌处理后，向筛选培养基中加入无菌乙醛，再无菌接入天然发酵产物后进行厌氧培养，之后液相检测乙醛浓度，对乙醛浓度降低且菌体存活的微生物菌群进行单菌落平板分离；
47.其中，所述无菌乙醛采用以下方法制备：
48.使用无菌滤器过滤40％乙醛至无菌容器中，按照0.1％的终浓度计算，1l 的筛选培养基中含有2.5ml无菌的体积分数为40％的乙醛；
49.其中，所述无菌乙醛在筛选培养基中的培养温度为30℃，在厌氧环境下培养24h，所述筛选培养基的ph值范围为7.0
±
1；
50.所述筛选培养基由由42.3g的m17培养基加热溶于1l的纯化水中，之后灭菌制得，制备条件至少满足：高压灭菌15min，灭菌温度115℃；
51.其中，所述无菌乙醛在筛选培养基中的浓度为0.1％
‑
0.5％，所述平板上设有富营养培养基，所述富营养培养基包括以下各浓度组分：
52.葡萄糖为5
‑
10g/l、乳糖为5
‑
10g/l、蛋白胨为10
‑
20g/l、酵母粉为 3
‑
5g/l、氯化钠为2
‑
4g/l、无水乙酸钠为0.5
‑
1.5g/l、维生素c为0.1
‑
0.5g/l、溴甲酚紫为0.04g/l和琼脂为20g/l；
53.所述富营养培养基的制取方法为：按比例调配，之后加入1l纯化水混匀，再调节ph值为中性后灭菌处理；
54.所述灭菌处理至少满足：灭菌时间20min，灭菌温度115℃；
55.步骤二、挑取位于平板上的所述单菌落，再次使用筛选培养基进行纯培养，之后对
所述单菌落破碎，检测发酵液中乙醛脱氢酶活性，并选择活性较高的菌株继续进行纯培养；
56.其中，在挑取平板上所述单菌落进行纯培养时，保持培养温度为30℃，震荡厌氧培养24h；
57.所述发酵液采用超高压连续流细胞破碎仪直接破碎，再使用乙醛脱氢酶检测试剂盒检测乙醛脱氢酶的活性，并依据其在340nm下吸光度的增加值，测其相对活性；
58.步骤三、对活性较高的菌株离心得到纯菌体后，使用pbs重悬，制备菌悬浮液，再次对菌体进行破碎，测其胞内的乙醛脱氢酶活性，选择活性较高的菌株为目标菌株；
59.得到的所述纯菌体使用灭菌生理盐水洗涤2次后，再使用灭菌的pbs溶液等体积悬重，再使用超高压连续流细胞破碎仪对菌悬浮液进行破碎，再使用乙醛脱氢酶检测试剂盒检测乙醛脱氢酶的活性，并依据其在340nm下吸光度的增加值，测其相对活性；
60.所述纯菌体在6000g下离心5min获得；
61.所述目标菌株已由本发明的专利权人保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmcc no.22892，保藏日期是2021年7月 13日,保藏单位地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏分类命名为乳酸乳球菌lactococcus lactis。。
62.实施例二
‑
五十：
63.按照实施例一的方法，不同的是，单菌落平板分离筛选的菌株不同，如
64.表1所示：
65.菌株相对酶活菌株相对酶活菌株相对酶活实施例
‑
21实施例
‑
1935实施例
‑
365实施例
‑
35实施例
‑
2021实施例
‑
372实施例
‑
43实施例
‑
214实施例
‑
3822实施例
‑
545实施例
‑
2233实施例
‑
3915实施例
‑
612实施例
‑
2321实施例
‑
406实施例
‑
72实施例
‑
2415实施例
‑
417实施例
‑
813实施例
‑
252实施例
‑
4246实施例
‑
93实施例
‑
264实施例
‑
4354实施例
‑
1023实施例
‑
2717实施例
‑
4411实施例
‑
113实施例
‑
2821实施例
‑
453实施例
‑
1211实施例
‑
291实施例
‑
4617实施例
‑
134实施例
‑
3016实施例
‑
471实施例
‑
145实施例
‑
3121实施例
‑
4857实施例
‑
159实施例
‑
3233实施例
‑
4912实施例
‑
1611实施例
‑
3321实施例
‑
5023实施例
‑
173实施例
‑
341
ꢀꢀ
实施例
‑
1811实施例
‑
358
ꢀꢀ
66.由表1可见，实施例五、实施例十、实施例十九、实施例二十、实施例二十二、实施例二十三、实施例二十八、实施例三十一、实施例三十二、实施例三十三、实施例三十八、实施例四十二、实施例四十三、实施例四十八和实施例五十所的发酵液酶活性较高。
67.对上述活性较高的菌株再次使用筛选培养基进行纯培养后，测其相对酶活，如表2
所示：
68.菌株相对酶活菌株相对酶活菌株相对酶活实施例
‑
532实施例
‑
2310实施例
‑
3813实施例
‑
1016实施例
‑
289实施例
‑
4243实施例
‑
1921实施例
‑
3113实施例
‑
4346实施例
‑
2024实施例
‑
3226实施例
‑
4853实施例
‑
2215实施例
‑
3315实施例
‑
5011
69.由表2可见，相对酶活性比较，优选实施例四十八所的菌株作为目标菌株。
70.实施例五十一
‑
五十六：
71.按照实施例一的方法，不同的是，筛选培养基的初始ph值不同，如表3 所示：
72.初始ph值od600终ph值3.01.22.64.02.43.45.04.04.16.07.14.97.010.65.18.07.55.9
73.由表3可知，在初始ph值为7.0时，od600显示吸光值最大，可见菌种最适的生长ph为7.0。
74.od600是指的某种溶液在600nm波长处的吸光值，而通过吸光值的定义可知，吸光值正比于溶液中的吸光物质的浓度，即菌悬液的浓度与吸光值成正比。
75.根据本发明的另一个方面，提供了一种菌株的应用，包括以下步骤：
76.步骤一、将纯牛乳与稳定剂、甜味剂混合后灭菌；
77.步骤二、向灭菌后的混合物内接入所述目标菌株的菌悬液，并在30℃恒温放置8
‑
12h；
78.步骤三、待步骤二所的产物凝乳后，再放置于冰箱中静置4
‑
8h，进行后熟；
79.步骤四、制得解酒酸奶。
80.由此方法得到的酸奶，由于菌体中含有丰富的乙醛脱氢酶，可以在酒后饮用，有助于缓解酒后不适，减轻宿醉。
81.需要说明的是，在本文中，诸如第一和第二等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。
82.尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围包括所附权利要求及其等同物。