一种提高多粘菌素B发酵水平的方法与流程

一种提高多粘菌素b发酵水平的方法
技术领域
1.本发明属于生物发酵工程技术领域，具体地涉及一种提高多粘菌素b发酵水平的方法。


背景技术：

2.多粘菌素b是1947年首次从多粘类芽孢杆菌(paenibacillus polymyxa)中分离出来的一类多肽类抗生素，由于抗菌药物的使用，导致细菌出现对抗菌药物的广泛耐药性，甚至出现了几乎对所有临床可用抗菌药物均耐药的超级细菌。随着耐药菌株日趋增多，耐药程度亦不断增强，特别是革兰氏阴性杆菌，常表现出多重耐药性。而近年来的临床研究发现，常见革兰氏阴性杆菌对多粘菌素b仍保持较高敏感性，自上市以来，市场需求一直呈上升态势，市场需求增长强劲。
3.我国于1990年代末开始研制生产多粘菌素b，目前国内仅有少数几家能够进行原料药的生产，且产量有限，国内制剂厂家主要依赖从国外进口原料满足需求，而且国内生产成本较高，市场竞争能力较弱，除质量问题外，发酵水平偏低也是一个重要原因，因此，有必要进一步优化多粘菌素b发酵工艺，提高发酵水平，扩大发酵产能，降低生产成本，以满足市场需求。
4.目前国内对多粘菌素b发酵工艺的研究，主要集中在菌株的筛选和改造、发酵基础配方的调整优化，例如专利cn111100823b和专利cn101235407b都对发酵基础配方进行了优化，提高了多粘菌素b的发酵单位，但基础配方调整主要是针对特定菌株进行优化，不同菌株之间存在一定差异，对于不同菌株需要重新进行配方筛选和优化，不适合大范围推广和快速应用。
[0005][0006]
从多粘菌素b的结构组成可以看出，主要是由氨基酸组成，包括脂肪酸链部分也是有氨基酸为前体演变而来，所以提高多粘菌素b产生菌胞内氨基酸的浓度，势必会对多粘菌素b的合成和积累起到一定的作用。多粘菌素b的合成过程中并不需要细胞内核糖体的参与，与细胞内普通蛋白质的合成过程并不相同。链霉素和四环素等主要是抑制胞内核糖体的功能，本发明设想通过添加这类抗生素对多粘菌素b产生菌胞内核糖体产生一定的抑制作用，减少胞内氨基酸类前体物质流向蛋白质合成途径，积累更多的氨基酸类前体物质，促进氨基酸类前体物质向多粘菌素b的合成方向转移，从而提高多粘菌素b的发酵水平。本发明通过实验研究，最终确定了发酵过程补加链霉素的工艺可以提高多粘菌素b的发酵水平。


技术实现要素：

[0007]
本发明为了解决现有技术中存在的缺点，提供了一种工艺简单易操作、生产成本低、利于工业化推广的提高多粘菌素b发酵水平的方法。
[0008]
本发明采用的技术方案为：一种提高多粘菌素b发酵水平的方法，包括发酵培养基及发酵过程控制，所述发酵培养基含有由碳源、氮源和无机盐组成的基础成分及抗生素。
[0009]
进一步地，所述发酵培养基基础成分为：小麦面粉100
‑
140g/l，黄豆粉25
‑
30g/l，硫酸铵30
‑
40g/l，玉米浆10
‑
20g/l，磷酸二氢钾0.5
‑
0.8g/l，硫酸镁0.4
‑
0.6g/l，碳酸钙5
‑
7g/l。
[0010]
进一步地，所述发酵过程控制包括：多粘菌素b发酵接种量为7％，培养温度为30℃，全程控制溶氧水平大于30％，自控ph6.0，罐压0.04
‑
0.06mpa；发酵培养16
‑
20h时加入抗生素。
[0011]
进一步地，所述发酵过程控制中发酵培养18h时加入抗生素。
[0012]
进一步地，所述抗生素为链霉素、红霉素或四环素中的一种。
[0013]
进一步地，所述抗生素为链霉素。
[0014]
进一步地，所述链霉素的浓度为0.04
‑
0.06μg/ml。
[0015]
进一步地，所述链霉素的浓度为0.05μg/ml。
[0016]
本发明获得的有益效果为：1)提高发酵水平：本发明通过分析多粘菌素b的合成机理，在正常发酵工艺中，提出补加链霉素，抑制细菌体内氨基酸类物质转向普通蛋白质合成方向，积累更多氨基酸类前体物质，促进氨基酸类前体物质向多粘菌素b的合成方向转移，从而提高发酵效价水平。2)工艺简单易于实现：本发明采用的方法在发酵行业中属于简单、易于实现的操作，对于生产操作人员容易理解和快速掌握该方法。3)降低生产成本：采用本发明的方法，对发酵阶段的多粘菌素b产量有了明显的提升，相对的产品成本有了进一步的降低。
[0017]
本发明通过分析多粘菌素b的合成途径，对细胞内氨基酸的合成和代谢途径进行综合分析，确定了链霉素这类抗生素可以对细胞内核糖体产生抑制作用，为多粘菌素b的合成积累更多的氨基酸前体，促进多粘菌素b发酵水平的提高。结合实验结果，对链霉素的添加周期和添加浓度进行了多批次的研究，确定了18h添加终浓度为0.05μg/ml的链霉素可以提高多粘菌素b的合成，且对菌体自身的生长代谢不会产生明显影响。过早或过量添加对菌体自身的生长代谢都会产生较大的影响，直接影响菌量或菌体活力，对积累多粘菌素b也会产生影响；过晚或添加量偏少都不会产生促进多粘菌素b合成的作用。
附图说明
[0018]
图1为本发明实施例1结果液相图谱；
[0019]
图2为本发明实施例2结果液相图谱；
[0020]
图3为本发明实施例3结果液相图谱；
[0021]
图4为本发明实施例4结果液相图谱；
[0022]
图5为本发明实施例5结果液相图谱；
[0023]
图6为本发明实施例6结果液相图谱；
[0024]
图7为本发明实施例7结果液相图谱；
[0025]
图8为本发明实施例8结果液相图谱；
[0026]
图9为本发明实施例9结果液相图谱；
[0027]
图10为本发明实施例10结果液相图谱；
[0028]
图11为本发明实施例11结果液相图谱。
具体实施方式
[0029]
下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。
[0030]
实施例1
[0031]
按发酵培养基的组成，分别称取小麦面粉100
‑
140g/l，黄豆粉25
‑
30g/l，硫酸铵30
‑
40g/l，玉米浆10
‑
20g/l，磷酸二氢钾0.5
‑
0.8g/l，硫酸镁0.4
‑
0.6g/l，碳酸钙5
‑
7g/l，投入到发酵罐中，加水配置成发酵培养基，搅拌均匀后，高温消毒灭菌，待冷却至室温后，将培养好的种子液接入发酵培养基内。接种量7％，培养温度为30℃，通入无菌空气，全程控制溶氧水平大于30％，自控ph6.0，罐压0.04
‑
0.06mpa，培养至48h结束发酵，得到多粘菌素b发酵液，检测发酵液中多粘菌素b含量。
[0032]
实施例2
[0033]
与实施例1不同之处在于：发酵培养基料消毒灭菌后，在接种之前，加入已消毒的终浓度为0.05μg/ml的链霉素。
[0034]
实施例3
[0035]
与实施例1不同之处在于：发酵培养周期12h时，加入已消毒的终浓度为0.05μg/ml的链霉素。
[0036]
实施例4
[0037]
与实施例1不同之处在于：发酵培养周期18h时，加入已消毒的终浓度为0.05μg/ml的链霉素。
[0038]
实施例5
[0039]
与实施例1不同之处在于：发酵培养周期24h时，加入已消毒的终浓度为0.05μg/ml的链霉素。
[0040]
实施例6
[0041]
与实施例1不同之处在于：发酵培养周期18h时，加入已消毒的终浓度为0.03μg/ml的链霉素。
[0042]
实施例7
[0043]
与实施例1不同之处在于：发酵培养周期18h时，加入已消毒的终浓度为0.04μg/ml的链霉素。
[0044]
实施例8
[0045]
与实施例1不同之处在于：发酵培养周期18h时，加入已消毒的终浓度为0.06μg/ml的链霉素。
[0046]
实施例9
[0047]
与实施例1不同之处在于：发酵培养周期18h时，加入已消毒的终浓度为0.07μg/ml的链霉素。
[0048]
实施例10
[0049]
与实施例1不同之处在于：发酵培养基料消毒灭菌后，在接种之前，加入已消毒的终浓度为0.05μg/ml的四环素。
[0050]
实施例11
[0051]
与实施例1不同之处在于：发酵培养基料消毒灭菌后，在接种之前，加入已消毒的终浓度为0.05μg/ml的红霉素。
[0052]
实施例1
‑
11得到的多粘菌素b含量结果见表1
[0053]
表1不同实施例得到的多粘菌素b含量结果
[0054]
实验组含量(
×
104u/ml)提高比例(％)实施例12.23/实施例20.57
‑
74.44实施例32.418.07实施例42.9532.29实施例52.33.14实施例62.4610.31实施例72.8226.46实施例82.5614.80实施例91.84
‑
17.49实施例102.5916.14实施例112.6317.94
[0055]
从液相图谱中可以看出，多粘菌素b属于多组分产物，主成分分别在14min、16.5min、23min和29min左右出峰，以四个主成分之和作为多粘菌素b效价结果。从数据结果可以看出，在接种前加入链霉素对发酵过程中多粘菌素b的积累有很大的影响，液相图谱2和液相图谱1对比，主成分峰面积总量明显减少，主要是由于发酵早起菌量偏少，链霉素对菌体的正常代谢生长产生了明显的抑制作用，由于菌体量偏少，因此至培养结束时，发酵液中积累的多粘菌素b的含量较少。为了减少链霉素对菌体正常生长的影响，采用过程补加的方式进行，从液相图谱3、4和5的结果可以看出，随着补加周期的延后，效价有所增加，但过晚补加对结果提高作用不明显，其中以发酵培养至18h左右，补加链霉素最合适，对促进多粘菌素b积累的作用最好，有效提高发酵液中多粘菌素b含量32.29％，与之相对应的液相图谱5中四个主成分峰面积总量有明显的提高，尤其是29min左右的成分峰面积提高明显。在此条件下，不同浓度的链霉素对发酵过程中多粘菌素b的积累也产生了不同的影响，添加量偏少，对多粘菌素b的含量提高幅度偏少，液相图谱6和7分别显示了低于最佳添加量时图谱的结果；液相图谱8和9分别显示高了最佳添加量时，四个主成分峰面积相对最佳添加量都有明显降低，说明添加量偏多，会直接抑制菌体的正常代谢功能，造成菌体过早衰亡，多粘菌素b含量偏低，因此，以0.05μg/ml的终浓度最合适。与链霉素具有同等抑制核糖体代谢功能的四环素和红霉素，从液相图谱图10和图11中可以看出，在相同的条件下，以链霉素效果最好，对提高多粘菌素b在发酵液中积累的作用最显著，得到的发酵液中四个主成分峰面积之和最高，其次是红霉素，最后是四环素。
[0056]
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，
任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。