一种高表达AFGF的方法与流程

一种高表达afgf的方法
技术领域
1.本发明涉及生物医药技术领域，具体来说，涉及一种高表达afgf的方法。


背景技术：

2.酸性成纤维生长因子(afgf)是一种多功能强力细胞因子，对促进成纤维细胞的代谢和胶原蛋白的形成发挥着重要功能。afgf能促进皮肤组织的生长繁殖，它通过与细胞表面特异受体结合，调控皮肤上皮、内皮和基质细胞的分裂、繁殖和生长分化，促进细胞代谢，增强氧化作用；能促进与皮肤损伤有关细胞的迅速生长繁殖，并调节细胞间基质的合成、分泌及分解；能促进角质层细胞的再生，加速皮肤角质层和基质层的修复，促进人体皮肤细胞的生长；能增强皮肤细胞的蛋白质的合成和细胞代谢，具有延缓皮肤细胞衰老、促进表皮细胞的修复和生长作用，使皮肤光滑丰润。
3.专利cn102344930a公开了一种酸性成纤维细胞生长因子(afgf)的简便化工业技术，通过体外pcr扩增的方法，从人来源的hepg2的edna中扩增得到afgf基因，并通过ndei和ecori限制性酶切位点与表达载体pet
‑
26b连接，随后将质粒转化入大肠杆菌bl21(de3)获得高效可溶表达，获得天然结构的酸性成纤维细胞生长因子蛋白。但是该方法存在操作复杂的缺陷。


技术实现要素：

4.针对相关技术中的上述技术问题，本发明提出一种高表达afgf的方法，能够克服现有技术的上述不足。
5.为实现上述技术目的，本发明的技术方案是这样实现的：
6.一种高表达afgf的方法，该方法包括以下步骤：
7.s1骨髓细胞生长到密度为95％时进行传代；
8.s2吸出培养液，加入生理盐水并晃动，弃生理盐水；
9.s3加入胰酶，室温消化，使细胞全部悬浮，加入培养基，终止消化；
10.s4吸取细胞悬液放入离心管离心；
11.s5离心后弃上清，加入生理盐水，吸取一滴细胞计数，离心；
12.s6离心后弃生理盐水，用培养基悬细胞加入含培养基的培养瓶中；
13.s7向所述培养瓶中加入10
‑
10000ng/ml胞壁酰二肽(muramyldipeptide，mdp)进行诱导；
14.s8将s7中传代结束的培养瓶放入低温低氧的培养箱中进行培养。
15.优选地，s4中离心的时间为5min，转速为1500rpm。
16.优选地，s5中离心的时间为5min，转速为1500rpm。
17.优选地，s7所述培养瓶中胞壁酰二肽的最终浓度为6000ng/ml。
18.优选地，所述低温低氧的培养箱为20
‑
36℃，5％
‑
40％的氧气的培养箱。
19.优选地，所述培养基为α
‑
mem培养基。
20.优选地，所述培养基为含10％血清替代物的α
‑
mem培养基。
21.本发明的有益效果：本发明的高表达afgf的方法利用低温低氧环境使得骨髓细胞高表达afgf，从而获得更多的afgf；该方法具有高效、简单、稳定性好的优点。
具体实施方式
22.下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
23.实施例1
24.s1显微镜观察骨髓细胞生长到密度约95％取一瓶细胞进行传代；
25.s2吸出培养液，加入15ml生理盐水，轻轻晃动，弃生理盐水；
26.s3培养瓶加入胰酶3ml，室温消化5min，显微镜观察细胞全部悬浮，加入α
‑
mem培养基(含血清替代物10％)5ml，终止消化；
27.s4吸取细胞悬液放入离心管，1500rpm离心5min；
28.s5离心后，弃上清，加入生理盐水45ml，吸取一滴细胞计数，细胞活率97％，1500rpm离心5min；
29.s6弃生理盐水，用2ml培养基悬细胞加入到已加入培养基的150培养瓶中；
30.s7加入2000ng/ml mdp进行诱导；
31.s8将已传代结束的培养瓶放入低温低氧的培养箱(20℃/5％的氧气培养箱)中；
32.s9 24h后取上清，通过elisa试剂盒，检测afgf因子含量是否提高，检测结果见表1。
33.实施例2
34.s1显微镜观察骨髓细胞生长到密度约95％取一瓶细胞进行传代；
35.s2吸出培养液，加入15ml生理盐水，轻轻晃动，弃生理盐水；
36.s3培养瓶加入胰酶3ml，室温消化5min，显微镜观察细胞全部悬浮，加入α
‑
mem培养基(含血清替代物10％)5ml，终止消化；
37.s4吸取细胞悬液放入离心管，1500rpm离心5min；
38.s5离心后，弃上清，加入生理盐水45ml，吸取一滴细胞计数，细胞活率97％，1500rpm离心5min；
39.s6弃生理盐水，用2ml培养基悬细胞加入到已加入培养基的150培养瓶中；
40.s7加入4000ng/ml mdp进行诱导；
41.s8将已传代结束的培养瓶放入低温低氧的培养箱(24℃/8％的氧气培养箱)中；
42.s9 24h后取上清，通过elisa试剂盒，检测afgf因子含量是否提高，检测结果见表1。
43.实施例3
44.s1显微镜观察骨髓细胞生长到密度约95％取一瓶细胞进行传代；
45.s2吸出培养液，加入15ml生理盐水，轻轻晃动，弃生理盐水；
46.s3培养瓶加入胰酶3ml，室温消化5min，显微镜观察细胞全部悬浮，加入α
‑
mem培养基(含血清替代物10％)5ml，终止消化；
47.s4吸取细胞悬液放入离心管，1500rpm离心5min；
48.s5离心后，弃上清，加入生理盐水45ml，吸取一滴细胞计数，细胞活率97％，1500rpm离心5min；
49.s6弃生理盐水，用2ml培养基悬细胞加入到已加入培养基的150培养瓶中；
50.s7加入6000ng/ml mdp进行诱导；
51.s8将已传代结束的培养瓶放入低温低氧的培养箱(28℃/10％的氧气培养箱)中；
52.s9 24h后取上清，通过elisa试剂盒，检测afgf因子含量是否提高，检测结果见表1。
53.实施例4
54.s1显微镜观察骨髓细胞生长到密度约95％取一瓶细胞进行传代；
55.s2吸出培养液，加入15ml生理盐水，轻轻晃动，弃生理盐水；
56.s3培养瓶加入胰酶3ml，室温消化5min，显微镜观察细胞全部悬浮，加入α
‑
mem培养基(含血清替代物10％)5ml，终止消化；
57.s4吸取细胞悬液放入离心管，1500rpm离心5min；
58.s5离心后，弃上清，加入生理盐水45ml，吸取一滴细胞计数，细胞活率97％，1500rpm离心5min；
59.s6弃生理盐水，用2ml培养基悬细胞加入到已加入培养基的150培养瓶中；
60.s7加入8000ng/ml mdp进行诱导；
61.s8将已传代结束的培养瓶放入低温低氧的培养箱(32℃/30％的氧气培养箱)中；
62.s9 24h后取上清，通过elisa试剂盒，检测afgf因子含量是否提高，检测结果见表1。
63.实施例5
64.s1显微镜观察骨髓细胞生长到密度约95％取一瓶细胞进行传代；
65.s2吸出培养液，加入15ml生理盐水，轻轻晃动，弃生理盐水；
66.s3培养瓶加入胰酶3ml，室温消化5min，显微镜观察细胞全部悬浮，加入α
‑
mem培养基(含血清替代物10％)5ml，终止消化；
67.s4吸取细胞悬液放入离心管，1500rpm离心5min；
68.s5离心后，弃上清，加入生理盐水45ml，吸取一滴细胞计数，细胞活率97％，1500rpm离心5min；
69.s6弃生理盐水，用2ml培养基悬细胞加入到已加入培养基的150培养瓶中；
70.s7加入10000ng/ml mdp进行诱导；
71.s8将已传代结束的培养瓶放入低温低氧的培养箱(36℃/40％的氧气培养箱)中；
72.s9 24h后取上清，通过elisa试剂盒，检测afgf因子含量是否提高，检测结果见表1。
73.表1实施例afgf因子含量检测结果
74.条件实施例1实施例2实施例3实施例4实施例5温度℃2024283236氧气％58103040mdp(ng/ml)200040006000800010000
afgf(pg/ml)55.7170.23118.8688.1150.56
75.对比例1
76.s1显微镜观察骨髓细胞生长到密度约95％取一瓶细胞进行传代；
77.s2吸出培养液，加入15ml生理盐水，轻轻晃动，弃生理盐水；
78.s3培养瓶加入胰酶3ml，室温消化5min，显微镜观察细胞全部悬浮，加入α
‑
mem培养基(含血清替代物10％)5ml，终止消化；
79.s4吸取细胞悬液放入离心管，1500rpm离心5min；
80.s5离心后，弃上清，加入生理盐水45ml，吸取一滴细胞计数，细胞活率97％，1500rpm离心5min；
81.s6弃生理盐水，用2ml培养基悬细胞加入到已加入与实施例1等量培养基的150培养瓶中；
82.s7加入2000ng/ml mdp进行诱导；
83.s8将已传代结束的培养瓶放入正常培养箱(37℃/5％的二氧化碳培养箱)中；
84.s9 24h后取上清，通过elisa试剂盒，检测因子含量是否提高，检测结果见表2。
85.对比例2
86.s1显微镜观察骨髓细胞生长到密度约95％取一瓶细胞进行传代；
87.s2吸出培养液，加入15ml生理盐水，轻轻晃动，弃生理盐水；
88.s3培养瓶加入胰酶3ml，室温消化5min，显微镜观察细胞全部悬浮，加入α
‑
mem培养基(含血清替代物10％)5ml，终止消化；
89.s4吸取细胞悬液放入离心管，1500rpm离心5min；
90.s5离心后，弃上清，加入生理盐水45ml，吸取一滴细胞计数，细胞活率97％，1500rpm离心5min；
91.s6弃生理盐水，用2ml培养基悬细胞加入到已加入与实施例2等量培养基的150培养瓶中；
92.s7加入4000ng/ml mdp进行诱导；
93.s8将已传代结束的培养瓶放入正常培养箱(37℃/5％的二氧化碳培养箱)中；
94.s9 24h后取上清，通过elisa试剂盒，检测因子含量是否提高，检测结果见表2。
95.对比例3
96.s1显微镜观察骨髓细胞生长到密度约95％取一瓶细胞进行传代；
97.s2吸出培养液，加入15ml生理盐水，轻轻晃动，弃生理盐水；
98.s3培养瓶加入胰酶3ml，室温消化5min，显微镜观察细胞全部悬浮，加入α
‑
mem培养基(含血清替代物10％)5ml，终止消化；
99.s4吸取细胞悬液放入离心管，1500rpm离心5min；
100.s5离心后，弃上清，加入生理盐水45ml，吸取一滴细胞计数，细胞活率97％，1500rpm离心5min；
101.s6弃生理盐水，用2ml培养基悬细胞加入到已加入与实施例3等量培养基的150培养瓶中；
102.s7加入6000ng/ml mdp进行诱导；
103.s8将已传代结束的培养瓶放入正常培养箱(37℃/5％的二氧化碳培养箱)中；
104.s9 24h后取上清，通过elisa试剂盒，检测因子含量是否提高，检测结果见表2。
105.对比例4
106.s1显微镜观察骨髓细胞生长到密度约95％取一瓶细胞进行传代；
107.s2吸出培养液，加入15ml生理盐水，轻轻晃动，弃生理盐水；
108.s3培养瓶加入胰酶3ml，室温消化5min，显微镜观察细胞全部悬浮，加入α
‑
mem培养基(含血清替代物10％)5ml，终止消化；
109.s4吸取细胞悬液放入离心管，1500rpm离心5min；
110.s5离心后，弃上清，加入生理盐水45ml，吸取一滴细胞计数，细胞活率97％，1500rpm离心5min；
111.s6弃生理盐水，用2ml培养基悬细胞加入到已加入与实施例4等量培养基的150培养瓶中；
112.s7加入8000ng/ml mdp进行诱导；
113.s8将已传代结束的培养瓶放入正常培养箱(37℃/5％的二氧化碳培养箱)中；
114.s9 24h后取上清，通过elisa试剂盒，检测因子含量是否提高，检测结果见表2。
115.对比例5
116.s1显微镜观察骨髓细胞生长到密度约95％取一瓶细胞进行传代；
117.s2吸出培养液，加入15ml生理盐水，轻轻晃动，弃生理盐水；
118.s3培养瓶加入胰酶3ml，室温消化5min，显微镜观察细胞全部悬浮，加入α
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mem培养基(含血清替代物10％)5ml，终止消化；
119.s4吸取细胞悬液放入离心管，1500rpm离心5min；
120.s5离心后，弃上清，加入生理盐水45ml，吸取一滴细胞计数，细胞活率97％，1500rpm离心5min；
121.s6弃生理盐水，用2ml培养基悬细胞加入到已加入与实施例5等量培养基的150培养瓶中；
122.s7加入10000ng/ml mdp进行诱导；
123.s8将已传代结束的培养瓶放入正常培养箱(37℃/5％的二氧化碳培养箱)中；
124.s9 24h后取上清，通过elisa试剂盒，检测因子含量是否提高，检测结果见表2。
125.表2对比例afgf因子含量检测结果
126.条件对比例1对比例2对比例3对比例4对比例5温度℃3737373737二氧化碳％55555mdp(ng/ml)200040006000800010000afgf(pg/ml)25.3325.6726.4325.8324.12
127.由表1
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2的数据可见，利用低温低氧环境能够使骨髓细胞高表达afgf。
128.上述实施例及对比例中所述血清替代物的品牌为thermofisher，货号为：10828028。
129.综上所述，借助于本发明的上述技术方案，本发明的高表达afgf的方法利用低温低氧环境使得骨髓细胞高表达afgf，从而获得更多的afgf；该方法具有高效、简单、稳定性好的优点。
130.以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。