高产生育三烯酚的重组解脂亚罗酵母、其构建方法及应用与流程

技术特征：
1.高产生育三烯酚的重组解脂亚罗酵母，其特征在于所述重组解脂亚罗酵母含有重组质粒，所述重组质粒含有生育三烯酚合成底物香叶基香叶基二磷酸(ggpp)积累的关键基因和经密码子优化的生育三烯酚合成基因，所述生育三烯酚合成底物香叶基香叶基二磷酸(ggpp)积累的关键基因为hmg1和crte，所述经密码子优化的生育三烯酚合成基因编码的蛋白质为2
‑
甲基
‑6‑
香叶基香叶基苯醌甲基转移酶、生育酚环化酶和γ
‑
生育酚甲基转移酶。2.根据权利要求1所述的重组解脂亚罗酵母，其特征在于所述2
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甲基
‑6‑
香叶基香叶基苯醌甲基转移酶来自核桃、花生、山嵛菜、木豆或卷柏；所述生育酚环化酶来自荠菜、山嵛菜、甘蓝、油菜、柑橘或石斛；所述γ
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生育酚甲基转移酶来自荠菜、山嵛菜、甘蓝和油菜。3.根据权利要求1所述的重组解脂亚罗酵母，其特征在于所述2
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甲基
‑6‑
香叶基香叶基苯醌甲基转移酶来自卷柏，其密码子优化序列如seq id no.1所示；所述生育酚环化酶来自石斛，序列如seq id no.2所示；所述γ
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生育酚甲基转移酶来自甘蓝，序列如seq id no.3所示。4.权利要求1或2所述的重组解脂亚罗酵母的构建方法，所述方法包括以下步骤：(1)构建含有hppd基因和hpt基因的解脂亚罗酵母工程菌获取并合成来源于油菜的hppd基因(brhppd)和来源于蓝藻的hpt基因(gahpt)序列，与载体ploxpura3loxp经酶切连接获得重组质粒ploxpura3loxp
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brhppd
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gahpt，将重组质粒酶切线性化后，采用酵母转化试剂盒方法转入解脂亚罗酵母工程菌polf中，获得重组菌株polf
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bhgh，所得重组菌株经通过菌落pcr验证正确；(2)构建含有2
‑
甲基
‑6‑
香叶基香叶基苯醌甲基转移酶基因的重组质粒获取并合成来源于核桃(jrmpbqmt)、花生(ahmpbqmt)、山嵛菜(esmpbqmt)、木豆(ccmpbqmt)和卷柏(smmpbqmt)的2
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甲基
‑6‑
香叶基香叶基苯醌甲基转移酶基因序列，分别以ndeⅰ/speⅰ为酶切位点双酶切载体ploxpura3loxp和所述2
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甲基
‑6‑
香叶基香叶基苯醌甲基转移酶基因，分别连接获得重组质粒ploxpura3loxp
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jrmpbqmt、ploxpura3loxp
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ahmpbqmt、ploxpura3loxp
‑
esmpbqmt、ploxpura3loxp
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ccmpbqmt和ploxpura3loxp
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smmpbqmt，将所得重组质粒用限制性酶smai酶切线性化，采用酵母转化试剂盒方法转入解脂亚罗酵母工程菌polf
‑
bhgh中，分别获得重组菌株1、2、3、4、5，所得重组菌株经通过菌落pcr验证正确；(3)构建含有生育酚环化酶基因的重组质粒获取并合成来源于荠菜(crtc)、山嵛菜(estc)、甘蓝(botc)、油菜(bntc)、柑橘(cctc)和石斛(dctc)的生育酚环化酶基因序列，分别以ndeⅰ/speⅰ为酶切位点双酶切载体ploxpura3loxp和所述生育酚环化酶基因，分别连接获得重组质粒ploxpura3loxp
‑
crtc、ploxpura3loxp
‑
estc、ploxpura3loxp
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botc、ploxpura3loxp
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bntc、ploxpura3loxp
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cctc和ploxpura3loxp
‑
dctc，所得重组质粒分别用限制性酶smai酶切线性化，通过酵母转化试剂盒方法分别转入步骤(1)得到的重组菌株1
‑
5中，获得重组菌株6、7、8、
…
、34、35，所得重组菌株经通过菌落pcr验证正确；(4)构建含有γ
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生育酚甲基转移酶基因的重组质粒获取并合成来源于荠菜(crγ
‑
tmt)、山嵛菜(esγ
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tmt)、甘蓝(boγ
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tmt)和油菜(bnγ
‑
tmt)的γ
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生育酚甲基转移酶基因序列，分别以ndeⅰ/speⅰ为酶切位点双酶切载体ploxpura3loxp和γ
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生育酚甲基转移酶基因，分别连接获得重组质粒ploxpura3loxp
‑
cr
γ
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tmt、ploxpura3loxp
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esγ
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tmt、ploxpura3loxp
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boγ
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tmt和ploxpura3loxp
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bnγ
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tmt，所得重组质粒分别用限制性酶smai酶切线性化，采用酵母转化试剂盒方法转入步骤(3)的重组菌株6
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35中，获得高产生育三烯酚的重组解脂亚罗酵母。5.权利要求3所述的重组解脂亚罗酵母的构建方法，所述方法包括以下步骤：(1)构建含有hppd基因和hpt基因的解脂亚罗酵母工程菌获取并合成来源于油菜的hppd基因(brhppd)和来源于蓝藻的hpt基因(gahpt)序列，与载体ploxpura3loxp经酶切连接获得重组质粒ploxpura3loxp
‑
brhppd
‑
gahpt，将重组质粒酶切线性化后，采用酵母转化试剂盒方法转入解脂亚罗酵母工程菌polf中，获得重组菌株polf
‑
bhgh，所得重组菌株经通过菌落pcr验证正确；(2)构建含有2
‑
甲基
‑6‑
香叶基香叶基苯醌甲基转移酶基因的重组质粒获取并合成来源于卷柏(smmpbqmt)的2
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甲基
‑6‑
香叶基香叶基苯醌甲基转移酶基因序列，以ndeⅰ/speⅰ为酶切位点双酶切载体ploxpura3loxp和所述2
‑
甲基
‑6‑
香叶基香叶基苯醌甲基转移酶基因，分别连接获得重组质粒ploxpura3loxp
‑
smmpbqmt，将所得重组质粒用限制性酶smai酶切线性化，采用酵母转化试剂盒方法转入解脂亚罗酵母工程菌polf
‑
bhgh中，获得重组菌株5，所得重组菌株经菌落pcr验证正确；(3)构建含有生育酚环化酶基因的重组菌株获取并合成来源于石斛(dctc)的生育酚环化酶基因序列，以ndeⅰ/speⅰ为酶切位点双酶切载体ploxpura3loxp和所述生育酚环化酶基因，连接获得重组质粒ploxpura3loxp
‑
dctc，所得重组质粒用限制性酶smai酶切线性化，通过酵母转化试剂盒方法分别转入步骤(2)得到的重组菌株5中，获得重组菌株35，所得重组菌株经菌落pcr验证正确；(4)构建含有γ
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生育酚甲基转移酶基因的重组菌株获取并合成来源于甘蓝(boγ
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tmt)的γ
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生育酚甲基转移酶基因序列，分别以ndeⅰ/speⅰ为酶切位点双酶切载体ploxpura3loxp和γ
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生育酚甲基转移酶基因，连接获得重组质粒ploxpura3loxp
‑
boγ
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tmt，所得重组质粒分别用限制性酶smai酶切线性化，采用酵母转化试剂盒方法转入步骤(2)的重组菌株35中，获得重组菌株38，所得重组菌株经菌落pcr验证正确；(5)构建过表达hmg1和crte基因的重组菌株获取并合成hmg1和crte基因序列，设计引物从解脂亚罗酵母工程菌po1f的基因组dna扩增目的片段，所得目的片段连接到载体pjn44的多酶切位点上，分别得到质粒pjn44
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hmg1和pjn44
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crte；所得质粒分别转入菌株38中，获得重组菌株40，所得重组菌株经菌落pcr验证正确；(6)目的基因的过表达将前述获得的目的基因brhppd，gahpt，smmpbqmt，dctc和boγ_tmt分别连接到载体pjn44的多酶切位点上，分别得到质粒pjn44
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brhppd，pjn44
‑
gahpt，pjn44
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smmpbqmt，pjn44
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dctc，和pjn44
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boγ_tmt；将获得的质粒通过酶切验证后转入步骤(5)的重组菌株40中，得到高产生育三烯酚的重组解脂亚罗酵母41(polf
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(mtt)

hc
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ura3)，所得重组菌株经菌落pcr验证正确。6.权利要求5所述的重组解脂亚罗酵母的构建方法，所述方法还包括步骤(7)去除ura3标记：
所得重组解脂亚罗酵母41(polf
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(mtt)

hc
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ura3)在sd
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leu培养基上培养，所述sd
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leu培养基上生长的单菌落是高产生育三烯酚的重组解脂亚罗酵母polf
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(mtt)

hc。7.根据权利要求中4
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6中任一项权利要求所述的方法，其特征在于所述菌落pcr验证的反应体系如下：反应体系：反应体系：pcr程序：8.权利要求1
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4中任一项权利要求所述的重组解脂亚罗酵母在生产生育三烯酚中的应用。9.权利要求5
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8中任一项权利要求所述的构建方法得到的重组解脂亚罗酵母在生产生育三烯酚中的应用。

技术总结
本发明提供高产生育三烯酚的重组解脂亚罗酵母，所述重组解脂亚罗酵母含有生育三烯酚合成底物香叶基香叶基二磷酸(GGPP)积累的关键基因和经密码子优化的生育三烯酚合成基因，所述经密码子优化的生育三烯酚合成基因编码的蛋白质为2


技术研发人员：孟永宏 苟元元 郭建琦 牛永洁 杨璐
受保护的技术使用者：西安海斯夫生物科技有限公司
技术研发日：2021.09.09
技术公布日：2021/12/3