嗜酸乳杆菌LA85在制备降血脂药物或保健食品上的应用的制作方法

嗜酸乳杆菌la85在制备降血脂药物或保健食品上的应用
技术领域
1.本发明属于微生物技术领域，尤其是涉及嗜酸乳杆菌la85在制备降血脂药物或保健食品上的应用。


背景技术：

2.《中国居民营养与慢性病状况报告(2020年)》中指出城乡各年龄段居民超重肥胖率继续上升，有超过50％的成年居民超重肥胖，18岁及以上居民超重率和肥胖率分别为34.3％和16.4％。6～17岁、6岁以下儿童青少年超重肥胖率分别达到19％和10.4％。而且呈现出上升速度较快、流行水平较高、全人群均受影响的发展趋势。而高血脂症是超重肥胖常见的相关并发症。高血脂症通常会引起内皮细胞的功能障碍以及血管壁功能和结构的损伤，并直接引起动脉粥样硬化、冠心病及胰腺炎等一些严重危害人体健康的疾病。常用的药物治疗主要是将血脂长期控制在一定范围，并没有完全治愈高血脂症，最常用的降脂药有他汀类药物、氯贝丁酯类、烟酸类及胆酸鳌合树脂类等。随着国人健康意识提高，越来越多的人倾向于通过改善饮食、食用益生菌等方式代替药物治疗来实现身体的健康。嗜酸乳杆菌是常见益生菌之一，本发明所述嗜酸乳杆菌la85通过调节肠道菌群降低血脂，实现降低高血脂的目的。


技术实现要素：

3.本发明提供嗜酸乳杆菌la85在制备降血脂药物或保健食品上的应用。高血脂症患者通过食用含有益生菌la85的药物或保健食品代替化学药物，可以从根本上调节肠道菌群并降低血脂。
4.本发明涉及的嗜酸乳杆菌la85，其分类命名为嗜酸乳杆菌lactobacillus acidophilus，该菌株于2021年02月01日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(cgmcc)，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为cgmcc no.21802。其首次公开在中国专利申请202110285880.1中。
5.本发明的体外实验证明，本发明所述的嗜酸乳杆菌la85，具有较高的体外胆固醇去除率。所述的嗜酸乳杆菌la85，能够显著降低高脂小鼠血清tc、tg水平，提高血清hdl
‑
c水平。
6.所述的嗜酸乳杆菌la85菌剂，人体试食15天后，与食用前及对照组相比，双歧杆菌和乳杆菌均显著增加，拟杆菌、肠杆菌、肠球菌、产气荚膜梭菌均无明显变化。可见，嗜酸乳杆菌la85菌剂具有调剂肠道菌群的功能。
7.所述的嗜酸乳杆菌la85菌粉发酵工艺：将保存于甘油管中的嗜酸乳杆菌菌株经过两级活化，接种到发酵罐中发酵。在发酵温度为35℃、搅拌转速100rpm、初始ph调节为6.5的条件下开始发酵，发酵过程中用23％(m/v)碳酸钠维持ph为5.8，维持罐压为0.03mpa，培养10h。
8.所述的嗜酸乳杆菌la85菌粉制备工艺：
9.(1)将通过上述嗜酸乳杆菌发酵液4℃、8000rpm离心10min，去上清，收集菌泥。
10.(2)按照菌泥与冻干保护剂质量比1:1
‑
1.2将两者混合均匀，进行真空冷冻干燥得到嗜酸乳杆菌冻干菌粉。所述的真空冷冻干燥的条件为：预冻温度为
‑
42～
‑
45℃，真空度10
‑
20pa，时间24
‑
28h。
11.所述的冻干保护剂包含如下按质量百分比计的组分：15％海藻糖，5％脱脂奶粉，2％蔗糖，2％甘油，0.5％山梨醇。
12.本发明提供了嗜酸乳杆菌la85在制备降血脂保健食品上的应用。
13.所述保健食品，包括压片糖果、发酵饮料、软糖、调制乳粉、发酵乳、固体饮料。
14.本发明还提供了嗜酸乳杆菌la85在制备降血脂药物上的应用，所述药物包括但不限于微生态制剂。
15.本发明所采用的嗜酸乳杆菌la85来自健康人体肠道，安全无致病性，通过体外试验、小鼠试验、人体试食试验证明其具有调节肠道菌群、降血脂功效。将其广泛应用到食品领域，增大消费者摄入的可能性，通过日常摄入就可以达到调节肠道菌群、降低血脂的目的。当然，所采用的嗜酸乳杆菌la85也可以用于制备降低血脂的药物中。
具体实施方式
16.以下由特定的具体实施例说明本发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点及功效。
17.以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
18.实施例1嗜酸乳杆菌胆固醇去除率测定
19.菌株活化：从
‑
80℃冰箱取出甘油管，解冻后，以2％接种量接种于装有mrs培养基的厌氧管中，置于37℃培养12h
‑
24h，生长至菌液浑浊为活化一代。
20.mrs培养基成分：蛋白胨10g、牛肉浸粉5g、酵母浸粉4g、k2hpo
4 2g、柠檬酸三铵2g、乙酸钠5g、葡萄糖20g、吐温80 1ml、mgso4·
7h2o 0.58g、mnso4
·
4h2o 0.25g、蒸馏水1000ml；ph值6.2
±
0.2；培养条件：37℃，静置培养：18
‑
24h。
21.(1)胆固醇标准曲线测定：准确称取0.1g胆固醇粉末，正己烷定容1mg/ml的溶液，然后分别吸取0.02、0.04、0.06、0.08、0.1、0.12、0.14ml到比色管中，60℃水浴氮气吹干后，加入4ml 0.5mg/ml邻苯二甲醛溶液和2ml 98％浓硫酸，显色反应20min，在553nm处测定吸光度值，以胆固醇含量为横轴，吸光度值为纵轴作标准曲线。
22.(2)邻苯二甲醛测定胆固醇含量的方法：取1ml样品，加入3ml 95％乙醇和2ml 50％(w/v)氢氧化钾，涡旋振荡混匀。于60℃下恒温水浴10min，冷却后加入5ml正己烷，涡旋震荡萃取1
‑
2min，加入2ml蒸馏水，振荡均匀，静置分层。取2ml上层正己烷，60℃水浴氮气吹干，加入4ml 0.5mg/ml(w/v)邻家二甲醛溶液(用冰醋酸定容)和2ml浓硫酸显色反应20min，在553nm处测定吸光度值。
23.(3)嗜酸乳杆菌胆固醇去除率测定：
24.将菌种接种于装有mrs液体培养基的厌氧管中，37℃静置培养12h转接3次活化后，按2％(v/v)接种量接种于5ml培养液mrso
‑
chol中，摇匀后立即取样1ml，4000r/min离心5min，取上清液用邻苯二甲醛比色法测定胆固醇含量。接种后的发酵液37℃静置培养12h、18h、24h后用同样方法测定上清中胆固醇含量，做多组平行求平均值。其中培养液mrso
‑
chol的组成：由mrs液体培养基、巯基乙酸钠、胆固醇和牛胆盐组成；巯基乙酸钠的浓度为2g/l，胆固醇的浓度为200mg/l，牛胆盐的浓度为0.3％(质量分数)，115℃灭菌20min。
25.胆固醇的去除率：
26.式中：a为菌株发酵后的培养基553nm处的吸光度值，b为空白对照553nm处的吸光度值。
27.(4)嗜酸乳杆菌胆固醇去除率
28.表1嗜酸乳杆菌胆固醇去除率结果
[0029][0030]
实施例2嗜酸乳杆菌la85降血脂能力评估
[0031]
(1)实验分组及喂养方式
[0032]
取培养后的嗜酸乳杆菌la85，用生理盐水洗涤3次，将浓度调整至1.0
×
109cfu/ml用于小鼠灌胃试验。将40只8周龄balb/c小鼠按各组间平均体质量无显著差异重新分为2组：正常组：饲喂基础饲料，对照组：饲喂高脂饲料 生理盐水，实验组：饲喂高脂饲料 嗜酸乳杆菌la85，每组20只。每只小鼠灌胃1ml/次，连续灌胃14d。
[0033]
(2)血清中血清胆固醇(tc)、血清甘油三酯(tg)、高密度脂蛋白胆固醇(hdl
‑
c)含量的测定
[0034]
在小鼠灌胃14d禁食12h，分别采血，2500r/min离心10min，取血清。分别参照试剂盒说明，采用酶标仪测定血清中tc、tg和hdl
‑
c的含量并对比各组间血清指标的差异。
[0035]
(3)数据处理
[0036]
采用spss 26统计软件，用方差分析检验显著性，多重比较用最小显著性差异法(least significant difference，lsd)检验进行数据分析。
[0037]
(4)嗜酸乳杆菌la85对高血脂症小鼠的影响
[0038]
表2嗜酸乳杆菌la85对小鼠血清tc、tg、hdl
‑
c的影响(mmol/l)
[0039][0040]
注：同一列不同字母表示差异显著(p＜0.05)。
[0041]
由表2可知，小鼠饲喂高脂饲料14天，实验小组小鼠血清tc水平显著低于对照组，与正常组小鼠的血清tc水平无显著性差异，说明饲喂嗜酸乳杆菌la85可显著降低高脂小鼠的血清tc水平，降低后的效果接近正常组小鼠；实验组小鼠血清tg含量显著低于对照组，且显著高于正常组小鼠血清tg含量，说明饲喂嗜酸乳杆菌la85可显著降低高脂小鼠的血清tg水平；实验组小鼠血清hdl
‑
c含量与正常组无显著性差异，显著高于对照组，说明饲喂嗜酸
乳杆菌la85可降低高脂小鼠的血清hdl
‑
c水平。饲喂嗜酸乳杆菌la85能够显著降低高脂小鼠血清tc、tg水平，提高hdl
‑
c水平，参照《保健食品检验与评价技术规范》可判定嗜酸乳杆菌la85具有降血脂功能。
[0042]
实施例3人体试食试验
[0043]
1)受试者招募标准：(1)一个月内未患过胃肠疾病；(2)一个月内未服用过抗生素；(3)短期内未服用过与受试功能相关的物品(4)65岁以下年龄，非妊娠或哺乳期妇女。
[0044]
2)实验方法：将符合标准的受试者随机分为对照组和试食组，每组50人，试食组每日服用2次嗜酸乳杆菌la85菌剂，每次1克(含100亿cuf)；对照组每日服用等量的淀粉，连续服用14天，试验期间不改变原来的饮食习惯。无菌采取受试者服用前后的粪便1.0g。10倍系列稀释，选择合适的稀释度分别接种在各培养基上，计数菌落，计算出每克湿便中的菌数。各种肠道菌群的培养基及培养条件见表3。
[0045]
表3肠道菌群培养条件及培养基
[0046][0047][0048]
3)结果处理：试验数据为计量资料，采用t检验进行分析。自身对照资料采用配对t检验，两组均数比较采用成组t检验分析。
[0049]
4)人体试食结果及分析
[0050]
表4人体试食前后肠道菌群变化(lg cfu/g)
[0051][0052]
注：大写字母为试食后与对照组相比，p＜0.05；小写字母为试食组与试食前相比，p＜0.05。
[0053]
从表4中可以看出试食后试食组与对照组相比，双歧杆菌和乳杆菌显著增加，拟杆菌、肠杆菌、肠球菌、产气荚膜梭菌无明显变化；试食嗜酸乳杆菌la85菌剂后与试食前比双
歧杆菌和乳杆菌显著增加，拟杆菌、肠杆菌、肠球菌、产气荚膜梭菌无明显变化。可见，嗜酸乳杆菌la85菌剂具有调剂肠道菌群的功能。
[0054]
实施例3嗜酸乳杆菌la85菌粉制备
[0055]
1)嗜酸乳杆菌la85菌粉发酵工艺：
[0056]
将保存于甘油管中的嗜酸乳杆菌菌株接入10ml种子培养基中，37℃静置培养6
‑
8h即为一级种子；
[0057]
将一级种子以5％的接种量接种于200ml种子培养基中，37℃静置培养5
‑
6h即为二级种子；
[0058]
发酵罐培养：发酵罐体积为15l，装入发酵培养基10l，灭菌温度为115℃，20min，以2％(v/v)的接种量将培养获得的二级种子全部接种到发酵罐，在发酵温度为35℃、搅拌转速100rpm、初始ph调节为6.5的条件下开始发酵，发酵过程中用23％(m/v)碳酸钠维持ph为5.8，维持罐压为0.03mpa，培养10h。
[0059]
所述的种子培养基的配方为：20g/l葡萄糖，10g/l牛肉浸粉，5g/l酵母粉，10g/l蛋白胨，5g/l乙酸钠，2g/l柠檬酸钠，3g/l磷酸氢二钾，0.5g/l酸镁，0.1g/l硫酸锰，1g/l吐温80，1g/l l
‑
半光氨酸盐酸盐，115℃灭菌20min。
[0060]
所述发酵培养基配方为：50g/l乳糖，15g/l酵母粉，20g/l蛋白胨，5g/l牛肝浸粉，5g/l乙酸钠，3g/l柠檬酸钠，3g/l磷酸氢二钾，0.5g/l硫酸镁，0.1g/l硫酸锰，1g/l吐温80，1g/l l
‑
半光氨酸盐酸盐，115℃灭菌20min。
[0061]
2)所述的嗜酸乳杆菌la85菌粉制备工艺：
[0062]
(1)将通过上述嗜酸乳杆菌高密度发酵的方法得到的发酵液离心，去上清，收集菌泥。所述的离心的方法优选为4℃、8000rpm离心10min。
[0063]
(2)按照菌泥与冻干保护剂质量比1:1
‑
1.2将两者混合均匀，进行真空冷冻干燥得到嗜酸乳杆菌冻干菌粉。所述的真空冷冻干燥的条件为：预冻温度为
‑
42～
‑
45℃，真空度10
‑
20pa，时间24
‑
28h。
[0064]
所述的冻干保护剂包含如下按质量百分比计的组分：15％海藻糖，5％脱脂奶粉，2％蔗糖，2％甘油，0.5％山梨醇。
[0065]
实施例4嗜酸乳杆菌在调制乳粉中的应用
[0066]
1)调制乳粉原料配比
[0067][0068]
2)调制乳粉的干法制备工艺：
[0069]
(1)称量：按照配比称量所有原料；
[0070]
(2)预混：将嗜酸乳杆菌粉剂与菊粉预混3
‑
5分钟，过40目的筛；
[0071]
(3)总混：将所有原料总混20
‑
50分钟，得到具有调节肠道、降低血脂的调制乳粉组合物。
[0072]
3)调制乳粉湿法工艺：
[0073]
去除鲜牛乳中的杂质并标准化；将脱脂乳粉、木糖醇、菊粉、低聚木糖搅拌溶解15分钟，水合25分种，打入生牛乳中；16
‑
18mpa/65℃条件下均质；杀菌温度88
‑
92℃，浓缩至浓度13be；高压泵压力14
‑
17mpa，进风温度170
‑
190℃，排风温度80
‑
84℃，进行喷雾干燥，得到干粉a；将嗜酸乳杆菌菌粉与部分干粉a预混3
‑
5分钟，过40目的筛得到b；将b、和其余干粉a总混20
‑
50分钟，得到具有调节肠道、降低血脂的调制乳粉组合物。
[0074]
实施例5嗜酸乳杆菌在发酵乳中的应用
[0075]
原料重量份(每1000ml)：白砂糖80克；增稠剂5克；嗜酸乳杆菌la85菌粉1克、嗜热链球菌/保加利亚乳杆菌发酵剂0.04活力单位，鲜牛奶定容至1000ml。
[0076]
发酵乳的制备工艺：
[0077]
(1)将稳定剂、白砂糖混匀后加入加热的鲜牛奶中，搅拌溶解均匀后得到混合料；
[0078]
(2)将所述混合料均质、杀菌和冷却，获得冷却后的基料；其中均质压150～170bar，杀菌温度：95
±
3℃、时间300秒，冷却至42
±
1℃。
[0079]
(3)向所述基料接种所述嗜酸乳杆菌la85菌粉、嗜热链球菌/保加利亚乳杆菌发酵剂，43℃静置发酵10h，即获得具有调节肠道、降低血脂功能的酸奶。