基于谷胱甘肽组装的葡萄糖生物传感器的构建方法与流程

1.本发明属于生物传感器技术领域，具体涉及一种基于谷胱甘肽组装的葡萄糖生物传感器的构建方法。


背景技术：

2.石墨烯(graphene,gn)是一种新型的二维碳材料，被称为“碳材料之母”，其具有优良的导电性，很高的载流子迁移率(达15000cm2.v
‑1.s
‑1)，电催化性能，高的比表面，较好的机械稳定性等性质，是制备生物传感器的一种理想的电极材料。gn在电化学过程中有效地提高了生物传感器的灵敏度和响应信号，并促进了电子的传输。gn具有高的比表面可提高生物试剂的负载量，因此可改善传感器的灵敏度等性能。此外gn还能保持负载生物试剂的活性，使生物传感器具有良好稳定性。
3.葡萄糖的分析与检测对人体的健康及疾病的诊断、治疗和控制有着重要意义，因此，葡萄糖传感器的研究始终是化学与生物传感器研究的热点之一。在诸多类型的葡萄糖生物传感器中，有关葡萄糖电化学传感器的研究较多。有酶的葡萄糖生物传感器是基于酶对底物的特异性识别功能，具有专一性及高度选择性。
4.中国专利cn103175884a公开一种高灵敏度葡萄糖生物传感器及其制备方法。将打磨好的铂电极置于k2pdcl4与硫酸的混合溶液中电沉积得钯纳米颗粒修饰的铂电极，将葡萄糖氧化酶和牛血清白蛋白溶于磷酸盐缓冲溶液中，然后再加入戊二醛溶液和酸处理过的单壁碳纳米管溶液混合得酶溶液，将钯纳米颗粒修饰的铂电极在酶溶液中蘸取，得到葡萄糖生物传感器。该专利在铂电极表面沉积钯颗粒，再将钯纳米颗粒修饰的铂电极在葡萄糖氧化酶、牛血清白蛋白和单壁碳纳米管溶液形成的酶溶液中蘸取，从而得到葡萄糖生物传感器。
5.中国专利cn108490055a公开一种基于氧化石墨烯的高生物相容性葡萄糖生物传感器及其制备方法，包括以下步骤：将铂电极放入无水乙醇中进行超声清洗，取出放入真空干燥箱中晾干，备用；将铂电极交替浸入pani工作液和go溶液中，每次取出后用蒸馏水清洗，重复多次，干燥后即得到pt/(pani/go)n电极；将pt/(pani/go)n电极浸入至gox溶液中，取出后用蒸馏水清洗，干燥后得到pt/(pani/go)n/gox电极，即得。该专利采用聚苯胺与氧化石墨烯修饰铂电极。
6.中国专利cn105866226a公开一种葡萄糖氧化酶生物传感器的制备及使用方法，碳毡电极检测端表面固定葡萄糖氧化酶与有机染料的混合物，制成葡萄糖氧化酶生物传感器。该专利利用物理吸附，以碳毡为基体电极，采用有机染料修饰葡萄糖氧化酶生物传感器，用于对葡萄糖进行定量分析。
7.目前还未发现由氧化石墨烯与谷胱甘肽共同制备生物传感器的有关报道。


技术实现要素：

8.本发明的目的是提供一种基于谷胱甘肽组装的葡萄糖生物传感器的构建方法，将
谷胱甘肽和羧基化石墨烯、葡萄糖氧化酶固定在金电极表面，增加了传感器的稳定性，重现性好，寿命长。
9.本发明所述的基于谷胱甘肽组装的葡萄糖生物传感器的构建方法，以谷胱甘肽修饰的金电极为载体，羧基化石墨烯活化后将其负载在谷胱甘肽修饰的金电极表面，得到羧基化石墨烯/谷胱甘肽修饰的金电极，再将羧基化石墨烯/谷胱甘肽修饰的金电极于交联剂中浸泡，晾干，得到基于谷胱甘肽组装的葡萄糖生物传感器。
10.其中：
11.所述的交联剂为含有葡萄糖氧化酶、过氧化氢酶、1
‑
(3
‑
二甲氨基丙基)
‑3‑
乙基碳二亚胺、4
‑
二甲氨基吡啶(dmap)的磷酸盐缓冲溶液。交联剂中edc是碳二亚胺系列化合物中的活性较高，能够作为偶联剂使用；dmap分子中二甲氨基上氮原子携带的孤对电子与芳环发生共振而增加了吡啶环上氮原子的亲核性，使得dmap具有优良的催化性能。
12.所述的交联剂中葡萄糖氧化酶的浓度为6
‑
8g/l，过氧化氢酶的浓度为0.6
‑
0.8g/l，1
‑
(3
‑
二甲氨基丙基)
‑3‑
乙基碳二亚胺的质量百分浓度为0.03
‑
0.05wt.％，4
‑
二甲氨基吡啶的质量百分浓度为0.004
‑
0.006wt.％。
13.所述的磷酸盐缓冲溶液的ph值为6.8
‑
7.0，浓度为0.2
‑
0.25mol/l。
14.本发明所述的基于谷胱甘肽组装的葡萄糖生物传感器的构建方法，具体包括以下步骤：
15.(1)制备谷胱甘肽修饰的金电极
16.将金电极置于铁氰化钾溶液中，利用循环伏安法扫描至稳定，之后浸泡于谷胱甘肽溶液中，得到谷胱甘肽修饰的金电极；
17.(2)制备羧基化石墨烯
18.在浓硫酸中加入石墨粉、硝酸钾、高锰酸钾，升温反应，反应完毕再加入双氧水反应，得到氧化石墨烯；氧化石墨烯与氢氧化钠、溴乙酸反应，得到羧基化石墨烯；
19.(3)制备基于谷胱甘肽组装的葡萄糖生物传感器
20.步骤(2)得到的羧基化石墨烯活化后将其负载在步骤(1)得到的谷胱甘肽修饰的金电极表面，得到羧基化石墨烯/谷胱甘肽修饰的金电极，再将羧基化石墨烯/谷胱甘肽修饰的金电极于交联剂中浸泡，晾干，得到基于谷胱甘肽组装的葡萄糖生物传感器。
21.其中：
22.步骤(1)中，所述的金电极先采用平均粒度为0.05
‑
0.06μm的al2o3粉进行抛光，再置于铁氰化钾溶液中；所述的铁氰化钾溶液的浓度为2.5
×
10
‑3‑
3.0
×
10
‑3mol/l，铁氰化钾溶液中含有氯化钾，氯化钾的浓度为5.0
‑
5.5mol/l。
23.步骤(1)中，所述的谷胱甘肽溶液是将谷胱甘肽溶于ph值为6.8
‑
7.0的磷酸盐缓冲溶液中制得；谷胱甘肽溶液的浓度为0.04
‑
0.06mol/l；浸泡温度为4
‑
6℃，浸泡时间为22
‑
26h。
24.步骤(2)中，所述的石墨粉、硝酸钾、高锰酸钾、浓硫酸、双氧水的用量比为1.0
‑
1.2:0.6
‑
0.8:3.0
‑
3.5:23
‑
25:5
‑
7，其中石墨粉、硝酸钾、高锰酸钾、双氧水以g计，浓硫酸以ml计，双氧水的质量百分浓度为30
‑
35wt.％；氧化石墨烯、氢氧化钠、溴乙酸的质量比为0.1
‑
0.3:5
‑
7:4
‑
6。
25.步骤(2)中，所述的升温反应为先于15
‑
20℃下反应2
‑
3h，再升温至35
‑
40℃下反应
30
‑
35min。
26.步骤(3)中，采用1
‑
(3
‑
二甲氨基丙基)
‑3‑
乙基碳二亚胺与4
‑
二甲氨基吡啶的混合溶液对羧基化石墨烯进行活化，混合溶液中1
‑
(3
‑
二甲氨基丙基)
‑3‑
乙基碳二亚胺的质量百分浓度为0.03
‑
0.05wt.％，4
‑
二甲氨基吡啶的质量百分浓度为0.004
‑
0.006wt.％；活化时间为20
‑
30min；浸泡温度为4
‑
6℃，浸泡时间为22
‑
26h。
27.本发明基于谷胱甘肽组装的葡萄糖生物传感器，以谷胱甘肽修饰的金电极为载体，羧基化石墨烯活化后将其负载在谷胱甘肽修饰的金电极表面，得到羧基化石墨烯/谷胱甘肽修饰的金电极，再将羧基化石墨烯/谷胱甘肽修饰的金电极于交联剂中浸泡，晾干，得到基于谷胱甘肽组装的葡萄糖生物传感器，其制备流程如下：
28.[0029][0030]
本发明基于谷胱甘肽组装的葡萄糖生物传感器的工作原理为：葡萄糖氧化酶(gox)是同型二聚体分子，含有两个黄素腺嘌呤二核苷酸(fad)结合位点。葡萄糖生物传感器在催化葡萄糖过程中葡萄糖和葡萄糖氧化酶接触，葡萄糖氧化酶作为受氢体在有氧条件下能专一性地催化β
‑
d
‑
葡萄糖生成葡萄糖酸和过氧化氢，见公式(1)，在过氧化氢酶(catalase)存在下，过氧化氢会继续生成氧气和水，见公式(2)，把公式(1)和公式(2)合并可以得公式(3),每氧化1mol葡萄糖消耗1/2mol氧生成葡萄糖酸。修饰电极的循环伏安测量结果表明，葡萄糖产生了直接的电子传递，葡萄糖与氧气发生化学反应转移的电子数目可通过电流大小来检测，电化学葡萄糖生物传感器输出的电信号与葡萄糖的浓度成正比。反应公式如下：
[0031][0032]
[0033][0034]
本发明基于谷胱甘肽组装的葡萄糖生物传感器的测试方法为：采用三电极系统，本发明的葡萄糖生物传感器为工作电极，饱和甘汞电极为参比电极，铂电极为辅助电极，将三电极置于不同浓度的葡萄糖溶液中，分别在不同的ph条件下，用循环伏安法进行扫描。在合适的电位范畴内以一定的扫描速率进行循环扫描，并记录循环伏安曲线。
[0035]
本发明的有益效果如下：
[0036]
本发明将金电极与谷胱甘肽结构中的巯基通过自组装技术生成金硫键，得到的谷胱甘肽修饰的金电极(化合物1)；先采用1
‑
(3
‑
二甲氨基丙基)
‑3‑
乙基碳二亚胺(edc)与4
‑
二甲氨基吡啶(dmap)的混合溶液对羧基化石墨烯进行活化，羧基化石墨烯的羧基中羰基的氧诱导作用吸电子，使羧基中
‑
oh氧电负性减弱对h原子的束缚能力，羧基化石墨烯中的羧基
‑
cooh可以与edc发生反应，羧基去h

，c＝n
‑
得h

，生成o
‑
酰基异硫脲中间体(化合物2)，引入酯基活化羧基，实现羧基化石墨烯的活化；再将羧基化石墨烯的活化溶液滴在谷胱甘肽修饰的金电极的表面后，在dmap的催化条件下，o
‑
酰基异硫脲中间体(化合物2)能够与谷胱甘肽修饰的金电极(化合物1)结构中的羧基
‑
nh2发生反应生成酰胺，得到羧基化石墨烯/谷胱甘肽修饰的金电极。最后将羧基化石墨烯/谷胱甘肽修饰的金电极于含有葡萄糖氧化酶、过氧化氢酶、1
‑
(3
‑
二甲氨基丙基)
‑3‑
乙基碳二亚胺(edc)、4
‑
二甲氨基吡啶(dmap)的交联剂中浸泡，1
‑
(3
‑
二甲氨基丙基)
‑3‑
乙基碳二亚胺(edc)能够将羧基化石墨烯/谷胱甘肽修饰的金电极上的两个羧基活化，生成带有酯基结构的羧基化石墨烯/谷胱甘肽修饰的金电极，在dmap的催化条件下，该酯基结构断裂，分别与葡萄糖氧化酶、过氧化氢酶的
‑
nh2发生反应生成酰胺，从而将葡萄糖氧化酶、过氧化氢酶修饰到羧基化石墨烯/谷胱甘肽修饰的金电极上，得到基于谷胱甘肽组装的葡萄糖生物传感器。
[0037]
本发明得到基于谷胱甘肽组装的葡萄糖生物传感器对称性较好，由于金硫键位于葡萄糖生物传感器分子式的中部，一侧的氨基与羧基化石墨烯结合，葡萄糖氧化酶、过氧化氢酶分别修饰到金电极的两侧，形成了以金硫键为对称轴的大分子结构，稳定性好。另外本发明的金硫键的左右两侧均紧连接着一个酰胺键，酰胺键的存在进一步促进了金硫键的结构稳定性。本发明葡萄糖生物传感器独特的结构，使得传感器的稳定性与重现性好，增加了葡萄糖生物传感器的寿命。
[0038]
本发明成功组装了谷胱甘肽
‑
羧基化石墨烯自组装的葡萄糖生物传感器。利用谷胱甘肽和羧基化石墨烯来固定葡萄糖氧化酶，构建灵敏度高、选择性好、重现性及稳定性好的葡萄糖生物传感器。由于羧基化石墨烯的存在，可以促进葡萄糖氧化酶活性中心的电子转移，增强酶的催化活性，使得葡萄糖氧化酶的活性中心表现出很好的直接电化学行为，而且对葡萄糖的氧化有良好的催化作用。
附图说明
[0039]
图1是本发明实施例1中羧基化石墨烯的红外谱图；
[0040]
图2是裸金电极、谷胱甘肽修饰的金电极、谷胱甘肽及羧基化石墨烯修饰的金电极、基于谷胱甘肽组装的葡萄糖生物传感器的循环伏安扫描图；
[0041]
其中：a：基于谷胱甘肽组装的葡萄糖生物传感器、b：谷胱甘肽及羧基化石墨烯修
饰的金电极、c：谷胱甘肽修饰的金电极、d：裸金电极；
[0042]
图3是基于谷胱甘肽组装的葡萄糖生物传感器在不同ph值磷酸盐缓冲溶液中的循环伏安图；
[0043]
图4是不同扫描速率对葡萄糖溶液的循环伏安曲线；
[0044]
其中：a：0.1v/s、b：0.08v/s、c：0.06v/s、d：0.04v/s、e：0.02v/s；
[0045]
图5是基于谷胱甘肽组装的葡萄糖生物传感器的扫描速率的平方根与电流的线性关系图。
具体实施方式
[0046]
以下结合实施例对本发明做进一步描述。
[0047]
实施例1
[0048]
(1)制备谷胱甘肽修饰的金电极
[0049]
将直径为1.0mm的金电极用0.05μm al2o3粉抛光至镜面，用蒸馏水淋洗后，用超声清洗仪清洗10min，自取出然晾干，并用75％酒精进行超声清洗10min。利用循环伏安法(cv)在2.5
×
10
‑3mol/l的铁氰化钾溶液(含5.0mol/l kcl)中扫描至稳定，电位差在100mv内。
[0050]
称取0.7683g谷胱甘肽溶于ph值为7.00的磷酸盐缓冲溶液中，制成50ml浓度为0.05mol/l的谷胱甘肽溶液，将磨好的金电极悬浮浸泡在0.05mol/l谷胱甘肽溶液中，4℃下浸泡24h，于4℃的冰箱中保存备用。
[0051]
(2)制备羧基化石墨烯
[0052]
在冰水浴中装配好250ml的反应瓶，轻轻倒入23ml浓硫酸；搅拌下加入0.6g硝酸钾和1.0g石墨粉的固体混合物，再加入3.0g高锰酸钾；控制温度小于20℃，搅拌反应2h；然后升温到35℃，继续搅拌30min；加入46ml去离子水，继续搅拌20min后，加入5g双氧水(30wt.％)将残余的氧化剂还原掉，溶液呈棕黄色，冒出红烟；趁热过滤，并用5wt.％hcl和去离子水洗涤，直至滤液中无法检测出硫酸根为止；最后将固体放在60℃的干燥箱中充分干燥，得到的氧化石墨烯，保存备用；
[0053]
将制得的氧化石墨烯取200mg超声分散在100ml水溶液中，加入5.0g溴乙酸和6.0g氢氧化钠超声反应3h，经离心、洗涤至中性，在干燥箱中烘干得到羧基化石墨烯。取少量羧基化石墨烯在红外干燥仪中进行干燥。干燥后，与溴化钾以1:200的比例压片，用红外分光光度计对羧基化石墨烯进行红外表征，谱图见图1，图中谱线上3177.81cm
‑1处有强吸收且峰宽较强，为羧基(
‑
cooh)的吸收峰，在1730.43cm
‑1处为羰基(
‑
c＝o)的伸缩振动，1621.72cm
‑1处为无共轭的c＝c双键振动峰，1220.64cm
‑1处为醚(c
‑
o)键振动峰，证明生成的物质是羧基化石墨烯。
[0054]
(3)制备基于谷胱甘肽组装的葡萄糖生物传感器
[0055]
将葡萄糖氧化酶、过氧化氢酶、1
‑
(3
‑
二甲氨基丙基)
‑3‑
乙基碳二亚胺(edc)、4
‑
二甲氨基吡啶(dmap)溶于10ml磷酸盐缓冲溶液(ph7.00，0.2mol/l，新配制)中，得到含有6g/l葡萄糖氧化酶、0.6g/l过氧化氢酶、0.03wt.％edc、0.004wt.％dmap、缓冲溶液ph值为7.00的交联剂，并将制得的交联剂放在冰箱中备用。
[0056]
称取0.0250g的羧基化石墨烯溶解在50ml的蒸馏水中，超声10min，制成浓度为0.05mg/ml的羧基化石墨烯溶液，加入含有0.03wt.％edc、0.004wt.％dmap的混合溶液进行
活化30分钟，用移液枪移取10μl将该羧基化石墨烯的活化溶液滴加在谷胱甘肽修饰的金电极表面，自然晾干，得到羧基化石墨烯/谷胱甘肽修饰的金电极，放到冰箱中备用。
[0057]
将羧基化石墨烯/谷胱甘肽修饰的金电极用蒸馏水淋洗后，在配制的交联剂中浸泡24h(4℃)，自然晾干，即制得基于谷胱甘肽组装的葡萄糖生物传感器。
[0058]
实施例2
[0059]
(1)制备谷胱甘肽修饰的金电极
[0060]
将直径为1.0mm的金电极用0.06μm al2o3粉抛光至镜面，用蒸馏水淋洗后，用超声清洗仪清洗10min，自取出然晾干，并用75％酒精进行超声清洗10min。利用循环伏安法(cv)在3.0
×
10
‑3mol/l的铁氰化钾溶液(含5.5mol/l kcl)中扫描至稳定，电位差在100mv内。
[0061]
称取0.9220g谷胱甘肽溶于ph值为7.00的磷酸盐缓冲溶液中，制成50ml浓度为0.06mol/l的谷胱甘肽溶液，将磨好的金电极悬浮浸泡在0.06mol/l谷胱甘肽溶液中，4℃下浸泡20h，于4℃的冰箱中保存备用。
[0062]
(2)制备羧基化石墨烯
[0063]
在冰水浴中装配好250ml的反应瓶，轻轻倒入25ml浓硫酸；搅拌下加入0.8g硝酸钾和1.2g石墨粉的固体混合物，再加入3.5g高锰酸钾；控制温度小于15℃，搅拌反应2.5h；然后升温到40℃，继续搅拌35min；加入50ml去离子水，继续搅拌20min后，加入6g双氧水(35wt.％)将残余的氧化剂还原掉，溶液呈棕黄色，冒出红烟；趁热过滤，并用5wt.％hcl和去离子水洗涤，直至滤液中无法检测出硫酸根为止；最后将固体放在60℃的干燥箱中充分干燥，得到的氧化石墨烯，保存备用；
[0064]
将制得的氧化石墨烯取300mg超声分散在150ml水溶液中，加入6.0g溴乙酸和7.0g氢氧化钠超声反应3h，经离心、洗涤至中性，在干燥箱中烘干得到羧基化石墨烯。
[0065]
(3)制备基于谷胱甘肽组装的葡萄糖生物传感器
[0066]
将葡萄糖氧化酶、过氧化氢酶、1
‑
(3
‑
二甲氨基丙基)
‑3‑
乙基碳二亚胺(edc)、4
‑
二甲氨基吡啶(dmap)溶于10ml磷酸盐缓冲溶液(ph7.00，0.25mol/l，新配制)中，得到含有8g/l葡萄糖氧化酶、0.8g/l过氧化氢酶、0.05wt.％edc、0.006wt.％dmap、缓冲溶液ph值为7.00的交联剂，并将制得的交联剂放在冰箱中备用。
[0067]
称取0.0250g的羧基化石墨烯溶解在50ml的蒸馏水中，超声10min，制成浓度为0.05mg/ml的羧基化石墨烯溶液，加入含有0.05wt.％edc、0.006wt.％dmap的混合溶液进行活化25分钟，用移液枪移取10μl将该羧基化石墨烯的活化溶液滴加在谷胱甘肽修饰的金电极表面，自然晾干，得到羧基化石墨烯/谷胱甘肽修饰的金电极，放到冰箱中备用。
[0068]
将羧基化石墨烯/谷胱甘肽修饰的金电极用蒸馏水淋洗后，在配制的交联剂中浸泡22h(6℃)，自然晾干，即制得基于谷胱甘肽组装的葡萄糖生物传感器。
[0069]
实施例3
[0070]
(1)制备谷胱甘肽修饰的金电极
[0071]
将直径为1.0mm的金电极用0.05μm al2o3粉抛光至镜面，用蒸馏水淋洗后，用超声清洗仪清洗10min，自取出然晾干，并用75％酒精进行超声清洗10min。利用循环伏安法(cv)在2.8
×
10
‑3mol/l的铁氰化钾溶液(含5.2mol/l kcl)中扫描至稳定，电位差在100mv内。
[0072]
称取0.6146g谷胱甘肽溶于ph值为7.00的磷酸盐缓冲溶液中，制成50ml浓度为0.04mol/l的谷胱甘肽溶液，将磨好的金电极悬浮浸泡在0.04mol/l谷胱甘肽溶液中，5℃下
浸泡24h，于4℃的冰箱中保存备用。
[0073]
(2)制备羧基化石墨烯
[0074]
在冰水浴中装配好250ml的反应瓶，轻轻倒入24ml浓硫酸；搅拌下加入0.7g硝酸钾和1.1g石墨粉的固体混合物，再加入3.2g高锰酸钾；控制温度小于15℃，搅拌反应2h；然后升温到38℃，继续搅拌40min；加入50ml去离子水，继续搅拌20min后，加入5g双氧水(35wt.％)将残余的氧化剂还原掉，溶液呈棕黄色，冒出红烟；趁热过滤，并用5wt.％hcl和去离子水洗涤，直至滤液中无法检测出硫酸根为止；最后将固体放在60℃的干燥箱中充分干燥，得到的氧化石墨烯，保存备用；
[0075]
将制得的氧化石墨烯取200mg超声分散在150ml水溶液中，加入5.0g溴乙酸和6.0g氢氧化钠超声反应3h，经离心、洗涤至中性，在干燥箱中烘干得到羧基化石墨烯。
[0076]
(3)制备基于谷胱甘肽组装的葡萄糖生物传感器
[0077]
将葡萄糖氧化酶、过氧化氢酶、1
‑
(3
‑
二甲氨基丙基)
‑3‑
乙基碳二亚胺(edc)、4
‑
二甲氨基吡啶(dmap)溶于10ml磷酸盐缓冲溶液(ph7.00，0.20mol/l，新配制)中，得到含有7g/l葡萄糖氧化酶、0.7g/l过氧化氢酶、0.04wt.％edc、0.005wt.％dmap、缓冲溶液ph值为7.00的交联剂，并将制得的交联剂放在冰箱中备用。
[0078]
称取0.0250g的羧基化石墨烯溶解在50ml的蒸馏水中，超声10min，制成浓度为0.05mg/ml的羧基化石墨烯溶液，加入含有0.04wt.％edc、0.005wt.％dmap的混合溶液进行活化20分钟，用移液枪移取10μl将该羧基化石墨烯的活化溶液滴加在谷胱甘肽修饰的金电极表面，自然晾干，得到羧基化石墨烯/谷胱甘肽修饰的金电极，放到冰箱中备用。
[0079]
将羧基化石墨烯/谷胱甘肽修饰的金电极用蒸馏水淋洗后，在配制的交联剂中浸泡26h(4℃)，自然晾干，即制得基于谷胱甘肽组装的葡萄糖生物传感器。
[0080]
本发明分别以实施例1中的裸金电极、谷胱甘肽修饰的金电极、谷胱甘肽及羧基化石墨烯修饰的金电极、基于谷胱甘肽组装的葡萄糖生物传感器作为工作电极，铂电极为辅助电极、饱和甘汞电极为参比电极，在2.5
×
10
‑3mol/l铁氰化钾(含10mmol/lkcl)中，进行循环伏安扫描实验，结果如图2所示。从图中可以看出c比d峰电流小，说明该裸金电极经谷胱甘肽修饰后，电位差变化大，电流响应变小，这表明谷胱甘肽已经成功修饰至金电极表面，而谷胱甘肽阻碍了电子的转移。而曲线b与c比较可看出，电极的电位差变大，电极的可逆性增加，氧化峰的电流响应明显增加，说明羧基化石墨烯的修饰促进了电子的转移。而从a曲线的趋势可以看出，酶电极的氧化还原峰的电流响应呈明显增大的趋势，说明谷胱甘肽
‑
羧基化石墨烯
‑
酶的修饰促进了电子的转移，提高了电极的灵敏度。
[0081]
本发明对实施例1中的基于谷胱甘肽组装的葡萄糖生物传感器的使用条件作出了以下研究：
[0082]
(1)缓冲溶液的ph值对葡萄糖生物传感器的影响
[0083]
葡糖糖氧化酶的电化学过程有质子参与，所以考察0.2mol/l磷酸盐缓冲溶液(pbs溶液)的ph值对葡萄糖氧化酶电化学行为的影响。本发明的葡萄糖生物传感器在不同ph值pbs溶液中的循环伏安图如图3所示。由图可见，在ph值在5.0～8.0范围内，葡萄糖氧化酶均能得到较好的电化学响应。扫描速率在100mv/s时，pbs溶液ph值在5.00～8.00的范围内，随着ph值的增加，氧化还原峰电流逐渐降低，峰电位逐渐负移，这是因为随着ph值的增加，h

浓度降低，不利于电化学反应的进行。葡萄糖氧化酶一般在中性条件下检测，故试验在ph＝
7.00的pbs介质中测定葡萄糖。
[0084]
(2)葡萄糖在修饰电极上的电流与扫描速率的关系
[0085]
在0.20mol/l、ph＝7.00的磷酸盐缓冲溶液(pbs溶液)中以本发明的葡萄糖生物传感器为工作电极，在
‑
0.20～1.0v电位窗口内以0.1v/s扫描速率对浓度为1.0mmol/l葡萄糖溶液进行cv测试，得到的其循环伏安曲线见图4。图中可见，在该电位窗口内酶修饰电极有氧化峰，ep＝0.505v。在扫描速率为0.02～0.1v/s范围内作cv测试，其氧化峰电位ep随扫描速率增加发生正移，氧化峰电流ip随扫描速率的增加呈增加趋势，并且在0.02～0.1v/s范围内氧化峰电流ip与扫描速率平方根呈良好的线性关系见图5，线性拟合方程为ip(μa)＝0.0954 1.6749v
1/2
，r＝0.9991。结果表示，本发明酶修饰后的电极在葡萄糖溶液里的伏安行为是受扩散控制的电极过程，说明葡萄糖没有被吸附在电极上，电极经长时间扫描后其循环伏安图无变化，说明电极不受污染，并可用于体外葡萄糖的检测。
[0086]
本发明还对实施例1中的基于谷胱甘肽组装的葡萄糖生物传感器的方法学进行了以下研究：
[0087]
(1)校正曲线的绘制
[0088]
将本发明的葡萄糖生物传感器分别置在浓度为1.0
×
10
‑3mol/l、3.0
×
10
‑3mol/l、5.0
×
10
‑3mol/l、8.0
×
10
‑3mol/l、1.0
×
10
‑2mol/l的葡萄糖溶液中，在
‑
0.20～1.0v电位窗口内以0.1v/s扫描速率用循环伏安法进行扫描，得到的电流随着葡萄糖浓度的增大而减小，线性方程为i＝2.3611
‑
0.1544c，相关系数r为0.9995，表明葡萄糖浓度在1.0
×
10
‑3mol/l～1
×
10
‑2mol/l的范围内有良好的线性关系。
[0089]
(2)精密度的测定
[0090]
将本发明的葡萄糖生物传感器连续测定浓度为1.0
×
10
‑3mol/l的葡萄糖溶液，结果分别为0.3970μa、0.3998μa、0.3950μa、0.3990μa、0.3951μa，由以上数据计算rsd为0.22％，表明该葡萄糖生物传感器精密度良好。
[0091]
(3)稳定性的测定
[0092]
将本发明的葡萄糖生物传感器分别在1h、4h、8h、12h、24h置于浓度为1.0
×
10
‑3mol/l的葡萄糖溶液中进行检测，结果为2.098μa、2.016μa、1.901μa、1.949μa、1.978μa，峰电流基本不发生变化，由以上数据计算其rsd为7.43％，表明该葡萄糖生物传感器稳定性良好。
[0093]
本发明成功组装了谷胱甘肽
‑
羧基化石墨烯自组装的葡萄糖生物传感器。利用谷胱甘肽和羧基化石墨烯来固定葡萄糖氧化酶，构建灵敏度高、选择性好、重现性及稳定性好的葡萄糖生物传感器。由于羧基化石墨烯的存在，葡萄糖氧化酶的活性中心表现出很好的直接电化学行为，而且对葡萄糖的氧化有良好的催化作用。实验结果表明该组装可以很好的固定葡萄氧化酶，且羧基化石墨烯可以促进葡萄糖氧化酶活性中心的电子转移，增强酶的催化活性。研究葡萄糖在自组装膜修饰电极上的电化学催化行为，葡萄糖在酶修饰金电极上的可逆性明显增加。通过方法学考察，初步确定葡萄糖生物传感器线性响应范围为1.0
×
10
‑3mol/l～1
×
10
‑2mol/l，相关系数r为0.9995，稳定性较好。该葡萄糖生物传感器具有一定的应用前景，可为临床检验提供参考。
[0094]
本发明得到的葡萄糖生物传感器酶的修饰稳定性、重复稳定性和贮存稳定性较高、使用寿命延长，使之能在体外连续监测葡萄糖浓度，及时地为葡萄糖病人提供最佳胰岛
素治疗和代谢控制的有效信息，是减少糖尿病病人长期并发症的有效办法。本发明的葡萄糖生物传感器在食品分析，发酵控制，临床检验等方面发挥着重要作用。