一种棉花根腐病菌检测用引物、探针、试剂盒及检测方法与流程

1.本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种棉花根腐病菌检测用引物、探针、试剂盒及检测方法。


背景技术：

2.由棉花根腐病菌[phymototrichum omnivorum(shear)duggar]引起的棉花根腐病又名德克萨斯根腐病，1888年由pammel首次报道于德克萨斯州。此病是棉花上一种破坏性很大的病害，根据美国国家棉花委员会提供的1980～2008病害损失评估价格数据，仅其一项每年就造成美国棉花产量高达1亿美金的损失。
[0003]
据报道，棉花根腐病寄主已超过2000种以上，其中损失较大的是棉花、苜蓿、核果类果树和林荫树等。受侵染植物主根腐烂，茎部维管束变色，叶片快速萎蔫，叶片不脱落，最终导致植物死亡，病部产生大量菌核，菌核在土壤内至少存活5年，难以防治，病原菌可土传、病根传播。由于其危害严重性，棉花根腐病菌被东非、埃及、南部非洲、阿根廷、巴西、智利、巴拉圭、乌拉圭、巴林、哈萨克斯坦、乌兹别克斯坦、阿塞拜疆、摩尔多瓦、土耳其、乌克兰、亚太植物保护委员会(asia and pacific plant protection commission，apppc)、植物健康委员会(el comit
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de sanidad vegetal，cosave)、欧亚经济联盟(eurasian economic union，eaeu)、欧洲和地中海植物保护组织(european and mediterranean plant protection organization，eppo)、欧盟(european union，eu)等将其列入了a1检疫性名录，摩洛哥、突尼斯、墨西哥、以色列、白俄罗斯将其列为了检疫性有害生物，我国于2007年将其列入了《中华人民共和国进境植物检疫性有害生物名录》。目前，该病菌在美国、墨西哥、利比亚、委内瑞拉等国家有分布，迄今，我国未见报道。近年来，随着我国引进优质的种子苗木，该病传入的机率越来越大，严重威胁我国的棉花生产和对外贸易。
[0004]
目前，棉花根腐病菌的检测方法主要有传统的形态学法和基于pcr的分子生物学法。其中，形态学法中，虽然棉花根腐病菌的形态特征较为明显，例如，分生孢子外观上类似“担子”、可以产生菌丝索且侧生菌丝呈十字形分枝、以及可以产生棕色或黑色菌核等，但是诱导产孢、产菌核需要时间较长，只适合实验研究，无法满足口岸快速、准确检测的要求。分子生物学法中，marek等设计了一对用于检测该病菌的特异性引物，但是该引物灵敏度不是很高，无法检测较低含量的dna样品。arif等建立了一种基于实时荧光pcr和razorex生物监测系统的多基因检测方法，但是该方法需要与美国idaho公司的razor ex biodetection system生物监测系统配合使用，限制了该检测方法的推广应用。


技术实现要素：

[0005]
本发明所要解决的第一个技术问题是针对现有技术而提供一种特异性好且灵敏度高的用于棉花根腐病菌检测的引物。
[0006]
本发明所要解决的第二个技术问题是针对现有技术而提供一种特异性好且灵敏度高的用于棉花根腐病菌检测的探针。
[0007]
本发明所要解决的第三个技术问题是针对现有技术而提供一种用于棉花根腐病菌检测的试剂盒。
[0008]
本发明所要解决的第四个技术问题是针对现有技术而提供一种重复性好且可靠性高的棉花根腐病菌的检测方法。
[0009]
本发明解决上述第一个技术问题所采用的技术方案为：一种棉花根腐病菌检测用引物，其特征在于，所述棉花根腐病菌检测用引物的序列为：
[0010]
上游引物myaf序列为5
’‑
gagggcatgcctgttcga
‑3’
[0011]
下游引物myar序列为5
’‑
ccaagccaaccctctttcac
‑3’
。
[0012]
为进一步解决上述第二个技术问题所采用的技术方案为：一种棉花根腐病菌检测用探针，其特征在于，所述棉花根腐病菌检测用探针的序列为：
[0013]
myat序列为5
’‑
cgtcagcataacaaaacctcaagcaccc
‑3’
。
[0014]
进一步，所述myat探针5’端标记的荧光报告基团为fam，3’端标记的荧光猝灭基团为tamra。myat探针5’端也可以采用tet、vic、joe等发光基团。
[0015]
为进一步解决上述第三个技术问题所采用的技术方案为：一种棉花根腐病菌检测用试剂盒，其特征在于，包括如上所述的棉花根腐病菌检测用引物。
[0016]
进一步，本发明中的棉花根腐病菌检测用试剂盒还包括如上所述的棉花根腐病菌检测用探针。
[0017]
再进一步，本发明中的棉花根腐病菌检测用试剂盒还包括ctab提取液、taq dna聚合酶、阳性对照液以及阴性对照液。
[0018]
为进一步解决上述第四个技术问题所采用的技术方案为：一种棉花根腐病菌的检测方法，其特征在于包括以下步骤：
[0019]
(1)将菌丝放入液氮中碾碎，加入ctab提取液，65℃水浴30min；
[0020]
(2)10000r/min离心5min，取上清液并加入等体积的萃取液，混合至乳浊状；
[0021]
(3)4℃10000rpm离心5min，取上清液并加入醋酸钠溶液和乙醇，混匀后
‑
20℃下静置30min；
[0022]
(4)4℃10000rpm离心10min，取沉淀并用乙醇漂洗，晾干后，加入灭菌去离子水溶解沉淀，得到样品dna，4℃保存备用；
[0023]
(5)以上述获得的样品dna为模版，利用上述权利要求1中的引物及权利要求2或3中的探针进行pcr扩增反应，并对结果进行分析。
[0024]
进一步，所述萃取液为氯仿和异戊醇混合液。
[0025]
进一步优选地，所述氯仿和异戊醇混合液中氯仿和异戊醇的体积比为24:1。
[0026]
进一步，所述步骤(5)中pcr扩增反应的条件为：50℃预热2min；95℃预变性10min；95℃ 15s，60℃ lmin，40个循环。
[0027]
与现有技术相比，本发明的优点在于：本发明采用实时荧光pcr检测法来对棉花根腐病菌进行检测，与传统的检测方法相比，具有检测周期短、特异性与灵敏度高以及无需pcr后处理等优点，符合口岸检测快速、准确的要求。其中，本发明中的引物和探针具有扩增效率高、特异性好以及灵敏度高等优点，并且，本发明中的检测方法重复性好，检测结果可靠。
附图说明
[0028]
图1为本发明实施例4中棉花根腐病菌实时荧光pcr检测图；
[0029]
图2为本发明实施例5中实时荧光pcr特异性扩增曲线；
[0030]
图3为本发明实施例5中实时荧光pcr扩增产物凝胶电泳；
[0031]
图4为本发明实施例5中实时荧光pcr梯度稀释ct值标准曲线。
具体实施方式
[0032]
以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。
[0033]
实施例1：用于棉花根腐病菌检测的引物、探针设计
[0034]
棉花根腐病菌中的保守片段(its)的序列如seq id no:1所述，通过扩增本实验室保存棉花根腐病菌its序列，并结合使用bioedit软件对genbank基因库中的病原菌及相关种的its序列进行比较分析，以测定its区保守片段为靶目标，应用primer express3.0设计棉花根腐病菌的引物和探针。其中，引物和探针的合成采用β
‑
乙腈磷酸胺化学合成法，使用全自动dna合成仪进行oligodna的合成，本实施例中，该引物和探针均由宝生物工程(大连)有限公司合成。
[0035]
其中，棉花根腐病菌检测用引物的序列为：
[0036]
上游引物myaf序列为5
’‑
gagggcatgcctgttcga
‑3’
，如seq id no:2所述；
[0037]
下游引物myar序列为5
’‑
ccaagccaaccctctttcac
‑3’
，如seq id no:3所述。
[0038]
棉花根腐病菌检测用探针的序列为：
[0039]
myat序列为5
’‑
cgtcagcataacaaaacctcaagcaccc
‑3’
，如如seq id no:4所述，其中，该探针5’端标记的荧光报告基团为fam，3’端标记的荧光猝灭基团为tamra，myat探针5’端也可以采用tet、vic、joe等发光基团。
[0040]
实施例2：用于棉花根腐病菌检测的试剂盒
[0041]
本实施例中的试剂盒包括实施例1中的引物和探针，还包括ctab提取液、taq dna聚合酶、阳性对照液以及阴性对照液，具体如表1所示。
[0042]
表1标准化试剂盒组成(20μl反应
×
100次)
[0043]
溶液i(ctab提取液)30ml
×
2瓶溶液ii(引物探针)1.25ml溶液iii(聚合酶)50μl溶液iv(去离子水)1.25ml
×
2支溶液v(阳性对照)50μl溶液vi(阴性对照)50μl溶液vii(定量标准液)25μl
[0044]
其中，上述溶液i含0.7mol/l nac1、100mmol/l tris
‑
hc1、ph 8.0及20mmol/l edta、10g/l pvp
‑
360、20g/l ctab以及终浓度为2％(v:v)的β
‑
巯基乙醇。上述溶液ii为含0.8μmol/l引物及0.8μmol/l探针的一步荧光定量pcr缓冲液(购于takara公司)。上述溶液iii含浓度为5u/μl的taq dna聚合酶(购于takara公司)。上述溶液v为含10ng/μl phymatotrichopsis omnivora阳性dna(mya
‑
4551或32448，ctab法提取)的阳性对照液，上述溶液vi为不含有phymatotrichopsis omnivora阳性dna的阴性对照液(灭菌去离子水)。
溶液vii含有浓度为100ng/μlphymatotrichopsis omnivora阳性dna(mya
‑
4551或32448，ctab法提取)的定量标准液。
[0045]
实施例3：棉花根腐病菌的检测
[0046]
棉花根腐病菌的检测过程如下：
[0047]
第一步：取干燥的菌丝约0.5g，放入浸没在液氮中的1.5ml离心管中，用塑料杵碾碎，接着再加入600μl ctab提取液，65℃水浴30min，水浴过程中不时颠倒混匀。
[0048]
第二步：10000r/min离心5min，取上清液并加入等体积的萃取液，并混合至乳浊状；本实施例中，上述萃取液为氯仿和异戊醇混合液，并且，该混合液中氯仿和异戊醇的体积比为24:1。
[0049]
第三步：4℃10000rpm离心5min，取上清液并加入该1/10体积(即该上清液体积的1/10)的醋酸钠溶液(3mol/l，ph 6.0)和2.5倍体积(即该上清液体积的2.5倍)的冰冷乙醇，混匀后
‑
20℃下静置30min。
[0050]
第四步：4℃10000rpm离心10min，弃上清，取沉淀并用70％的乙醇漂洗两次，晾干后，加入100μl灭菌去离子水溶解沉淀，得到样品dna，4℃保存备用。
[0051]
第五步：以上述获得的样品dna为模版，利用上述实施例1获得的引物myar/myaf和探针myat进行pcr扩增反应，并对结果进行分析。
[0052]
具体地，荧光定量pcr采用20μl体积反应体系，在abi7900型荧光定量pcr仪上进行，反应体系为：溶液ii 10μl，溶液iii0.4μl，溶液v或溶液vi或dna样品0.5μl，灭菌去离子水补足余量。按下列反应参数进行pcr反应：50℃预热2min；95℃预变性10min；95℃ 15s，60℃ lmin，40个循环。实时荧光pcr利用abi 7900型荧光定量pcr仪自带软件sds3.0进行结果分析，根据阴性对照结果设定阈值线，扩增曲线及样品ct值由软件自动生成。
[0053]
实施例4：特异性检测
[0054]
以表2中各菌株的基因组dna为实验材料，用上述实施例1中制备的p.omnivora的种特异性引物myar/myaf及探针myat行实时荧光pcr检测，以灭菌去离子水为空白对照，检测过程如实施例3所述。其中，表2中mya
‑
4551和32448均为棉花根腐病菌，波状根盘菌与棉花根腐病菌同科，而黑白轮枝菌、大丽轮枝菌、变黑轮枝菌根链格孢、枯草芽孢杆菌以及胶孢炭疽菌均为棉花上的常见菌株，此外，灰葡萄孢与棉花根腐病菌在形态上相近。拟瘤梗孢属(phymatotrichopsis sp.)内只有1种，多主拟瘤梗孢(phymatotrichopsis omnivora)，而同科的波状根盘菌(rhizina undulata)引起的松苗根腐病，在地下产生菌丝索，覆盖在受侵染的根表面，与棉花根腐病引起的症状相似。
[0055]
表2参试菌株及来源
[0056]
菌株编号菌株名称来源mya
‑
4551phymatotrichopsis omnivora购自atcc32448phymatotrichopsis omnivora购自atcccbs 301.56波状根盘菌rhizina undulata购自cbscbs 394.91黑白轮枝菌v.albo
‑
atrum购自cbsvd1大丽轮枝菌verticillium dahliae实验室保存f03718变黑轮枝菌verticillium nigrescens实验室保存ff947根链格孢alternaria radicina实验室保存
ff935灰葡萄孢botrytis cinerea实验室保存ff933枯草芽孢杆菌bacillus subtilis实验室保存ff1133胶孢炭疽菌colletotrichum gloeosporioides实验室保存
[0057]
特异性检测结果如图1所示，由该检测结果可知只有p.omnivora的2个菌株(mya
‑
4551、32448)的模板检测到信号增加，扩增反应呈阳性，而其他参试菌株及灭菌去离子水对照在40个扩增周期内未见信号增长，扩增反应呈阴性，可见本发明中的引物myar/myaf及探针myat的实时荧光pcr特异性良好。
[0058]
实施例5：灵敏度检测
[0059]
为确定油棕猝倒病菌实时荧光pcr的检测限度，将菌株mya
‑
4551的dna分别稀释成27.55ng/μl、2.755ng/μl、0.2755ng/μl、0.02755ng/μl、0.002755ng/μl、0.0002755ng/μl、0.00002755ng/μl以及0.000002755ng/μl 8个不同浓度，分别用引物myar/myaf及探针myat进行实时荧光pcr检测。
[0060]
灵敏性检测结果如图2、图3以及图4所示，结果表明，实时荧光pcr方法对低至0.000002755ng/μl模版浓度的dna样品仍有明显扩增(图2和图3)，系列稀释的扩增曲线的ct值在12～35之间，扩增曲线典型，方法的重复性良好。同时，模版dna稀释度与ct值呈良好的相关性，其相关系数r2＝0.9989，相邻10倍稀释度的ct值差为3.244左右(图4)，结果可靠。