一种天山小球藻及小球藻深层净化因子的多级循环萃取设备和制备方法与流程

1.本发明涉及一种天山小球藻及其提取技术领域，尤其涉及小球藻深层净化因子的制备方法，应用及多级循环萃取设备，属于日用化妆品技术领域。


背景技术：

2.小球藻深层净化因子，是一种包含了蛋白质、多糖、核酸、多肽、维生素和微量元素等多种物质的混合物，其多样化的物质组成使其具有多种护肤功效：清除自由基、螯合氧化还原重金属离子、强化角质层屏障、调节巨噬细胞体外免疫功能、修复细胞及dna损伤，抗污染和抗辐射，并且极尽安全无刺激。
3.如今因环境影响、生活习惯及不良化妆品等问题对儿童皮肤的损伤日益严重，而小球藻深层净化因子对人体皮肤特别是儿童皮肤有很好的保护作用。从新疆天山发现的天山小球藻品种因生长在极端的环境中，自身含有抗逆性活性成分较多，主要是c.g.f
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小球藻生长因子，具有修复对儿童受损皮肤的作用。化妆品的制备方式决定更青睐使用液体原料，如何制备出稳定，抗逆修复活性物质保留好的小球藻深层净化因子具有现实指导意义。
4.现有的植物提取用萃取设备存在以下问题：
5.(1)目前的萃取设备对于物料和萃取液的混合效果较为一般，通常其仅仅利用单一的轴状部件进行混合作业，其效率较低；
6.(2)目前的萃取设备在混合过程中，缺乏竖直方向上的混料作用，导致物料与萃取液的接触不够充分，导致萃取时间较长，进一步影响其萃取效率。


技术实现要素：

7.(一)发明目的
8.为解决背景技术中存在的技术问题，本发明提出一种天山小球藻及小球藻深层净化因子的制备方法，应用及多级循环萃取设备。
9.(二)技术方案
10.为解决上述问题，本发明提供了一种天山小球藻，其命名为：新疆天山小球藻 jy
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1900386，其在2021年6月7日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmcc no.22396,保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，样品为存活样品，分类名为小球藻(chlorella sp.)。
11.还提供了一种天山小球藻及小球藻深层净化因子的多级循环萃取设备，包括萃取罐，所述萃取罐内转动安装有转轴，所述萃取罐的顶部设有用于转轴转动的伺服电机，所述转轴的两侧设有混料杆，所述萃取罐的底部内壁设有传动箱，转轴的底部与传动箱转动连接，所述萃取罐的底部连接有驱动管，驱动管内转动安装有输送螺杆，所述输送螺杆与转轴传动连接，所述驱动管的一端连接有循环管，所述转轴上活动连接有顶部为敞口设置的分流桶，所述循环管的一端延伸至萃取罐内并位于分流桶的上方，分流桶的底部设置有多个
呈环形均匀分布的分流管，分流管位于混料杆的上方，所述转轴靠近分流桶的一端固定安装有端片，且端片的顶部外壁固定安装有震动弹簧，所述震动弹簧的顶端与分流桶的底端相抵，所述分流桶的内底部呈斜面状，且分流桶的内底部固定安装有等距离分布的弧筋片。
12.优选的，所述萃取罐的顶部设有进料管，所述萃取罐的底部设有出料管，出料管的顶部设有限流塞，所述萃取罐的底部设有推杆电机，推杆电机的推杆传动连接有u形杆，所述u 形杆的一端贯穿出料管并与限流塞连接。
13.优选的，所述转轴的底部延伸至传动箱内并传动连接有锥齿轮一，传动箱的一侧转动安装有联动杆，联动杆的一端与输送螺杆传动连接，联动杆的另一端延伸至传动箱内并连接有锥齿轮二，锥齿轮一与锥齿轮二啮合，所述混料杆的一侧设有分别设有进水孔、出水孔，混料杆上设有连通孔，连通孔的两端分别与进水孔和出水孔连通，连通孔为波浪形结构，所述混料杆的外壁均通过轴承转动连接有套管，且套管的圆周外壁均固定安装有等距离分布的波状片。
14.本发明还公开了一种小球藻深层净化因子的制备方法，包括以下步骤：
15.s1、准备原料：对上述的小球藻进行破壁处理，得到小球藻破壁藻粉50％
‑
60％；
16.s2、加水外循环提取，将小球藻破壁藻粉加入5
‑
6倍的水进行外循环提取，提取温度为 70
‑
90℃，提取时间为0.5
‑
1h，根据在线分光光度计监测，根据吸光度判定终点，具体范围为波长240nm的吸光度值十倍稀释≥0.9，550nm吸光度≤1.6，放出萃取液得a1；
17.s3、加2％甘油溶液外循环提取，加入3
‑
4倍的水进行外循环提取，提取温度70
‑
90℃，提取时间30
‑
1.5h,具体用在线分光光度计监测，根据吸光度判定终点，具体范围为波长 280nm的吸光度值十倍稀释≥1.5，550nm吸光度≤10，放出萃取液得a2；
18.s4、加3％甘油溶液外循环提取，放出萃取液后加入2
‑
3倍的水进行外循环提取，提取温度90
‑
100℃，提取时间0.5
‑
1.0h,具体用在线分光光度计监测，根据吸光度判定终点，具体范围为波长280nm的吸光度值十倍稀释≥1.0，550nm吸光度≤1.2，放出萃取液得a3；
19.s5、萃取液混合，将a1、a2、a3通过萃取罐混合制得混合萃取液；
20.s6、10000rpm离心30min，取上清液；
21.s7、上清液超滤，将混合萃取液过5000
‑
10000道尔顿超滤膜，循环至浓缩液剩25
‑
30％时，在浓缩液中补加5％的甘油溶液，浓度为50
‑
60％，继续超滤至生药含量15％；
22.s8、浓缩生药，用100
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1000道尔顿的纳滤膜浓缩至100％的生药，即得小球藻深层净化因子。
23.本发明的上述技术方案具有如下有益的技术效果：
24.1、该小球藻提取用多级外循环萃取设备的提取工艺，采用梯度提取的方法为首创，极地小球藻因成分的极性差异用单中比例额的溶剂提取影响整体成分的提取率，本法可以提极地小球藻的提取效率并减少溶剂的使用和杂质的溶出；
25.2、该小球藻提取用多级外循环萃取设备的提取工艺，采用实时监控有效成分和杂质溶出的手段，来控制提取终点，能更为精准的控制产品的成分稳定，进而控制产品的功效稳定；
26.3、本发明的小球藻深层净化因子的多级循环萃取设备，提取得到的小球藻抗逆因子应用于儿童化妆品领域保湿，增强皮肤角质层屏障、修复领域，该配比下，能产生显著的增效作用；
27.4、该小球藻深层净化因子的多级循环萃取设备，能够利用转轴转动带动锥齿轮一转动使得锥齿轮二转动，使得联动杆转动，带动输送螺杆转动，引导萃取液通过驱动管和循环管进入到分流桶，通过多个分流管输送给混料杆重复搅拌，实现萃取罐内的萃取液由下向上运输在进行搅拌，配合混料杆的横向搅拌，实现萃取液均匀混合，提高萃取液的混合均匀度
28.5、该小球藻深层净化因子的多级循环萃取设备，利用设置的弧筋片，能够在循环管的加液冲击下，带动分流桶旋转，进而均匀分流作业；另一方面，设置的震动弹簧，能够在实际使用时，带动分流桶小幅度的上下震动，从而进一步提高分流的随机性、均匀性，有利于保证该装置的萃取效果；
29.6、该小球藻深层净化因子的多级循环萃取设备，混料杆在转动的过程中，混料杆转动时进水孔和出水孔线速度会不同，进而实现搅拌时萃取液通过进水孔进入，经过连通孔从出水孔流出，从而实现萃取液对流，加速萃取液充分混合；设置的套管和波状片，能够在混料杆旋转过程中，在液体的作用下，自身发生转动，提高物料与萃取液的混合效果，保证萃取效率。
附图说明
30.图1为本发明的植物提取用多级外循环萃取设备的提取工艺流程图。
31.图2为本发明的萃取罐结构示意图。
32.图3为本发明的分流桶结构示意图。
33.图4为本发明的分流桶半剖视结构示意图
34.图5为本发明的混料杆俯视结构剖视示意图。
35.图6为本发明的混料杆局部立体结构示意图。
36.图7为本发明的单细胞凝胶电泳试验(彗星电泳)
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dna损伤修复图。
37.附图标记说明：
38.1、萃取罐；2、转轴；201、震动弹簧；202、端片；3、混料杆；301、进水孔；302、出水孔；303、连通孔；4、伺服电机；5、传动箱；6、驱动管；7、循环管；8、输送螺杆；9、分流桶；901、弧筋片；10、分流管；11、联动杆；12、出料管；13、限流塞；14、推杆电机； 15、u形杆；16、进料管；17、套管；18、波状片。
具体实施方式
39.为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明了，下面结合具体实施方式并参照附图，对本发明进一步详细说明。应该理解，这些描述只是示例性的，而并非要限制本发明的范围。此外，在以下说明中，省略了对公知结构和技术的描述，以避免不必要地混淆本发明的概念。
40.参照图2
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7所示，本发明提供了一种天山小球藻，其命名为：新疆天山小球藻 jy
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1900386，其在2021年6月保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmcc no:17926。
41.本发明还提供了一种天山小球藻及小球藻深层净化因子的多级循环萃取设备，包括萃取罐1，萃取罐1内转动安装有转轴2，萃取罐1的顶部设有用于转轴2转动的伺服电机4，
转轴2的两侧设有混料杆3，萃取罐1的底部内壁设有传动箱5，转轴2的底部与传动箱5转动连接，萃取罐1的底部连接有驱动管6，驱动管6内转动安装有输送螺杆8，输送螺杆8与转轴2传动连接，驱动管6的一端连接有循环管7，转轴2上活动连接有顶部为敞口设置的分流桶9，循环管7的一端延伸至萃取罐1内并位于分流桶9的上方，分流桶9的底部设置有多个呈环形均匀分布的分流管10，分流管10位于混料杆3的上方，转轴2靠近分流桶9的一端固定安装有端片202，且端片202的顶部外壁固定安装有震动弹簧201，震动弹簧201的顶端与分流桶9的底端相抵，分流桶9的内底部呈斜面状，且分流桶9的内底部固定安装有等距离分布的弧筋片901；利用设置分流桶9的内底部呈斜面状，方便分流作业的进行；设置的弧筋片901，能够在循环管7的加液冲击下，带动分流桶9旋转，进而均匀分流作业；另一方面，设置的震动弹簧201，能够在实际使用时，带动分流桶9小幅度的上下震动，从而进一步提高分流的随机性、均匀性。
42.如图2所示，萃取罐1的顶部设有进料管16，萃取罐1的底部设有出料管12，出料管 12的顶部设有限流塞13，萃取罐1的底部设有推杆电机14，推杆电机14的推杆传动连接有 u形杆15，u形杆15的一端贯穿出料管12并与限流塞13连接；通过推杆电机14带动u形杆15进行升降调节使得限流塞13进行升降，使得限流塞13与出料管12分开和接触，实现物料的放料，出料方便。
43.如图2所示，转轴2的底部延伸至传动箱5内并传动连接有锥齿轮一，传动箱5的一侧转动安装有联动杆11，联动杆11的一端与输送螺杆8传动连接，联动杆11的另一端延伸至传动箱5内并连接有锥齿轮二，锥齿轮一与锥齿轮二啮合；通过转轴2转动，带动锥齿轮一转动使得锥齿轮二转动，使得联动杆11转动，带动输送螺杆8转动，混料杆3的一侧设有分别设有进水孔301、出水孔302，混料杆3上设有连通孔303，连通孔303的两端分别与进水孔301和出水孔302连通，连通孔303为波浪形结构，混料杆3的外壁均通过轴承转动连接有套管17，且套管17的圆周外壁均固定安装有等距离分布的波状片18；通过混料杆3在转动的过程中，混料杆3转动时进水孔301和出水孔302线速度会不同，进而实现搅拌时萃取液通过进水孔301进入，经过连通孔303从出水孔302流出，从而实现萃取液对流，加速萃取液充分混合；设置的套管17和波状片18，能够在混料杆3旋转过程中，在液体的作用下，自身发生转动，提高物料与萃取液的混合效果，保证萃取效率。
44.工作原理：通过把萃取液从进料管16加入萃取罐1内，通过伺服电机4带动转轴2转动使得混料杆3转动，对物料进行横向混料，转轴2转动带动锥齿轮一转动使得锥齿轮二转动，使得联动杆11转动，带动输送螺杆8转动，引导萃取液通过驱动管6和循环管7进入到分流桶9，通过多个分流管10输送给混料杆3重复混料，实现萃取罐1内的萃取液由下向上运输在进行混料，配合混料杆3的横向混料，实现萃取液均匀混合，提高萃取液的混合均匀度；当物料与萃取液的充分混合后，再静置一段时间，待萃取罐1中的液体分层后，操作人员通过推杆电机14带动u形杆15进行升高，从而使得限流塞13进行升起，使得限流塞13与出料管12分开，并将底端的分层液体进行卸料处理。
45.本发明还公开了一种小球藻深层净化因子的制备方法：
46.实施例一
47.如图1所示，对上述的小球藻进行破壁处理，得到小球藻破壁藻粉50％
‑
60％，具体的，破壁处理，采用研磨机机进行细胞破碎，加入6倍的水进行外循环提取，提取温度70℃，
根据在线分光光度计监测判定终点，具体范围为波长240nm的吸光度值十倍稀释≥0.9,550nm 吸光度≤1.3，放出萃取液得a1；藻渣加入3倍的2％的甘油溶液进行外循环提取，提取温度80℃，提取终点为280nm的吸光度值十倍稀释≥1.2,550nm吸光度≤1.4，放出萃取液得a2；藻渣加入2倍的5％的甘油溶液进行外循环提取，提取温度80℃，提取终点为280nm的吸光度值十倍稀释≥1.0,550nm吸光度≤1.2，放出萃取液得a3。合并a1、a2、a3，混合后过10000 道尔顿超滤膜，循环至浓缩液剩25
‑
30％时，在浓缩液中补加3％的甘油溶液，浓度为50％，继续超滤至生药含量15％，用100道尔顿的纳滤膜浓缩至100％的生药，即得小球藻深层净化因子。
48.所得小球藻深层净化因子的总糖含量为1.05％，加速试验稳定性为3个月，1％的小球藻深层净化净化因子对uvb诱导的成纤维细胞dna损伤修复能力达到80％，0.01％的小球藻深层净化净化因子促进巨噬细胞的吞噬增加到188.2％，3d皮肤功效评价实验如表1所示：
49.表1
[0050][0051]
实施例二
[0052]
如图1所示，对上述的小球藻进行破壁处理，得到小球藻破壁藻粉50％
‑
60％，具体的，采用研磨机机进行细胞破碎，加入5倍的水进行外循环提取，提取温度80℃，根据在线分光光度计监测判定终点，具体范围为波长240nm的吸光度值十倍稀释≥1.3,550nm吸光度≤1.6，放出萃取液得a1；药渣加入3倍的3％的甘油溶液进行外循环提取，提取温度70℃，提取终点为280nm的吸光度值十倍稀释≥1.2,550nm吸光度≤1.3，放出萃取液得a2；药渣加入2倍的5％的甘油溶液进行外循环提取，提取温度850℃，提取终点为280nm的吸光度值十倍稀释≥1.0,550nm吸光度≤1.2，放出萃取液得a3。合并a1、a2、a3，混合后过5000道尔顿超滤膜，循环至浓缩液剩25～30％时，在浓缩液中补加2％的甘油溶液，浓度为60％，继续超滤至生药含量15％，用1000道尔顿的纳滤膜浓缩至100％的生药，即得小球藻深层净化因子。
[0053]
所得小球藻深层净化因子的总糖含量为1.1％，加速试验稳定性为3个月，1％的小球藻深层净化净化因子对uvb诱导的成纤维细胞dna损伤修复能力达到83％，0.01％的小球藻深层净化净化因子促进巨噬细胞的吞噬增加到206.9％，3d皮肤功效评价实验如表2所示：
[0054]
表2
[0055][0056]
实施例三
[0057]
如图1所示，对上述的小球藻进行破壁处理，得到小球藻破壁藻粉50％
‑
60％，采用研磨机机进行细胞破碎，加入5倍的水进行外循环提取，提取温度90℃，根据在线分光光度计监测判定终点，具体范围为波长240nm的吸光度值十倍稀释≥1.3,550nm吸光度≤1.5，放出萃取液得a1；藻渣加入4倍的4％的甘油进行外循环提取，提取温度80℃，提取终点为280nm 的吸光度值十倍稀释≥1.5,550nm吸光度≤1.4，放出萃取液得a2；藻渣加入3倍的5％的甘油溶液进行外循环提取，提取温度95℃，提取终点为280nm的吸光度值十倍稀释≥1.0,550nm 吸光度≤1.2，放出萃取液得a3。合并a1、a2、a3，混合后过8000道尔顿超滤膜，循环至浓缩液剩25～30％时，在浓缩液中补加3％的甘油溶液，浓度为550％，继续超滤至生药含量15％，用500道尔顿的纳滤膜浓缩至100％的生药，即得小球藻深层净化因子。
[0058]
所得小球藻深层净化因子的总糖含量为1.09％，加速试验稳定性为3个月，1％的小球藻深层净化净化因子对uvb诱导的成纤维细胞dna损伤修复能力达到79％，0.01％的小球藻深层净化净化因子促进巨噬细胞的吞噬增加到178.4％，3d皮肤功效评价实验如表3所示：
[0059]
表3
[0060][0061]
各实施例中活性成分的检测方法如下：
[0062]
总糖：苯酚硫酸法；
[0063]
单细胞凝胶电泳试验(彗星电泳)
‑‑
dna损伤修复，见图7
[0064]
试验方法将处理后的细胞包埋在琼脂糖中，铺于载玻片上，凝固后浸入冷裂解液中使细胞裂解，在电泳液中解旋后水平电泳，中和缓冲液中和后烘干，再用eb染色，在荧光显微镜下观察玻片上细胞的荧光图像，评价dna的损伤程度，本研究采用二层铺胶法。
[0065]
对巨噬细胞ana
‑
1吞噬活性的影响实验
[0066]
取对数生长期的细胞，吹打制成2*105个/ml单细胞悬液，每孔100μl，接种于96 孔细胞板，细胞贴壁后弃培养上清液，设对照组、加药组，每组6个复孔，分别培养24， 48，72h后，每孔加新鲜配制的0.1％nr和pm2.5悬浊液20μl，轻轻混匀后继续培养 3h。之后小心吸弃含有nr的培养液，用生理pbs轻柔洗去未被吞噬的nr。每孔加150μ l细胞裂解液(无水乙
醇:乙酸＝1:1(v/v))，静置2h，使细胞溶解，震荡混匀后测定540nm处od值[90]。细胞对nr的吞噬率如下：
[0067]
吞噬率＝加药组/对照组*100％。
[0068]
3d皮肤功效评价实验：将3块3d皮肤做免疫标记。
[0069]
a、直接培养人3d皮肤5天；b、使用重金属复合液(铅汞比例1:2,0.1％水溶液) 处理后，培养人3d皮肤5天；c、在3d皮肤上均匀涂抹小球藻深层净化因子后再使用重金属复合液(铅汞比例1:2,0.1％水溶液)处理，培养3d皮肤5天
[0070]
b、5天后使用leica’s q500成像分析软件测量a/b/c三种情况下人3d皮肤厚度；
[0071]
c、检测标记物丝聚蛋白的表达量。
[0072]
1.以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的仅为本发明的优选例，并不用来限制本发明，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。