用于处理石蜡包埋样本的脱蜡剂及从石蜡包埋样本中提取核酸的方法与流程

用于处理石蜡包埋样本的脱蜡剂及从石蜡包埋样本中提取核酸的方法
1.技术领域
2.本发明属于分子生物学技术领域，尤其涉及一种用于处理石蜡包埋样本的脱蜡剂及从石蜡包埋样本中提取核酸的方法。


背景技术：

3.石蜡包埋法是医疗机构保存病理组织的常用方法，这些组织很大程度上属于尚未开发的资源，是病理研究的宝贵资源。但是，从这些组织样本中提取出可供下游应用的高质量的dna是比较困难的。从石蜡包埋组织中提取dna，通常需要经过脱蜡、消化组织、解除化学交联、洗脱杂蛋白及盐离子，最后得到纯化的dna。目前，最常用的石蜡包埋组织的脱蜡剂是二甲苯，但是二甲苯有很强的毒性，并且脱蜡处理过程繁琐。因此，急需一种可以替代二甲苯的脱蜡剂，能够高效的去除样本中的石蜡，又不会危害实验人员身体健康。


技术实现要素：

4.本发明提供了一种用于处理石蜡包埋样本的脱蜡剂，该脱蜡剂脱蜡效果显著，且安全无毒，配合本发明提供的核酸提取方法，可以有效节约石蜡包埋样本提取核酸的步骤和时间。
5.本发明采用的技术方案为：一种用于处理石蜡包埋样本的脱蜡剂，所述的脱蜡剂为烷烃与烯烃的混合物，所述的烷烃为长链烷烃和/或环烷烃，所述的烯烃为长链烯烃和/或环烯烃。
6.优选的，所述的烷烃为十一烷，十二烷，十三烷，十四烷，十五烷，十六烷，液体石蜡，矿物油，石油醚，环己烷，正己烷，正庚烷，正辛烷，正壬烷，正癸烷，甲基环戊烷，姥鲛烷中的一种或数种。
7.优选的，所述的烯烃为十一烯，十二烯，十三烯，十四烯，十五烯，十六烯，戊二烯，双戊烯，1
‑
环戊基环戊烯，γ
‑
松油烯，蒎烯，1
‑
苯基
‑1‑
环己烯，环庚烯，环庚三烯，1,5
‑
环辛二烯中的一种或数种。
8.优选的，烷烃与烯烃的体积比为1：0.5
‑
2。
9.优选的，烷烃与烯烃的体积比为1：1。
10.本发明还提供了一种从石蜡包埋样本中提取核酸的方法，无需单独进行脱蜡步骤，可实现样本脱蜡、组织消化以及解除化学交联在同一离心管中连续进行，其连续过程中无需多次离心处理，避免了传统样本前处理过程中多次离心操作，大大简化了实验操作步骤，其步骤包括：（1）在石蜡包埋样本中加入权利要求1
‑
5中任一项所述的脱蜡剂、样本裂解液、蛋白酶k，混匀后水浴加热，直至样本裂解完全；
（2）升温继续加热，解除化学交联；（3）离心，移取下层样本裂解液至新的离心管，加入结合液、无水乙醇、硅羟基磁珠，混匀；（4）离心后，将离心管置于磁力架上，待溶液完全澄清后，弃上清；（5）洗涤离心管中沉淀，重悬于超纯水中，得到石蜡包埋样本中的核酸。
11.优选的，步骤（5）洗涤具体为先采用蛋白漂洗液洗涤，弃上清后，再采用洗涤液洗涤至少两次，将离心管中残留液体吸尽，室温放置直至洗涤液中乙醇挥发完。
12.更具体的步骤为：（1）取5
‑
30mg石蜡包埋样本（自制）于2ml离心管中，加入400ul脱蜡剂、200ul 样本裂解液（来源于翌圣公司试剂盒）、20ul蛋白酶k（来源于翌圣公司试剂盒），涡旋混匀10秒，短暂离心后置于65℃水浴锅中加热1h直至样本裂解完全；（2）90℃继续加热1h，解除化学交联；（3）10000rpm离心1min后，吸取下层200ul样本裂解液置于新的1.5ml离心管中，加入200ul结合液（来源于翌圣公司试剂盒）、200ul无水乙醇、20ul硅羟基磁珠（50mg/ml，来源于翌圣公司试剂盒）,涡旋混匀后，置于旋转混匀仪上处理10分钟；（4）短暂离心后，将离心管置于磁力架上，待溶液完全澄清后，弃上清；（5）向离心管中加入500ul 蛋白漂洗液（来源于翌圣公司试剂盒），振荡混匀30秒后，短暂离心，将离心管置于磁力架上，待溶液完全澄清后，弃上清；（6）向离心管中加入500ul 洗涤液（来源于翌圣公司试剂盒），振荡混匀30秒后，短暂离心，将离心管置于磁力架上，待溶液完全澄清后，弃上清；（7）重复步骤（6）一遍；（8）将离心管中残留液体尽量吸尽后，室温放置5分钟直至乙醇挥发完；（9）向离心管中加入100ul超纯水，涡旋混匀10秒，将离心管置于70℃水浴锅中孵育5min，吸取上清液即含有所提取的核酸。
13.综上所述，本发明的优点及积极效果为：（1）本发明提供了一种用于处理石蜡包埋样本的脱蜡剂，该脱蜡剂相比于传统的二甲苯，更加安全、高效。
14.（2）本发明提供的脱蜡方法，操作简单，可实现样本脱蜡、组织裂解以及解除化学交联在同一离心管连续中进行，其连续过程中无需多次离心处理，避免了传统脱蜡提取过程中的多次离心操作，节省了实验步骤和操作时间。使用的脱蜡剂为无毒或低毒性，减少对试验人员及环境的毒害，并且具有良好的提取效果。
15.（3）本发明采用烷烃和烯烃的组合，把脱蜡过程和样本裂解两个步骤合并，不需要单独进行脱蜡步骤，相比传统脱蜡过程有明显的简化，在整个石蜡包埋样本的前处理过程中，可以省去脱蜡处理的时间。
16.（4）使用本发明提供的脱蜡剂和脱蜡方法从石蜡包埋样本中提取核酸的得率高、纯度好，可用于pcr、qpcr等下游检测。
附图说明
17.图1是实施例4中石蜡包埋样本提取的dna电泳结果；
图2是实施例5中石蜡包埋样本提取的dna电泳结果；图3是实施例6中石蜡包埋样本提取的dna电泳结果；图4是实施例7中石蜡包埋样本提取的dna电泳结果；图5是实施例7中石蜡包埋样本提取的dna qpcr检测结果。
具体实施方式
18.为了进一步描述使本发明的具体内容，以下结合实施例对本发明进行详细说明。实施例所涉及的操作方法及试剂为业内技术人员所熟知，应当理解，以下所描述的具体实施例仅仅用于对发明进行详细说明，但本发明的实施方式并不受下述实施例的限制。
19.本发明披露了一种用于处理石蜡包埋样本的脱蜡剂及脱蜡方法。本发明的脱蜡剂为长链和/或环烷烃与长链和/或环烯烃等体积混合后，室温搅拌混匀即可。本发明所述的室温具体温度范围为10
‑
35℃。
20.具体见下述各实施例。
21.实施例1脱蜡剂的制备取5ml十一烷、5ml双戊烯于15ml离心管中，室温振荡混匀，即可得到脱蜡剂。
22.实施例2脱蜡剂的制备取10ml姥鲛烷、10ml1,5
‑
环辛二烯于小烧杯中，用玻璃棒室温搅拌混匀，即可得到脱蜡剂。
23.实施例3 脱蜡剂的制备取30ml液体石蜡、30ml环庚烯于小烧杯中，用磁力搅拌器室温搅拌混匀，即可得到脱蜡剂。
24.实施例4 石蜡包埋样本的dna提取取8份15mg石蜡包埋样本于2ml离心管中，加入400ul实施例1中所述的脱蜡剂、200ul 样本裂解液、20蛋白酶k，涡旋混匀10秒，短暂离心后置于65℃水浴锅中加热1h直至样本裂解完全；90℃加热1h，解除化学交联；10000g离心1min后，吸取下层200ul裂解产物于新的1.5ml离心管中，加入200ul结合液、200ul无水乙醇、20ul硅羟基磁珠（50mg/ml）,涡旋混匀后，至于旋转混匀仪上处理10分钟；短暂离心后，将离心管置于磁力架上，待溶液完全澄清后，弃上清；向离心管中加入500ul 去蛋白液，振荡混匀30秒后，短暂离心，将离心管置于磁力架上，待溶液完全澄清后，弃上清；向离心管中加入500ul 70%乙醇溶液，振荡混匀30秒后，短暂离心，将离心管置于磁力架上，待溶液完全澄清后，弃上清；重复上一步操作，再次洗涤磁珠；将离心管中残留液体尽量吸尽后，室温放置5分钟直至乙醇挥发完；向离心管中加入100ul超纯水，涡旋混匀10秒，将离心管置于70℃水浴锅中孵育5min；短暂离心后，将离心管置于磁力架上，待溶液完全澄清后，吸取含有dna的水溶液。
25.取1ul dna样本，使用微量分光光度计用超纯水空白后检测dna样本浓度以及纯度，结果见表1；取5ul dna样本进行电泳，观察核酸片段分布，结果见附图1。
26.表1 实施例4 中石蜡包埋样本dna浓度及纯度编号浓度（μg/ml）a260/280a260/2301487.7811.9172.2032529.2381.9212.216
3328.4371.8952.1054551.5751.9012.2205595.5221.9252.2136592.4541.9152.2227296.9821.9002.2558186.5821.8842.248实施例5 石蜡包埋样本的dna提取取8份20mg石蜡包埋样本于2ml离心管中，加入400ul实施例2中所述的脱蜡剂、200ul 样本裂解液、20蛋白酶k，涡旋混匀10秒，短暂离心后置于65℃水浴锅中加热1h直至样本裂解完全；90℃加热1h，解除化学交联；10000g离心1min后，吸取下层200ul裂解产物于新的1.5ml离心管中，加入200ul结合液、200ul无水乙醇、20ul硅羟基磁珠（50mg/ml）,涡旋混匀后，至于旋转混匀仪上处理10分钟；短暂离心后，将离心管置于磁力架上，待溶液完全澄清后，弃上清；向离心管中加入500ul 去蛋白液，振荡混匀30秒后，短暂离心，将离心管置于磁力架上，待溶液完全澄清后，弃上清；向离心管中加入500ul 75%乙醇溶液，振荡混匀30秒后，短暂离心，将离心管置于磁力架上，待溶液完全澄清后，弃上清；重复上一步操作，再次洗涤磁珠；将离心管中残留液体尽量吸尽后，室温放置5分钟直至乙醇挥发完；向离心管中加入100ul超纯水，涡旋混匀10秒，将离心管置于70℃水浴锅中孵育5min；短暂离心后，将离心管置于磁力架上，待溶液完全澄清后，吸取dna样本。
27.取1ul dna样本，使用微量分光光度计用超纯水空白后检测dna样本浓度以及纯度，结果见表2；取8ul dna样本进行电泳，观察核酸片段分布，结果见附图2。
28.表2 实施例5中石蜡包埋样本dna浓度及纯度编号浓度（μg/ml）a260/280a260/2301843.7301.9312.2202827.9561.9192.2153834.4931.9302.2394822.9261.9332.2325859.6701.9292.2026750.3221.9012.2107914.3461.9392.1988478.9011.8952.276实施例6 石蜡包埋样本的dna提取取8份10mg石蜡包埋样本于2ml离心管中，加入400ul实施例3中所述的脱蜡剂、200ul 样本裂解液、20蛋白酶k，涡旋混匀10秒，短暂离心后置于65℃水浴锅中加热1h直至样本裂解完全；90℃加热1h，解除化学交联；10000g离心1min后，吸取下层200ul裂解产物于新的1.5ml离心管中，加入200ul结合液、200ul无水乙醇、20ul硅羟基磁珠（50mg/ml）,涡旋混匀后，至于旋转混匀仪上处理10分钟；短暂离心后，将离心管置于磁力架上，待溶液完全澄清后，弃上清；向离心管中加入500ul 去蛋白液，振荡混匀30秒后，短暂离心，将离心管置于磁力架上，待溶液完全澄清后，弃上清；向离心管中加入500ul 80%乙醇溶液，振荡混匀30秒后，短暂离心，将离心管置于磁力架上，待溶液完全澄清后，弃上清；重复上一步操作，再
次洗涤磁珠；将离心管中残留液体尽量吸尽后，室温放置5分钟直至乙醇挥发完；向离心管中加入100ul超纯水，涡旋混匀10秒，将离心管置于70℃水浴锅中孵育5min；短暂离心后，将离心管置于磁力架上，待溶液完全澄清后，吸取dna样本。
29.取1uldna样本，使用微量分光光度计用超纯水空白后检测dna样本浓度以及纯度，结果见表3；取5uldna样本进行电泳，观察核酸片段分布，结果见附图3。
30.表3实施例6中石蜡包埋样本dna浓度及纯度编号浓度（μg/ml）a260/280a260/2301311.0051.9002.1472347.1421.9032.1283496.0521.8542.0034419.9871.8532.0955325.2431.8752.0806453.7721.8942.0977420.7861.8901.8718349.7771.9091.942实施例7本发明的脱蜡剂与二甲苯溶液脱蜡效果比较取6份20mg石蜡包埋样本于2ml离心管中，分别使用实施例3中所述的脱蜡剂与二甲苯溶液作为脱蜡剂，进行石蜡包埋样本的核酸提取。
31.使用实施例3中的脱蜡剂，脱蜡方式为：向石蜡包埋样本中加入400ul实施例3中所述的脱蜡剂、200ul样本裂解液、20蛋白酶k，涡旋混匀10秒，短暂离心后置于65℃水浴锅中加热1h直至样本裂解完全；90℃加热1h，解除化学交联；10000g离心1min后，吸取下层200ul裂解产物于新的1.5ml离心管中，即为样本脱蜡后的裂解产物。
32.使用二甲苯溶液作为脱蜡剂，脱蜡方式为：向石蜡包埋样本中加入1ml二甲苯，涡旋混匀10秒，10000g离心1min后，弃上清；加入1ml无水乙醇，涡旋混匀10秒，10000g离心1min后，弃上清；室温放置10分钟直至样本中的乙醇挥发完；加入200ul样本裂解液、20蛋白酶k，涡旋混匀10秒，短暂离心后置于65℃水浴锅中加热1h直至样本裂解完全；90℃加热1h，解除化学交联，即为样本脱蜡后的裂解产物。
33.再向上述两种脱蜡方式获得的裂解产物中加入200ul结合液、200ul无水乙醇、20ul硅羟基磁珠（50mg/ml）,涡旋混匀后，至于旋转混匀仪上处理10分钟；短暂离心后，将离心管置于磁力架上，待溶液完全澄清后，弃上清；向离心管中加入500ul去蛋白液，振荡混匀30秒后，短暂离心，将离心管置于磁力架上，待溶液完全澄清后，弃上清；向离心管中加入500ul80%乙醇溶液，振荡混匀30秒后，短暂离心，将离心管置于磁力架上，待溶液完全澄清后，弃上清；重复上一步操作，再次洗涤磁珠；将离心管中残留液体尽量吸尽后，室温放置5分钟直至乙醇挥发完；向离心管中加入100ul超纯水，涡旋混匀10秒，将离心管置于70℃水浴锅中孵育5min；短暂离心后，将离心管置于磁力架上，待溶液完全澄清后，分别吸取两种脱蜡方式获得的dna样本。
34.分别取1uldna样本，使用微量分光光度计用超纯水空白后检测dna样本浓度以及纯度，结果见表4，其中1
‑
3为实施3脱蜡剂处理组，4
‑
6号为二甲苯处理组；分别取5uldna样本进行电泳，观察核酸片段分布，结果见附图4；分别用脱蜡及二甲苯处理的两种方式获得
dna样本，用超纯水稀释至100ug/ml浓度后，进行qpcr检测，测定ct值的差异，结果见附图5。
35.表4实施例7中石蜡包埋样本dna浓度及纯度编号浓度（μg/ml）a260/280a260/2301505.4361.9092.0552506.9781.9242.0963547.1281.8782.2064476.5001.8692.2015595.3061.8642.0526661.4631.8752.089实施例8核酸提取仪提取石蜡包埋样本使用本发明的提供的方式进行样本预处理，处理完成后还可以配合核酸提取仪实现自动化提取。具体的操作如下，取14份8mg石蜡包埋样本于2ml离心管中，加入400ul实施例3中所述的脱蜡剂、200ul样本裂解液、20蛋白酶k，涡旋混匀10秒，短暂离心后置于65℃水浴锅中加热1h直至样本裂解完全；90℃加热1h，解除化学交联；10000g离心1min后，吸取下层200ul裂解产物于新的1.5ml离心管中，待用。按照表5向96深孔板中加入下列相应试剂；按照杭州奥盛auto
‑
pure32a核酸提取仪的操作，将深孔板放入仪器中，安装好磁棒套，运行事先设定的提取程序，提取程序见表6；程序结束后收集6/12列中的dna样本。
36.表5深孔板试剂加样体积表6杭州奥盛auto
‑
pure32a提取器提取程序
步骤孔位混合时间(min)吸磁时间(sec)等待时间(min)容积(μl)混合速度(1
‑
10)温度(℃)混合位置(0
‑
100%)混合幅度(1
‑
100%)吸磁位置(0
‑
100%)吸磁速度(1
‑
10)移磁珠20.23001005.080101结合1156006005/080101清洗1333005007/080101清洗2423005005/080101清洗3523025005/08010 洗脱65600100570080101弃磁珠20.2001005/080101
分别取1uldna样本，使用微量分光光度计用超纯水空白后检测dna样本浓度以及纯度，结果见表7。
37.表7实施例8中石蜡包埋样本dna浓度及纯度编号浓度（μg/ml）a260/280a260/2301301.3331.8942.0882401.1501.9102.141
3365.5451.9132.1294368.0981.9012.0475403.1571.9052.0476384.0171.8841.8587435.7911.8831.8648410.5601.9032.0259474.4871.8982.13310380.6961.8842.10611333.3401.8872.13912330.7191.8812.10413458.8401.8942.09714392.8771.8982.133本发明制备的用以石蜡包埋样本dna提取的脱蜡剂，脱蜡效果良好，脱蜡方式操作简易。以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。