紫外光激发荧光染料及其应用的制作方法

紫外光激发荧光染料及其应用
1.本发明是申请日为2020年03月18日、申请号为202010189742.9、发明创造名称为紫外光激发荧光染料及其应用的中国发明专利的分案申请。
技术领域
2.本发明涉及荧光染料，特别涉及紫外光激发荧光染料及其应用，特别是其在神经病理学、免疫学、病理学和蛋白质组学上的应用。


背景技术：

3.随着新的显微技术的发展和各种合成及天然荧光分子的出现，荧光显微技术已经成为细胞生物学的基础工具。荧光标记的目标分子或细胞器可以用来研究细胞的结构和功能。荧光染料可以作为示踪剂使用荧光显微镜对生物结构进行定位，使用荧光免疫方法对分析物进行定量，使用流式细胞仪对细胞进行分析，细胞物理状态的测定及其他应用。与其它类型吸收染料相比，荧光染料通常灵敏度高，并且其吸收波长与发射波长是不同，一般通过光学激发来检测荧光发射，在大部分生物学样品中具有较低的荧光背景，其固有的光学性质例如荧光极性，荧光寿命和激发态能量转移均是可以进行测定的。目前荧光染料广泛应用于对病人的生理学功能进行日常检查或疾病诊断过程，也可以同步监控暴露在环境中的有害化学物质例如毒素或致癌农药，或者空气、泥土或饮用水中的有害无机物质对工人的影响，确定药物疗效，扫描新化合物对特殊酶的促进或抑制作用，监控基因和转基因表达，以及一些其他生物学应用例如免疫酶联反应和蛋白质印迹法(western blots)。
4.在研究和诊断过程中，需要对有机化合物、生物化合物和生物分析物进行快速高效的检测或定量。特别需要提供一种用来检测少量核酸、多肽、药物、新陈代谢产物和微组织的方法。例如用于治疗目的需要对麻醉剂、中毒、药物情况进行了解，还需要了解激素、病理学微组织、病毒、抗体、酶和核酸等所反应出的疾病状态，光学方法检测(荧光发射，紫外吸收，比色法)用于监测和测量荧光，是一种传统并且高效的检测，这些方法可以通过直接观察或者仪器检测来定性或定量检测所需要的信息。
5.使用荧光染料作为示踪剂，一般需要将染料和生物活性配体如细胞、组织、蛋白、抗体、药物、酶、激素、核酸、多糖、脂类或者其他生物分子之间形成化学共价键或者将染料与自然或人工合成聚合物(载体分子)相连制成合成探针(荧光探针/染料
‑
偶联剂)，使用这些合成探针(荧光探针/染料
‑
偶联剂)，生物分子一般会发生生物化学变化，合成探针(荧光探针/染料
‑
偶联剂)可以对这种变化提供定性或定量检测。
6.紫外激发具有其固有的弱点，如会造成光漂白和会对标记物造成损害等，但是在多色荧光应用中，如免疫荧光，核酸，蛋白质组，原位杂交和神经追踪中，蓝色荧光探针可以与绿色、黄色、橙色和红色荧光探针(染料
‑
偶联剂)明显区分。
7.半导体激光器又称二极管，是以半导体材料为工作物质的一类激光器件，是成熟较早、进展较快的一类激光器，由于它的波长范围宽，制作简单、成本低、易于大量生产，并且由于其具有体积小、重量轻、寿命长等特点，因此，品种发展快、应用范围广和易于与各种
光电子器件实现电子集成，如405nm的激光器。目前，能被405nm激光激发的合适染料则屈指可数，如cascade blue，cascade yellow和pacific blue和pacific orange等。为了在生物学应用中减少聚集，大部分染料中均含有磺酸基团，虽然磺化可减少二聚体的形成和增加染料的水溶性，但也在生物分子中引入了负电荷，因此可能增加破坏标记生物分子的生物学活性的风险。
8.因此，目前仍然需要开发出可以被405nm激光激发的合适染料。而目前存在的紫外激光激发染料，在波长大约405nm时，一般吸收较弱(在最大吸光处的摩尔消光系数小于20000cm
‑1·
m
‑1)、量子产率较低和在水溶液环境中溶解度差。这些缺点限制了其在生物学领域的应用。cascade yellow是一个普通的紫外光激发的染料，然而，这种染料与载体分子或固相支撑物结合后，容易形成二聚体并且在水溶液体系中倾向于形成聚集，而已知具有宽光谱的染料在合适的紫外光激发下(典型的为515
‑
525nm)具有显著的荧光背景。另外，许多已知的染料在水溶液中会发生淬灭现象，从而导致荧光量子产率降低，将导致探测的灵敏度降低或者需要加大染料的用量等缺点。
9.综上所述，迫切需要开发出具有适用于紫外光激光器(例如405nm激光器)且具有活性基团的荧光染料。这种染料需要具有很好的水溶性、显著降低对生物活性的影响和在较短波长内具有较高的荧光信号的特点。


技术实现要素：

10.鉴于上述所述，本发明公开了一类紫外光激发荧光染料及其应用。本技术的紫外光激发荧光染料具有水溶性好、能显著降低对生物活性的影响和在较短波长内具有较高的荧光信号等优点。
11.本发明要解决的技术问题之一是提供一类新型化合物(即通式ⅰ化合物)，此化合物可作为紫外光激发荧光染料，此荧光染料同时包含水溶性聚合物和活性基团；
12.本发明要解决的技术问题之二是提供制备“荧光染料
‑
偶联物”的方法；
13.本发明要解决的技术问题之三提供此种荧光染料及“荧光染料
‑
偶联物”的应用。
14.为达到上述目的，本发明采用如下技术方案：
15.紫外光激发荧光染料，具有通式ⅰ的结构：
[0016][0017]
式ⅰ中：
[0018]
x、y和z各自独立选自：c、cr1、n、nr3、s、o、se、p、si，as、c
‑
c、cr1‑
cr2、nr3‑
nr4、s
‑
s,此处，x、y和z中至少一个不是c或c
‑
c；
[0019]
w为n或c；
[0020]
r1、r2、r3、r4、r5、r6、r7、r9和r
10
各自独立选自：h、c1‑8烷基、c1‑8取代烷基、c1‑8烷氧基、羟基、磺酸基、s、卤素、氨基、取代氨基、醛基、羧基、酯基、叠氮基、亚硝基、氰基、硫醚基、c5‑7环、c5‑7含杂环、取代的c5‑7环、取代的c5‑7含杂环、活性基团或水溶性聚合物基团，或者
r1、r2、r3、r4、r5、r6、r7、r9和r
10
中的r1与r2、r3与r4、r5与r6和r9与r
10
分别连接形成饱和或者不饱和的五元环、六元环或七元环；
[0021]
r8为h、c1‑8烷基、c1‑8取代烷基、c5‑7环、c5‑7含杂环、取代的c5‑7环、取代的c5‑7含杂环、活性基团或水溶性聚合物基团，或者与r7连接形成饱和或者不饱和的五元环、六元环或七元环；
[0022]
r1‑
r4各自独立选自：h、c1‑8烷基、c1‑8取代烷基、c1‑8烷氧基、羟基、磺酸基、卤素、氨基、取代氨基、醛基、羧基、酯基、叠氮基、硝基、亚硝基、氰基或硫醚基；
[0023]
在r1、r2、r3、r4、r5、r6、r7、r8、r9和r
10
中，存在至少一个活性基团和至少一个水溶性聚合物基团。
[0024]
依照本发明的一个方面，x为c或cr1，其中，r1为磺酸基；y为n；z为o或s；w为n；r1、r2、r5、r6、r7、r9和r
10
全部为h；r3、r4、r8互相独立选自：磺酸基、活性基团或水溶性聚合物。
[0025]
依照本发明的一个方面，所述活性基团包括：丙烯酰胺、羧酸的活化酯、羧酸酯、酰基叠氮、酰基氰、醛、卤素取代芳环、酸酐、氨基、叠氮、氮杂环丙烷、硼化物、重氮烷、卤代乙酰胺、卤代烷、卤代三嗪、肼、亚胺酯、异氰酸、异硫氰酸、马来酰亚胺、亚磷酰胺、活性钯络合物、卤代硅烷、酰卤或硫醇、四氟苯酚酯、炔烃。
[0026]
依照本发明的一个方面，所述水溶性聚合物包括：聚环氧乙烷、糖类、多肽、聚乙二醇。
[0027]
依照本发明的一个方面，所述活性基团为包含羧酸的丁二酰亚胺酯、肼、氨基或马来酰亚胺，所述水溶性聚合物为离散型聚乙二醇，所述离散型聚乙二醇的分子量在300
‑
3000之间。
[0028]
依照本发明的一个方面，一种紫外光激发荧光染料与载体分子制备染料
‑
偶联物的方法，包括以下步骤：
[0029]
将载体分子与所述的通式ⅰ化合物接触形成结合样品；
[0030]
将结合样品孵化一定时间使得所述的通式ⅰ化合物与载体分子之间形成共价键，获得染料
‑
偶联物的混合物；
[0031]
将染料
‑
偶联物的混合物中未连接载体分子的化合物和已连接在载体分子的化合物进行分离，获得染料
‑
偶联物。
[0032]
依照本发明的一个方面，所述载体分子包括氨基酸、多肽、蛋白质、多糖、核苷酸、核苷、寡核苷酸、核酸、半抗原、补骨脂素、药物、激素、合成聚合物、聚合微粒、生物细胞或病毒。
[0033]
依照本发明的一个方面，所述的通式ⅰ化合物的至少一个活性基团将通式ⅰ化合物与载体分子进行连接。
[0034]
依照本发明的一个方面，所述载体分子包含核苷酸或多肽。
[0035]
依照本发明的一个方面，所述紫外光激发荧光染料应用于细胞的免疫检测分析。
[0036]
本发明的优点：
[0037]
(1)本发明公开的紫外光激发荧光染料，其吸收在300nm
‑
500nm之间并且具有较大的斯托克位移(stoke's shift),可以在特定环境下在紫外激光下激发而用于多色试验。本发明化合物母体基于cascade yellow荧光团，然而却比cascade yellow更亮、更稳定和在水中的溶解性更好。
[0038]
(2)本发明公开的紫外光激发荧光染料同时具有水溶性聚合物基团和活性基团，因此，具有生物标记所需特性，如分子内迁移率受限、荧光量子产率升高、聚集降低以及在非极性有机溶剂中的溶解度升高、淬灭减少和体内及体外稳定性增加等特性，因此，可将本发明的染料标记分子和生物分子，如多肽、核苷酸和/或金属螯合剂，适用于诊断、成像系统等各个领域。
[0039]
(3)本发明公开的紫外光激发荧光染料可以被405nm激光激发，由于染料聚集荧光淬灭的主要原因，本发明染料减少聚集可不用过量带负电荷的磺酸基团来实现，利用水溶性聚合物有助于减少染料上的负电荷，可显著降低聚集，是且具有很好的水溶性、显著降低对生物活性的影响和在较短波长内具有较高的荧光信号的效果。
[0040]
(4)本发明经标记的蛋白质(比如:经标记的抗体)应用于动物体(如哺乳动物体)时,在循环中可具有更长的半衰期，因此,可适用于体内成像；经标记的生物分子在体外系统中(例如在采用血清或其它生物提取物的测定中)也可显示出更长的半衰期。例如标记抗体在细胞染色中可具有更高的信噪比。
[0041]
本发明相较于专利us8158801：
[0042]
本发明公开的紫外光激发荧光染料同时具有活性基团和水溶性聚合物基团，专利us8158801中公开的荧光染料只具有活性基团，因此，本发明公开的紫外光激发荧光染料利用水溶性聚合物有助于减少染料上的负电荷，可显著降低聚集，具有更强的荧光强度、更加稳定和在水中溶解性更好的优点。
附图说明
[0043]
为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
[0044]
图1为化合物4的质谱图；
[0045]
图2为化合物5的质谱图；
[0046]
图3为化合物5的吸收和发射光谱图；
[0047]
图4为不同dol下，pacific orange
‑
gam的荧光强度与化合物6
‑
gam的荧光强度对比；
[0048]
图5为化合物6a显示的免疫分型图。
具体实施方式
[0049]
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
[0050]
在详细描述本发明之前，描述各种术语用来帮助理解：
[0051]
本技术中的术语“活性基团”指活性基团能够在载体分子上与底物或反应偶联体反应从而形成共价键的化学部分。本发明化合物可用于标记多种宽泛的载体分子。所述载
体分子含有合适的反应偶联体或其衍生物为含有合适的反应偶联体。在此，通常采用而非限制，化合物上的成键基团通常指活性基团，底物或载体分子上的成键基团通常指反应偶联体。“反应底物”、“底物”和“反应偶联体”在本技术文件中通篇可互换使用
[0052]
本技术中的术语“反应底物”，“底物”和“反应伴侣”通常可互换使用。术语“合成探针”、“荧光探针”和“染料
‑
偶联剂”可互换使用，都表示荧光染料与载体分子进行共价键连接，其实质是同一种物质。
[0053]
本技术中的术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”可互换使用，指任何长度的氨基酸聚合物，聚合物可以是线性、环状或支链的，其可包含修饰的氨基酸，也可被非氨基酸中断，还包括修饰的氨基酸聚合物，如通过磺化、糖基化、脂化、酰化、磷酸化、碘化、甲基化、氧化、蛋白水解加工、异戊烯化、外消旋化、硒化和转运rna介导氨基酸加入蛋白质，如精氨酰化、泛素化或任何其它操作，如与标记组分偶联。本文所用的术语“氨基酸”指天然或非天然或合成氨基酸，包括甘氨酸、甘氨酸d或l光学异构体、氨基酸类似物及肽模拟物。
[0054]
本技术中的术语“抗体”指免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫学活性部分，即含有特异性结合抗原(“与之免疫反应”)的抗原结合位点的分子。在结构上，最简单的天然产生抗体(例如igg)包含二硫键相互连接的4条多肽链，两条重链(h)和两条轻链(l)。免疫球蛋白包括几类分子，例如igd、igg、igm和ige的分子大家族，其实质是多肽或蛋白质，因此，本技术中的术语“免疫球蛋白分子”包括，例如杂交抗体或改变的抗体及其片段。现已证明天然产生抗体的片段可执行抗体的抗原结合功能。这些片段统称为“抗原结合单位”。根据分子结构可将抗原结合单位大致分为“单链(“sc”)和“非单链”(“nsc”)型。
[0055]
本文中所用的术语“核氨酸”、“多肽”、“抗体”可以互换。
[0056]
术语“抗体”还包括各种物种来源，包括无脊椎动物和脊椎动物的免疫球蛋白分子。应用于抗体或抗原结合单位的术语“人”指人基因表达的免疫球蛋白分子或其片段。应用于非人(例如，啮齿类或灵长类)抗体的术语“人源化”是含有衍生自非人免疫球蛋白的最少序列的杂交免疫球蛋白、免疫球蛋白链或其片段。人源化抗体的大部分是人免疫球蛋白(受者抗体)，其中受者的互补决定区(cdr)的残基被具有所需特异性、亲和力和性能的非人物种(供者抗体)，例如小鼠、大鼠、家兔或灵长类的cdr的残基替代。在一些情况中，人免疫球蛋白的fv框架区(fr)残基被相应的非人残基替代。此外，人源化抗体可包含即未在受者抗体，又未在输入cdr或框架区序列中的发现的残基。作这些修饰以进一步精制和优化抗体性能并最大程度降低引入人体时的免疫原型。人源化抗体通常包含基本上所有、至少一个、通常两个可变区，其中所有或基本上所有cdr区对用于非人免疫球蛋白的那些，所有或基本上所有fr区是人免疫球蛋白序列的那些。人源性抗体还可包含免疫球蛋白恒定区(fc)，通常是人免疫球蛋白的恒定区的至少一部分。
[0057]
就多肽
‑
抗体偶联物而言，本文的术语荧光“信噪比”指(偶联体的荧光信号，其中所述偶联体包括的多肽与一抗体结合，进而与本发明化合物标记的结合剂结合)/(多肽，同种型对照抗体和标记结合剂的混合物的荧光信号)之比。
[0058]
术语“标记程度”或“dol”指每个靶分子(包括但不限于多肽和寡核苷酸)连接的染料分子的数量。例如，每个多肽，例如抗体一个染料分子标示标记程度(dol)为1。如果平均多于一个染料分子与多肽，例如多肽，如抗体反应并与之偶联，标记程度大约1，还可以是除以整数以外的数值。dol的数值越高，标记程度越高。
[0059]
本发明中所述的紫外光激发荧光染料，具有通式ⅰ的结构：
[0060][0061]
通式ⅰ中，x、y和z各自独立选自：c、cr1、n、nr3、s、o、se、p、si，as、c
‑
c、cr1‑
cr2、nr3‑
nr4、s
‑
s,此处，x、y和z中至少一个不是c或c
‑
c；作为优选地，选自c、cr1、n、s、o；进一步优选，x优选为c或cr1，y优选为n，z优选为o或s，r1优选为磺酸基。其中，磺酸基可以是磺酸、磺酸胺或具有反应活性的磺酰胺。
[0062]
通式ⅰ中，w是n或c；优选为n。
[0063]
通式ⅰ中，r1、r2、r3、r4、r5、r6、r7、r9和r
10
各自独立选自：h、c1‑8烷基、c1‑8取代烷基、c1‑8烷氧基、羟基、磺酸基、s、卤素、氨基、取代氨基、醛基、羧基、酯基、叠氮基、亚硝基、氰基、硫醚基、c5‑7环、c5‑7含杂环、取代的c5‑7环、取代的c5‑7含杂环、活性基团或水溶性聚合物基团，或者r1、r2、r3、r4、r5、r6、r7、r9和r
10
中的r1与r2、r3与r4、r5与r6和r9与r
10
分别连接形成饱和或者不饱和的五元环、六元环或七元环；作为优选地，选自h、磺酸基、活性基团、水溶性聚合物基团；进一步优选，r1、r2、r5、r6、r7、r9和r
10
优选为h，r3和r4各自独立优选为磺酸基、活性基团或水溶性聚合物基团。其中，磺酸基可以是磺酸、磺酸胺或具有反应活性的磺酰胺。
[0064]
通式ⅰ中，r8为h、c1‑8烷基、c1‑8取代烷基、c5‑7环、c5‑7含杂环、取代的c5‑7环、取代的c5‑7含杂环、活性基团或水溶性聚合物基团，或者与r7连接形成饱和或者不饱和的五元环、六元环或七元环；作为优选地，选自磺酸基、活性基团、水溶性聚合物基团。其中，磺酸基可以是磺酸、磺酸胺或具有反应活性的磺酰胺。
[0065]
通式ⅰ中，r1‑
r4各自独立选自：h、c1‑8烷基、c1‑8取代烷基、c1‑8烷氧基、羟基、
‑
so3‑
、卤素、氨基、取代氨基、醛基、羧基、酯基、叠氮基、硝基、亚硝基、氰基或硫醚基；作为优选地，选为
‑
so3‑
。
[0066]
在r1、r2、r3、r4、r5、r6、r7、r8、r9和r
10
中，存在至少一个活性基团和至少一个水溶性聚合物基团。
[0067]
活性基团可以是丙烯酰胺、羧酸的活化酯、羧酸酯、酰基叠氮、酰基氰、醛、卤素取代芳环、酸酐、氨基、叠氮、氮杂环丙烷、硼化物、重氮烷、卤代乙酰胺、卤代烷、卤代三嗪、肼、亚胺酯、异氰酸、异硫氰酸、马来酰亚胺、亚磷酰胺、活性钯络合物、卤代硅烷、酰卤或硫醇、四氟苯酚酯或炔烃；作为优选地，活性基团为包含羧酸的丁二酰亚胺酯、肼、氨基或马来酰亚胺。
[0068]
水溶性聚合物基团可以是聚环氧乙烷、糖类、多肽、聚乙二醇；作为优选地，水溶性聚合物基团为分子量为300
‑
3000的离散型聚乙二醇。
[0069]
当上述优选条件的组合，所得到的通式ⅰ的化合物，是本发明中关于紫外光激发荧光染料的优选化合物。应理解，本发明包括上述各优选基团的任意组合，其组合可举例为，当x优选为c，y优选为n，z优选为o，w优选为n，r1、r2、r5、r6、r7、r9和r
10
优选为h，r3优选为水溶性聚合物基团，r4优选为磺酸基，r8优选为活性基团时，所获得的化合物视为本发明代表性的优选化合物，如下结构的化合物5、化合物6a、化合物6b、化合物6c和化合物7为该组合的
优选化合物五种。化合物6a、化合物6b和化合物6c都属于化合物5的衍生物，化合物5、化合物6a、化合物6b和化合物6c的区别是r8的活性基团不同。化合物5和化合物7的区别是r3的水溶性聚合物基团(聚乙二醇)的分子量不同，化合物5、化合物6a、化合物6b、化合物6c和化合物7的主体结构相同，所以，它们的吸收光谱和发射光谱基本一致。应当理解为该组合的优选化合物不限于此。如下为化合物5、化合物6a、化合物6b、化合物6c和化合物7的结构式：
[0070]
[0071][0072]
当x优选为c，y优选为n，z优选为s，w优选为n，r1、r2、r5、r6、r7、r9和r
10
优选为h，r3优选为水溶性聚合物基团，r4优选为磺酸基，r8优选为活性基团时，所获得的化合物视为本发明代表性的优选化合物，如下结构的化合物8为该组合的优选化合物的一种，化合物8的结构为：
[0073][0074]
活性基团
[0075]
本发明化合物包括至少一个为活性基团。反应活性基团及其反应偶联体可以分别是亲电体和亲核体，其能够与或不与偶联剂或催化剂形成共价键。例如，所述当进行紫外光活化或光解反应活性基团时其与烃分子反应的光活化活性基团，所述反应性基团为能够与共轭二烯烃经由第尔斯
‑
阿德反应(diels
‑
alder reaction)进行反应的亲双稀体、能够与
亲双稀体反应的1，3
‑
二烯、能够与叠氮官能团反应形成1，2，3
‑
三唑连接键的炔烃和能够与叠氮官能团经由所谓的staudinger反应形成酰胺连接键的2
‑
(二苯基膦基)苯甲酸甲酯。
[0076]
反应活性基团和载体分子上的反应偶联体/底物的共价连接键实例如下表1所示：
[0077]
表1活性基团与载体分子连接的共价键
[0078]
[0079][0080]
本领域所理解的活化酯通常具有式
‑
coω,其中ω为良好的离去基团，如琥珀酰亚胺基氧基(
‑
oc4h4o2)、磺基琥珀酰亚胺基氧基(
‑
oc4h3o2‑
so3h)或苯并三唑基
‑1‑
氧基(
‑
oc6h4n3)、芳基氧基或经吸电子取代基(如硝基、氟、氯、氰基、三氟甲基或其组合)取代一次或多次的芳基氧基和由碳二亚胺活化的羧酸，从而形成酸酐或混合酸酐
‑
ocora或
‑
ocnranhrb，其中ra和rb，可以是相同的或不同的独立为c1
‑
c6烷基、c1
‑
c6全氟烷基或c1
‑
c6烷氧基、环己基、3
‑
二甲基氨基丙基或n
‑
吗啉代乙基。
[0081]
酰基叠氮也可重排为异氰酸酯。
[0082]
反应活性基团可以是与胺、硫醇、羟基或醛反应的基团。反应活性基团可以是胺
‑
反应活性基团，如琥珀酰亚胺基酯(se)，或硫醇
‑
反应活性基团，如马来酰亚胺、卤代乙酰胺
或甲基硫代磺酸酯(methylthiosulfonate，mts)，醛
‑
反应活性基团，如胺、氨基氧基(aminooxy)或酰肼。
[0083]
水溶性聚合物
[0084]
本发明化合物还包括至少一个水溶性聚合物基团。根据本发明，水溶性聚合物基团可显著降低荧光基团核心结构的分子内移动性，以及由此可改善荧光基团的荧光量子产率。所述基团可赋予它们所连接的化合物其它特性，如荧光基团的耐光性改善，针对生物分子标记时荧光基团聚集减少，荧光标记的生物分子(如抗体)的染色特异性增加；和体内标记的生物分子(如抗体)的免疫原性和抗原性降低。
[0085]
各水溶性聚合物基团通常为足够大以改善化合物的荧光特性且基本上无反应活性的、水溶性部分。在该上下文中使用的术语“聚合物”不要求存在严格重复单元。就本发明的目的而言，具有足够分子大小和溶解性但不具有重复单元的分子就视为“水溶性聚合物基团”。
[0086]
水溶性聚合物基团包括但不限于有机聚合物和生物分子如多肽和碳水化合物。各水溶性聚合物可以是线性的、支链的、环状的或它们的组合。可以使用具有一条、二条、三条、四条或更多支链的水溶性聚合物。本发明化合物可包括任何数目的水溶性聚合物基团。一般而言，本发明化合物包括至少一个水溶性聚合物基团至约8个水溶性聚合物基团。在一个化合物中个水溶性聚合物基团的合适分子量，或可供选择的，所有水溶性聚合物基团的合适分子量可为约100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000、10000、15000、20000da或更大。在一个实施方案中，本发明的水溶性聚合物基团分子量在300和3000之间。
[0087]
在一实施方案中，本发明的水溶性聚合物为聚环氧烷。合适的聚环氧烷包括聚乙二醇(peg)、聚丙二醇(ppg)、聚乙二醇
‑
聚丙二醇(peg
‑
ppg)共聚物和含n上经取代的甲基丙烯酰胺的聚合物和共聚物。适用于本发明的各种聚环氧烷以及制备和使用所述聚环氧烷的方法描述在下列文献中：us637749；5650388；5298643；5605976；5567422；5681567；5321095；5349001；5405877；5234903；5478805；5324844；5612460；5756593；5686110；5880131；6824782；5808096；6013283；6251382。商业来源的聚环氧烷试剂包括sigma
‑
aldrich、nanocs、creative biochem、pierce、enzon、nektar和nippon oils and fats。聚环氧烷具有如下基本结构：
[0088][0089]
必要时聚环氧烷可经额外取代以赋予聚合物其它期望特性。所述修饰可包括例如：增加或降低聚合物的化学稳定性的化学连接键，这可允许调整聚合物的半衰期的化学或生物学稳定性。在一些情形下，聚环氧烷分子被各种基团端接或封端。所述基团的实例为羟基、烷基醚(如甲醚、乙醚、丙基醚)、羧基甲基醚、羟基乙基醚、苄基醚、二苄基亚甲基醚或二甲基胺。聚环氧烷可具有多个可能的端基中的一个，所述端基包括但不限于羟基、甲基醚、乙基醚、羧基甲基醚和羟基乙基醚。在一实施方案中，聚环氧烷为用据甲基醚端接的聚
乙二醇聚合物。这样的基团被成为m peg。m peg通常具有式
‑
(ch2ch2o)nch3,其中n为乙二醇的单元数目，并且由所述m peg的大小决定。
[0090]
其他合适的聚合物包括一下物质的衍生物和络合物：聚(2
‑
羟基乙基甲基丙烯酸酯)、聚羟基丙基甲基丙烯酰胺、聚(苯乙烯磺酸)、聚(乙烯醇)或聚(碘化2
‑
乙烯基
‑
n
‑
甲基吡啶鎓盐)。
[0091]
本发明的水溶性聚合物也可以为碳水化合物。所述碳水化合物包括单糖或多糖，且可以是例如，可溶淀粉、糖原、葡萄糖、果胶、甘露聚糖、半乳聚糖、羟甲基纤维素、羟乙基纤维素和其它纤维素衍生物。当水溶性聚合物是碳水化合物时，碳水化合物中存在至少30％的羟基可被掩蔽为甲基醚、磺酸根合烷基醚和/或乙酸酯。
[0092]
本发明的水溶性聚合物也可为为多肽。合适的多肽可包括例如，丝氨酸、精氨酸、含有修饰的ε
‑
氨基的多聚赖氨酸或半胱氨酸。所述多肽的其它实例在wo 2006/08249中有披露。预期的是所述多肽可用于作本发明的水溶性聚合物。
[0093]
本发明的水溶性聚合物还包括上述不同类型物质的组合。例如，这样的水溶性聚合物可以是与聚环氧烷连接的多肽。
[0094]
水溶性聚合物通常不包括能与本发明化合物中包括的一个或多个反应性基团的化学不相容的任何一种或多种基团。例如，若反应活性基团为亲电体，则水溶性聚合物不应包括强亲核体。在更具体的实例中，若反应活性基团为n
‑
羟基琥珀酰亚胺基酯，则水溶性聚合物不应包括伯胺或仲胺基团；当反应活性基团为马来酰亚胺时，水溶性聚合物不应包括巯基。同样的，若反应活性基团为亲核体，则水溶性聚合物基团中不应该包括强亲电体。然而，水溶性聚合物可包括最少数量的弱亲核体或做小数目的弱亲电体，从而在储存或处理期间反应活性基团的化学不受到显著影响，或本发明化合物的稳定性不受影响。弱亲核体的实例为羟基，其通常存在于碳水化合物中。由此，水溶性聚合物是碳水化合物时，碳水化合物中存在至少30％的羟基可被掩蔽为甲基醚、磺酸根合烷基醚和/或乙酸酯。
[0095]
载体分子
[0096]
在一个实施案例中，本发明染料与载体分子偶联。此处包括但不限于任何本发明所揭示化合物和任何在此处揭示的载体分子。典型的，本发明化合物含有活性基团与载体分子共价偶联。活性基团可以包含活性功能部分和一个连接部分或者仅仅是活性功能部分。本发明化合物可以应用于各种载体分子包括但不仅限于：氨基酸、多肽、蛋白质、多糖、核苷、核苷酸、寡核苷酸、核酸、抗原、类固醇、维生素、药物、代谢物、毒素、环境污染物、半抗原、脂素、药物、激素、脂质、脂质体、葡聚糖、合成聚合物、聚合微粒、生物细胞、病毒或者其组合形式。
[0097]
优先的载体分子为抗体或者部分抗体，抗原，亲和素，链酶亲和素，生物素，葡聚糖，igg结合蛋白，荧光蛋白，琼脂糖和非生物亲和颗粒。
[0098]
在某些情况下，载体分子可能包含载体分子活性基团，包括但不限于羟基，羰基，氨基，巯基，醛基，卤素，硝基，氰基，酰胺，脲，碳酸，氨基甲酸酯，异氰酸酯，砜，磺胺，亚砜等，用来与本发明化合物共价相连。常用的活性基团在上面已经有所表述用来与这些载体分子上的活性部分相连。
[0099]“染料
‑
偶联物”的制备
[0100]
一种本发明的紫外光激发荧光染料与载体分子或者固相支撑物偶联的方法，包括
如下步骤：
[0101]
(1)将载体分子或者固相支撑物与染料接触形成结合样品；
[0102]
(2)将结合样品孵化一定时间使得所述的通式ⅰ化合物与载体分子或者固相支撑物之间形成共价键，获得染料
‑
偶联物的混合物；
[0103]
(3)将染料
‑
偶联物的混合物中未连接载体分子或者固相支撑物的化合物和已连接在载体分子或者固相支撑物的化合物进行分离，获得染料
‑
偶联物。
[0104]
染料与载体分子或固相支撑物的偶联物，例如：药物，多肽，毒素，核酸，磷脂和其它通过有机合成方法制备的有机物与本发明活性染料形成偶联物。更加优化的条件是，含有本发明的活性化合物在合适的溶剂中，本发明活性化合物与底物均是可溶的，他们之间可以形成化学键。此化学反应的进行可以在室温或者低温下同步进行。对于具有光活性的本发明化合物，偶联反应的进行需要通过合适的光照来照射反应混合物，通过光照来活化本发明活性化合物从而使其与底物形成偶联。通过化学改性得到的水不溶性底物可以在非质子溶剂例如dmf，dmso，丙酮，乙酸乙酯，甲苯或氯仿中进行反应。通过使用具有高效活性的化合物使用相似的方法对水溶性材料的改性可以增加其在有机溶剂中的溶解性能。
[0105]
制备多肽或蛋白的偶联物，典型的步骤是把蛋白在室温或低温下以1
‑
10mg/ml溶解在偶联水缓冲液中.碳酸氢盐缓冲体系(ph为8.3)特别适合与琥珀酰亚胺酯反应，磷酸盐缓冲溶液(ph为7.2
‑
8)特别适合与硫醇
‑
活性官能团之间的偶联，碳酸盐或硼酸盐缓冲溶液(ph为9)特别适合异硫氰酸酯和二氯三嗪的偶联。合适的活性化合物以合适的偶联度所需要的量溶解在无水溶解(常用dmso或dmf)中，然后将其加入蛋白溶液中进行偶联。活性化合物的加入量预先是经过实验计算出所需的量，偶联产物经过柱色谱去除未偶联的产物而偶联产物可以在需要的应用中进行应用研究。
[0106]
把活性化合物加入组分溶液中，混合物需要经过合适时间的孵化(一般是在室温下孵化1h或者冰浴下孵化数小时)，多余的组分需要通过过滤，透析，hplc，使用离子交换或疏水性聚合物或其它合适材料吸附。偶联物可以在溶液或冻干后应用。通过这种方式可以制备抗体，部分抗体，抗生物素蛋白，血凝素，酶，蛋白a和g,细胞蛋白，白蛋白，组蛋白，生长因子，激素和其它蛋白的偶联物。
[0107]
在一个实施例中，将与本发明的化合物反应的多肽包括3到约80个氨基酸。此类多肽的实例包括但不限于神经肽、细胞因子、毒素和肽酶或蛋白酶底物。荧光标记的神经肽、细胞因子和毒素可用于绘图或显现各肽的特异性受体的分布。作为一个实例，当用本发明的化合物标记时，鬼笔环肽(一种具有环肽结构的毒素)可以用于染色细胞中的f
‑
肌动蛋白丝。作为另一个实例，当用本发明的荧光基团标记时，α
‑
银环蛇毒素(一种基于肽的蛇毒素)可以用于检测乙酰胆碱受体。用本发明的荧光基团标记的肽酶或蛋白酶底物可用于测定肽酶或蛋白酶的活性，并用于筛选设计为肽酶或蛋白酶抑制剂的药物。
[0108]
可以按照本发明制备的其它多肽偶联物包括抗体、凝集素、酶、脂蛋白、白蛋白、抗生物素蛋白、链霉亲和素、膜联蛋白、蛋白a、蛋白g、转铁蛋白、脱铁运铁蛋白、藻胆蛋白和其它荧光蛋白、毒素、生长因子、微管蛋白、激素、各种受体和离子通道的那些偶联物。
[0109]
另外，非抗体蛋白或者多肽例如g蛋白或其它合适蛋白可以单独使用或者与白蛋白结合使用，合适的白蛋白包括人或牛血清白蛋白或卵清蛋白。其中包括蛋白a,g和l或者至少一个可以与igg蛋白结合的衍生物。例如与igg具有亲和作用的蛋白。这些蛋白可以经
过改性但是不需要特殊处理，可以与其它载体分子采用相同的方式进行偶联。
[0110]
在一个实施例中，本发明化合物可以与抗体反应。此类抗体可以是一抗或二抗，这取决于所需的应用。如果待检测的抗原以非常少的量存在，可以使用二抗，以提供信号放大。可以标记各种二抗同种型。二抗同种型的非限制性实例是抗小鼠igg、抗小鼠igm、抗兔igg、抗大鼠igg、抗大鼠igm、抗豚鼠igg、抗鸡igg、抗仓鼠igg、抗人igg、抗人igm、抗山羊igg和抗绵羊igg。
[0111]
紫外光激发荧光染料的用途
[0112]
本发明化合物存在多种用途。相关的一个应用是本发明化合物作为标记试剂的用途，所述标记试剂能够赋予特定物质组分的荧光特性。本发明化合物可用于与任何宽范围的分子反应，包括但不限于生物分子如多肽、基于多肽的毒素、氨基酸、核苷酸、多核苷酸(包括dna和rna)、脂质和碳水化合物或他们的任何组合。此外，本发明化合物可用于与一下物质反应：半抗原、药物、微粒、合成或天然聚合物、细胞、病毒或其它荧光分子(包括本发明的荧光分子)，或表面。底物分子通常包括一个或多个官能团，所述光能团与本发明化合物的反应活性基团反应以形成共价连接键或非共价连接键。另一方面，本发明化合物的反应活性基团为活化的酯(如琥珀酰亚胺基酯或se)、马来酰亚胺、酰肼或氨氧基团。因此，在另一方面，来自底物分子(或反应底物)的官能团为胺、硫醇、醛或酮。得到的经荧光标记的底物分子可以被成为“染料
‑
偶联物”。本领域实践的用于制备“染料
‑
偶联物”的任何方法(如brinkley，bioconjugate chem.3,2(1992))适用于实践本发明。
[0113]
生物分子和本发明化合物的偶联物通常具有较高的荧光产率，同时通常保持了未标记的分子的关键参数，如溶解性、与受体或核酸选择性的结合、使具有的酶活化或抑制或掺入到生物膜中的能力。然而，具有最高标记程度的偶联物仍然可沉淀或非特异性结合。必要时，为了保持功能或结合特异性，比最大值小的标记程度是可接受的。制备本发明的偶联体可涉及优化特性的实验。进行偶联后，为偶联的标记试剂可以通过本领域已知的技术除去，所述技术如凝胶过滤、透析、偶联体沉淀和再溶解、hplc或这些技术的组合。游离染料的存在，特别是当染料保持化学反应活性时，可使得随后与生物偶联体的实验复杂化。
[0114]
本发明标记的生物分子的用途
[0115]
本发明的荧光标记的生物分子为多种宽泛的生物应用提供了一种有效的工具。标记使得技术人员能够辨别涉及生物分子的相互作用，所述生物分子如蛋白质、糖蛋白、核酸和脂质，以及无机化学物质，或他们的任何组合。可以进行此类实验以辨别特异性的蛋白质
‑
蛋白质相互作用、蛋白质
‑
核酸相互作用、目标蛋白质与候选抑制剂或者激活剂之间的相互作用。候选抑制剂或激活剂包括但不限于反义寡核苷酸、双链rna、核酶、核酶衍生物、抗体、脂质体、小分子、无机或者有机化合物。也可以使用本发明实验来研究酶促动力学，用于例如药物设计、筛选和/或优化，并且可以使用在溶液中或固定在固体基质上的荧光标记的多肽来进行。
[0116]
尤其感兴趣的是细胞表面受体与其对应的配体之间的特异性相互作用。细胞表面受体是锚定在细胞质膜上或插入其中的分子。它们是构成蛋白质、糖蛋白、多糖和脂质的大家族，其不仅充当质膜的结构组分，还作为调节多种生物功能的调控元件。另一方面，特异性的蛋白质
‑
蛋白质相互作用涉及细胞表面受体和免疫脂质体或免疫毒素。另一方面，特异性的蛋白质
‑
蛋白质相互作用可以涉及胞质溶胶蛋白、核蛋白、伴侣蛋白或锚定在其它细胞
内膜结构上的蛋白质。另外，特异性的蛋白质
‑
蛋白质相互作用存在于靶蛋白质)例如抗原)和该抗原的特异性抗体之间。
[0117]
通过在怀疑发生相互作用的条件下混合标记多肽与相互作用实体，来测定这两种实体之间的特异性相互作用。通常，借助于光学装置来显现相互作用。需要时，这些实体可以放置在光学限制内(参见例如美国专利号7，267，673和7，170，050)。检测单分子时，各光学限制区域仅含有一种所研究的靶标。这可以通过在大体积溶液中稀释靶标而实现，或大多数限制区域将有一个靶分子分配在其中。通过任何本领域可用的方法，可将标记多肽和相互作用实体固体在光学限制区域的内表面上，此类方法包括使用由多种结合部分实现的共价和非共价连接。结合部分的选择将取决于标记多肽和/或相互作用实体的性质。固定标记多肽或蛋白质探针的一种方式涉及链霉亲和素或抗生物素蛋白/生物素结合对的使用。
[0118]
光源
[0119]
本发明化合物可在任何时候，无论是测试过程中或者是测试后，均可以使用合适光源进行照射后产生可检测的光学信号，信号强度的变化可由本领域已知的任何方法检测，且通常取决于对所使用的荧光基团的选择。这可在光学系统的辅助下进行。所述系统通常包括至少两种元件，即激发源和光子检测器。这些元件的多种实例是本领域可获得的。实例性激发源为激光器，如偏振激光器。激光的选择依赖于与探针相连的荧光基团。本领域技术人员可通过常规实验容易的确定激发给定荧光团的适当激发波长(参见例如the handbook
‑
a guide to fluorescent probes and labeling techmologies，tenth edition(2005)。本领域技术人员可采用其它光学系统，这些光学系统可包括元件如光学读数器、高效光子检测系统、光电倍增管、门控感应的fet、纳米管fet、光电二极管、照相机、电荷耦合器件(ccd)、电子倍增电荷耦合器件(emccd)、增强型电荷耦合器件(iccd)和共聚焦显微镜。可以选择合适的设备来对本发明荧光化合物进行照射，包括的设备包括但不限于手持式紫外灯、汞弧灯、氙灯、氩激光器和yag激光器。这些照射源可选择性的集成在激光扫描器，流式细胞仪，荧光微孔读数仪，标准或mini荧光仪或色谱检测器中。荧光发射可以使用肉眼检测或者使用下述设备进行检测：ccd相机、摄像机、胶片、激光扫描设备、荧光仪、光学二极管、量子计数器、落射荧光显微镜、扫描显微镜、流式细胞仪、酶标仪。
[0120]
试剂盒
[0121]
试剂盒为装本发明的紫外光激发荧光染料的外包装。试剂盒一般都会给出本发明化合物的一种或者几种使用方法。一般而言，试剂盒中包括本发明活性染料化合物，染料与包含合适功能位点的任何底物的偶联方法以及回收或纯化标记后物质的方法。染料及说明书就构成了标记合适底物的试剂盒。选择性的合适底物包括但不限于大分子聚合物(例如蛋白质，寡核苷酸或碳水化合物)，聚合物树脂和塑料(例如聚苯乙烯)，金属，玻璃和其它有机或无机底物。
[0122]
另一方面，本发明试剂盒也包括本发明化合物
‑
底物偶联物，本发明的试剂盒可装有一种或多种本发明化合物和指导利用所述化合物的使用说明书。典型的，试剂盒中包含染料二抗偶联物。因此，最终用户需要提供一抗，这样就可以对分析物或络合物进行检测。另外，试剂盒中包括染料二抗偶联物和染料一抗偶联物，这样可以用来检测细胞受体，酶，细胞器或其它与抗体相连的其它配体。
[0123]
下面结合实施例进一步描述本发明紫外光激发荧光染料的合成方法。
[0124]
实施例1：化合物5的制备：
[0125]
(1)化合物1的合成：
[0126][0127]
根据us2012004397中化合物6的合成方法，制得化合物1。
[0128]
将化合物1进行核磁共振(nmr)表征，表征结果如下：
[0129]
化合物1:1h nmr:1.1(t,3h),1.3
‑
3(m,8h),4
‑
5(m,4h),7.03(d,2h),7.1(s,1h),7.66(d,2h),7.9
‑
8.8(m,4h)
[0130]
(2)化合物2的合成：
[0131][0132]
1g化合物1(2.63mmol)悬浮于10ml浓盐酸中，在65℃反应过夜，tlc跟踪反应，反应结束后，旋蒸除去盐酸和水，无需干燥即可用于下一步反应。取少量进行柱层析并抽干得到的固体产物，即化合物2。
[0133]
将化合物2进行nmr表征，表征结果如下：
[0134]
化合物2:1h nmr:1.3
‑
3(m,8h),4
‑
5(m,2h),7.03(d,2h),7.1(s,1h),7.66(d,2h),7.9
‑
8.8(m,4h)
[0135]
(3)化合物3的合成：
[0136][0137]
400mg化合物2(1.13mmol)溶解在3ml浓硫酸中，冷却降温到0℃,加入3ml 30％发烟硫酸，温度不超过5℃,加入完毕后，自然升温过夜，将反应混合物滴入到预先冷却到0℃的200ml乙醚中，搅拌，离心后用制备液相进行分离、冻干得到的固体产物，即化合物3。
[0138]
将化合物3进行nmr表征，表征结果如下：
[0139]
化合物3:1h nmr:1.3
‑
3(m,8h),4
‑
5(m,2h),7.5(d,1h),7.1(s,1h),8.1(d,1h)，8.3(s,1h),7.9
‑
8.8(m,4h)
[0140]
(4)化合物4的合成：
[0141]
[0142]
0.5g化合物3(1.16mmol)溶解在5ml的dmf中，加入1.21gm
‑
dpeg23
‑
nh2(1.16mmol)(quata biodesign limited,mw:1044.28)，然后再加入0.48g hbtu(1.27mmol)及210ul dipea(1.27mmol)，室温反应过夜，旋蒸除去dmf，用水溶解剩余物，用液相进行制备，得到的纯品冻干，得到化合物4。
[0143]
将化合物4进行质谱(ms)表征和nmr表征。ms质谱图如图1所示，由图1可知，m＝1457.27及m 1峰＝1458.43；nmr表征结果如下：
[0144]
化合物4:1h nmr:1.3
‑
2.5(m,8h),3
‑
5(m,97h),7.5(d,1h),7.1(s,1h),8.1(d,1h)，8.3(s,1h),7.9
‑
8.8(m,4h)
[0145]
(5)化合物5的合成：
[0146][0147]
0.5g化合物4(0.343mmol)与0.67g 6
‑
溴己酸(3.43mmol)悬浮在10ml的乙腈中，耐压瓶中120℃反应过夜后，直接旋蒸除去乙腈，剩余物用水溶解进行高效液相制备，纯品收集，冻干得到化合物5。
[0148]
将进行ms表征、紫外分光光度计和荧光分光光度表征和nmr表征。化合物5的ms质谱图如图2所示，由图2可知，m＝1572.38及m 1峰＝1573.64；化合物5的吸收和发射光谱如图3所示；nmr表征结果如下：
[0149]
化合物5:1h nmr:1.3
‑
2.5(m,16h),3
‑
5(m,99h),7.5(d,1h),7.1(s,1h),8.1(d,1h)，8.3(s,1h),7.9
‑
8.8(m,4h)
[0150]
实施例2：
[0151]
化合物6a的制备：
[0152]
[0153]
1g化合物5(0.64mmol)溶解在20ml无水dma中，0.16g dsc与6.2mg dmap加入到反应溶液中，在室温下搅拌悬浮液2天。反应结束后，减压将溶剂浓缩至3ml，加入300ml乙酸乙酯并且搅拌0.5h后，收集固体，过滤用乙酸乙酯洗涤可得化合物6.
[0154]
将化合物6a进行nmr表征，表征结果如下：
[0155]
化合物6a:1h nmr:1.3
‑
2.5(m,20h),3
‑
5(m,99h),7.5(d,1h),7.1(s,1h),8.1(d,1h)，8.3(s,1h),7.9
‑
8.8(m,4h)
[0156]
实施例3
[0157]
化合物6b的制备：
[0158][0159]
将250mg化合物5溶解在10ml 0℃的dme中，100mg肼加入其中，在0℃反应1h。真空下抽干溶剂，剩余物经过hplc制备可得化合物6b。
[0160]
将化合物6b进行nmr表征，表征结果如下：
[0161]
化合物6b:1h nhr:1.3
‑
2.5(m,16h),3
‑
5(m,101h),7.5(d,1h),7.1(s,1h),8.1(d,1h)，8.3(s,1h),7.9
‑
8.8(m,5h)
[0162]
实施例4
[0163]
化合物6c的制备：
[0164][0165]
将250mg化合物5溶解在10ml 0℃dme中，加入90mg n
‑
(2
‑
氨基乙基)马来酰亚胺三氟乙酸盐和0.1ml三乙胺，在0℃反应1h。真空下抽干溶剂，剩余物经过hplc制备可得化合物6c.
[0166]
将化合物6c进行nmr表征，表征结果如下：
[0167]
化合物6c:1h nhr:1.3
‑
2.5(m,16h),3
‑
5(m,103h),7.5(d,1h),7.1(s,1h),8.1(d,1h)，8.3(s,1h),7.9
‑
8.8(m,6h)
[0168]
实施例5
[0169]
化合物7的制备：
[0170][0171]
制备方法同实施例1中化合物5的制备方法，不同点是将实施例1中第四步的m
‑
dpeg23
‑
nh2换成m
‑
dpeg7
‑
nh2，就可得到化合物7。
[0172]
将化合物7进行nmr表征，表征结果如下：
[0173]
化合物7:1h nhr:1.3
‑
2.5(m,16h),3
‑
5(m,35h),7.5(d,1h),7.1(s,1h),8.1(d,1h)，8.3(s,1h),7.9
‑
8.8(m,4h)
[0174]
实施例6
[0175]
化合物8的制备：
[0176][0177]
根据专利us8158801中关于主体结构的合成过程结合实施例1化合物5的制备方法，即制得化合物8。
[0178]
将化合物8进行nmr表征，表征结果如下：
[0179]
化合物8:1h nhr:1.3
‑
2.5(m,16h),3
‑
5(m,135h),7.5(d,1h),7.2(s,1h),8.1(d,1h)，8.3(s,1h),7.9
‑
8.8(m,4h)
[0180]
实施例7
[0181]
紫外光激发荧光染料
‑
偶联物(荧光染料 抗体)的制备
[0182]
在0.1mm ph为8.5碳酸氢钠缓冲液中，将荧光染料化合物6a与浓度为1mg/ml的抗体(山羊抗小鼠igg,即gam)按照不同的比例混合，在室温孵育约1h后，使用经pbs(ph＝7.4)
平衡的sephadex g
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25经凝胶过滤法分离反应混合物，得到一组染料
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偶联物(荧光染料 抗体)。将该组染料
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偶联物进行标记反应，得出如图4所示的不同标记程度(dol)的化合物6a
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gam的荧光强度。其中，图4还将不同标记程度(dol)下，化合物6a
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gam的荧光强度与pacific orange
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gam(现有技术)的荧光强度进行了对比，发现化合物6a
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gam比pacific orange
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gam的荧光强度更强。
[0183]
制备方法参考文件如下所示：us6974873；haugland et al.；meth.mol.biol.45,205,(1995)；haugland et al.current protocols in cell biology，16.51.
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16.5.22(2000)
[0184]
pacific orange
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gam参考专利us8158801。
[0185]
实施例8
[0186]
紫外光激发荧光染料6a应用于细胞的免疫分型检测分析
[0187]
具体的实验方法如下：
[0188]
将人的单核细胞用1％bsa/pbs进行洗涤，并以1000万/ml的浓度重悬，然后用载体分子为1微克小鼠抗人cd4和荧光染料为化合物6a制备成的染料
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偶联剂进行染色30分钟。将染色后的单核细胞用1％bsa/pbs洗涤，离心并重悬于400毫升的1％bsa/pbs中，在lsr ii流式细胞仪上分析样品。其中，采用的二极管激光器为405nm二极管激光器，发射滤波器使用前向散射vs侧向散点图，对淋巴细胞进行门控，并使用淋巴细胞门进行绘制，使用单色控件进行补偿。
[0189]
经过上述操作即得到如图5所示的化合物6a显示的免疫分型。
[0190]
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本领域技术的技术人员在本发明公开的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。