一种产蛋白酶、解钾的萎缩芽孢杆菌及其应用的制作方法

1.本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种产蛋白酶、解钾的萎缩芽孢杆菌及其应用。


背景技术：

2.公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
3.近年来，化肥在农业生产中发挥了巨大的增产作用，但它污染土壤，使土壤板结，造成土壤肥力下降，农产品品质降低等一系列问题。因此，研制出能够降低化肥用量并符合农业可持续发展要求的新型肥料则显得十分必要。土壤微生物在有机质分解、养分循环和植物养分利用等过程中发挥着重要的作用。植物根际土壤中含有大量微生物，根据对植物的作用，根际细菌分为有益(2％
‑
5％)、有害(8％
‑
15％)和中性(80％
‑
90％)三大类。植物根际促生菌(plant growth promoting rhizobacteria,pgpr)是指自由生活在土壤或附生于植物根际的一类可促进植物生长、防治病害、增加作物产量的有益菌类。一般具有固氮、解磷、释钾、产生植物激素和分泌抗生素等能力或至少具有其中之一的能力。pgpr对土壤中有害病原微生物与非寄生性根际有害微生物都有生防作用，对植物吸收利用矿物质营养有促进作用，并可以产生有益于植物生长的代谢产物，从而促进植物的生长发育。
4.目前，已报道的植物根际促生菌多集中在芽孢杆菌属(bacillus)、假单胞菌属(pseudomonas)、农杆菌属(agrobacterium)和埃文氏菌属(eriwinia)等菌属中，然而，发明人发现，针对萎缩芽孢杆菌的拮抗的相关研究较多，而对于其促进玉米生长的却鲜有报道。


技术实现要素：

5.基于上述现有技术的不足，本发明提供一种产蛋白酶、解钾的萎缩芽孢杆菌及其应用。经研究发现，其具有较佳的耐盐性能，同时具有产蛋白酶和解钾性能，从而改善植物(如玉米)根际营养情况，促进植物生长，因此具有良好的实际应用之价值。
6.为实现上述技术目的，本发明涉及以下技术方案：
7.本发明的一个方面，提供一株萎缩芽孢杆菌(bacillus atrophaeus)cny01，该菌株已于2021年7月9日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，其生物保藏号为cgmcc no.22866。
8.所述萎缩芽孢杆菌cny01的菌落及菌体特征如下：在lb培养基上培养后观察，菌落呈现近圆形，表面扁平干燥，边缘不规则，乳白色，不透明。菌体呈杆状，产芽孢，革兰氏阳性。
9.所述萎缩芽孢杆菌cny01的生理生化特征为：无氧化酶活性，呈阴性；可将硝酸盐还原呈亚硝酸盐，呈阳性；有乙酰甲基甲醇产生，v
‑
p呈阳性；吲哚产生呈阴性；可利用甘露醇，呈阳性；不可利用木糖，呈阴性；可利用纤维二糖，呈阳性；不可利用阿拉伯糖，呈阴性；
可利用山梨醇，呈阳性；可利用麦芽糖，呈阳性；不可利用乳糖，呈阴性；可利用葡萄糖，呈阳性。
10.本发明的第二个方面，提供上述萎缩芽孢杆菌cny01的发酵方法，所述发酵方法包括：将所述萎缩芽孢杆菌cny01接种至发酵培养基中进行发酵培养即得。
11.本发明的第三个方面，提供一种微生物菌剂，其含有所述萎缩芽孢杆菌cny01或其发酵物或其代谢产物。
12.本发明的第四个方面，提供一种微生物菌肥，所述微生物菌肥其活性成分包括上述萎缩芽孢杆菌cny01、上述萎缩芽孢杆菌cny01的发酵物、上述萎缩芽孢杆菌cny01的代谢产物和/或上述微生物菌剂。
13.本发明的第五个方面，上述萎缩芽孢杆菌cny01或其发酵物或其代谢产物、微生物菌剂和/或微生物菌肥在如下a)
‑
d)中全部或部分中的应用也是本发明保护的范围：
14.a)在产蛋白酶中的应用；
15.b)在解钾中的应用；
16.c)在改善植物根际土壤营养情况中的应用；
17.d)在促进植物生长中的应用。
18.上述应用中，所述植物可为下述任一种植物：
19.p1)种子植物；
20.p2)单子叶植物；
21.p3)禾本科植物；
22.p4)玉米。
23.本发明的第六个方面，提供一种促进植物生长的方法，所述方法包括向植株生长环境中施加上述萎缩芽孢杆菌cny01、上述萎缩芽孢杆菌cny01的发酵物、上述萎缩芽孢杆菌cny01的代谢产物、上述微生物菌剂和/或上述微生物菌肥。
24.上述方法中，所述植物可为下述任一种植物：
25.p1)种子植物；
26.p2)单子叶植物；
27.p3)禾本科植物；
28.p4)玉米。
29.上述方法中，所述植物生长环境可以包括任何可适于植物生长的环境，如土壤环境、水环境、植物营养液环境等。更优选的，所述植物生长环境为含盐环境。经试验证明，其在含盐的玉米生长环境(营养液和土壤环境)中，施用本技术菌株后能够显著促进玉米植株生长，表现为显著促进玉米株高、生理株高及茎粗作用。
30.上述一个或多个技术方案的有益技术效果：
31.上述技术方案首次报道一株耐盐的产蛋白酶、解钾的萎缩芽孢杆菌，经营养液培养和土培试验证明，其可显著促进玉米生长，特别是在含盐环境中，因此具有良好的实际应用之价值。
附图说明
32.构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示
意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。
33.图1为本发明实施例1中萎缩芽孢杆菌的镜检图。
34.图2为本发明实施例1中萎缩芽孢杆菌的lb平板菌落图。
35.图3为本发明实施例2中萎缩芽孢杆菌营养液培养试验促生效果图。
36.图4为本发明实施例3中萎缩芽孢杆菌产蛋白酶能力图。
37.图5为本发明实施例3中萎缩芽孢杆菌的解钾能力图。
38.图6为本发明实施例4中萎缩芽孢杆菌的盆栽试验28天不同处理的效果图。
具体实施方式
39.应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本发明使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
40.需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明申请的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
41.本发明的一个典型具体实施方式中，提供一株萎缩芽孢杆菌(bacillus atrophaeus)cny01，该菌株已于2021年7月9日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，其生物保藏号为cgmcc no.22866。
42.所述萎缩芽孢杆菌cny01的菌落及菌体特征如下：在lb培养基上培养24h后，菌落呈现近圆形，表面扁平干燥，边缘不规则，乳白色，不透明。菌体呈杆状，产芽孢，革兰氏阳性。
43.所述萎缩芽孢杆菌cny01的生理生化特征为：无氧化酶活性，呈阴性；可将硝酸盐还原呈亚硝酸盐，呈阳性；有乙酰甲基甲醇产生，v
‑
p呈阳性；吲哚产生呈阴性；可利用甘露醇，呈阳性；不可利用木糖，呈阴性；可利用纤维二糖，呈阳性；不可利用阿拉伯糖，呈阴性；可利用山梨醇，呈阳性；可利用麦芽糖，呈阳性；不可利用乳糖，呈阴性；可利用葡萄糖，呈阳性。
44.本发明的又一具体实施方式中，提供上述萎缩芽孢杆菌cny01的发酵方法，所述发酵方法包括：将所述萎缩芽孢杆菌cny01接种至发酵培养基中进行发酵培养即得。
45.发酵培养条件具体为：在30～40℃(优选为37℃)培养15～30h(优选为16h)，转速：150
‑
200rpm(优选为180rpm)。
46.其中，所述发酵培养基不做具体限定，可以采用常规细菌培养基，如lb培养基。
47.本发明的又一具体实施方式中，所述lb培养基配方：酵母浸膏，0.5％，蛋白胨，1％，氯化钠，1％，蒸馏水，1000ml，121℃灭菌20min，ph7.0。
48.本发明的又一具体实施方式中，提供一种微生物菌剂，其含有所述萎缩芽孢杆菌cny01或其发酵物或其代谢产物。
49.术语“发酵物”用于指代发酵产品。相应的发酵物可以是从发酵培养萎缩芽孢杆菌cny01的过程获得的液体，因此，也可称为发酵液；液体可以含有细菌(菌体)，但并不必然需
要含有细菌。液体优选的含有由本发明的萎缩芽孢杆菌cny01产生的代谢产物。
50.以及，在本发明的实施方式中，包含菌体的发酵液或培养液经离心、过滤、沉降或所属领域中已知的其他手段将在发酵液或培养液中生长的菌体细胞与液体分离，去除菌体细胞时所剩余的液体为“上清液”，并且在本发明中，上清液内含有萎缩芽孢杆菌cny01的胞外代谢产物。在本发明的实施方式中，所述菌剂也可以包含该上清液。
51.以及，在本发明的实施方式中，包含菌体的发酵液或培养液经离心、过滤、沉降或所属领域中已知的其他手段将在发酵液或培养液中生长的菌体细胞与液体分离获取菌体，菌体可进行破碎获取菌体破碎物，破碎方式可以为超声(比如冰浴超声破碎细胞)或者本领域已知的其他手段，或者，更进一步的，对该菌体破碎物离心收集上清液，该上清液记为无细胞提取物，并且在本发明中，该菌体破碎物或无细胞提取物内含有萎缩芽孢杆菌cny01的胞内代谢产物。在本发明的实施方式中，所述菌剂也可以包含该菌体破碎物或无细胞提取物。
52.以及，在本发明的实施方式中，为方便存储、运输，提高菌株存活率等，所述菌剂也可以是固体，进一步优选为冻干粉剂。即针对上述萎缩芽孢杆菌cny01或其发酵物或其代谢产物进一步进行冷冻干燥获得，所述冷冻干燥技术(包括真空冷冻干燥技术)可采用常规方法进行，在此不再赘述。
53.本发明的又一具体实施方式中，提供一种微生物菌肥，所述微生物菌肥其活性成分包括上述萎缩芽孢杆菌cny01、上述萎缩芽孢杆菌cny01的发酵物、上述萎缩芽孢杆菌cny01的代谢产物和/或上述微生物菌剂。
54.本发明的又一具体实施方式中，所述微生物菌肥还含有有机质、全钾、全氮，用于提供养分。
55.本发明的又一具体实施方式中，提供上述萎缩芽孢杆菌cny01或其发酵物或其代谢产物、微生物菌剂和/或微生物菌肥在如下a)
‑
d)中全部或部分中的应用也是本发明保护的范围：
56.a)在产蛋白酶中的应用；
57.b)在解钾中的应用；
58.c)在改善植物根际土壤营养情况中的应用；
59.d)在促进植物生长中的应用。
60.上述应用中，所述植物可为下述任一种植物：
61.p1)种子植物；
62.p2)单子叶植物；
63.p3)禾本科植物；
64.p4)玉米。
65.本发明的又一具体实施方式中，提供一种促进植物生长的方法，所述方法包括向植株生长环境中施加上述萎缩芽孢杆菌cny01、上述萎缩芽孢杆菌cny01的发酵物、上述萎缩芽孢杆菌cny01的代谢产物、上述微生物菌剂和/或上述微生物菌肥。
66.本发明的又一具体实施方式中，上述方法中，所述植物可为下述任一种植物：
67.p1)种子植物；
68.p2)单子叶植物；
69.p3)禾本科植物；
70.p4)玉米。
71.本发明的又一具体实施方式中，上述方法中，所述植物生长环境可以包括任何可适于植物生长的环境，如土壤环境、水环境、植物营养液环境等。更优选的，所述植物生长环境为含盐环境。经试验证明，其在含盐的玉米生长环境(营养液和土壤环境)中，施用本技术菌株后能够显著促进玉米植株生长，表现为显著促进玉米株高、生理株高及茎粗作用。
72.以下通过实施例对本发明做进一步解释说明，但不构成对本发明的限制。应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
73.实施例1菌株鉴定
74.筛选获得的一株耐盐菌，其在15％的nacl培养基中仍能良好生长，经16s rdna以及生理生化指标鉴定，确定该菌株为萎缩芽孢杆菌(bacillus atrophaeus)。如图1和2所示，所述萎缩芽孢杆菌(bacillus atrophaeus)cny01的菌落及菌体特征为：在lb培养基上培养后观察，菌落呈现近圆形，表面扁平干燥，边缘不规则，乳白色，不透明。菌体呈杆状，产芽孢，革兰氏阳性。
75.所述萎缩芽孢杆菌(bacillus atrophaeus)cny01的生理生化特征为：菌株cny01无氧化酶活性，呈阴性；可将硝酸盐还原呈亚硝酸盐，呈阳性；有乙酰甲基甲醇产生，v
‑
p呈阳性；吲哚产生呈阴性；可利用甘露醇，呈阳性；不可利用木糖，呈阴性；可利用纤维二糖，呈阳性；不可利用阿拉伯糖，呈阴性；可利用山梨醇，呈阳性；可利用麦芽糖，呈阳性；不可利用乳糖，呈阴性；可利用葡萄糖，呈阳性。
76.所述萎缩芽孢杆菌(bacillus atrophaeus)cny01的16s rdna序列如下：cggcggctggctccataaaggttacctcaccgactttcgggtgttacaaactctcgtggtgtgacgggcggtgtgtacaaggcccgggaacgtattcaccgcggcatgctgatccgcgattactagcgattccagcttcacgcagtcgagttgcagactgcgatccgaactgagaacagatttgtgggattggcttaacctcgcggtctcgctgccctttgttctgtccattgtagcacgtgtgtagcccaggtcataaggggcatgatgatttgacgtcatccccaccttcctccggtttgtcaccggcagtcaccttagagtgcccaactgaatgctggcaactaagatcaagggttgcgctcgttgcgggacttaacccaacatctcacgacacgagctgacgacaaccatgcaccacctgtcactctgcccccgaaggggaagccctatctctaggggtgtcagaggatgtcaagacctggtaaggttcttcgcgttgcttcgaattaaaccacatgctccaccgcttgtgcgggcccccgtcaattcctttgagtttcagtcttgcgaccgtactccccaggcggagtgcttaatgcgttagctgcagcactaaggggcggaaaccccctaacacttagcactcatcgtttacggcgtggactaccagggtatctaatcctgttcgctccccacgctttcgctcctcagcgtcagttacagaccagagagtcgccttcgccactggtgttcctccacatctctacgcatttcaccgctacacgtggaattccactctcctcttctgcactcaagttccccagtttccaatgaccctccccggttgagccgggggctttcacatcagacttaagaaaccgcctgcgagccctttacgcccaataattccggacaacgcttgccacctacgtattaccgcggctgctggcacgtagttagccgtggctttctggttaggtaccgtcaaggtgccgccctatttgaacggcacttgttcttccctaacaacagagctttacgatccgaaaaccttcatcactcacgcggcgttgctccgtcagactttcgtccattgcggaagattccctactgctgcctcccgtaggagtctgggccgtgtctcagtcccagtgtggccgatcaccctctcaggtcggctacgcatcgttgccttggtgagccattacctcaccaactagctaatgcgccgcgggtccatctgtaagtggtagccgaagccaccttttatgtttgaaccatgcggttcaaacaagcatccggtattagccccggtttcccggagttatcccagtcttacaggcaggttacccacgtgttactcacccgtccgccgctaacatcagggagcaagctcccatctgtccgctcgacttgcatgtattaggcacgccgccagcgttcgtcct
gagccaggtattcaaactctta(seq id no.1)。
77.生物保藏说明：
78.菌株cny01，分类命名：萎缩芽孢杆菌(bacillus atrophaeus)，该菌株已于2021年7月9日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，其生物保藏号为cgmcc no.22866。
79.实施例2萎缩芽孢杆菌(bacillus atrophaeus)cny01对玉米的营养液培养促生试验
80.菌液的制备方法：将斜面保存的菌种转接到装有5ml lb液体培养基的试管中，放在恒温摇床中培养12h(温度：37℃，转速：180rpm)；将活化好的菌液按1％接种量接入到50ml lb液体培养基中，放入摇床培养16h，(温度：37℃，转速：180rpm)，制成菌液。
81.其中，lb液体培养基：酵母浸膏，0.5％，蛋白胨，1％，氯化钠，1％，蒸馏水，1000ml。121℃灭菌20min，ph7.0。
82.使用75％酒精浸泡郑单958玉米种子5min，充分震荡容器，使得酒精去掉玉米种子外层的包衣。在倒掉75％酒精后，使用1％次氯酸钠浸泡玉米种子10min，充分震荡容器，最后用无菌水清洗玉米种子，每次清洗1min，直至容器内加入的无菌水无明显颜色，将无菌水倒掉，留玉米种子备用。分别设置无菌无nacl、有菌无nacl、无菌有100mm nacl、有菌有100mm nacl四组不同的处理，根据实验要求设定，使部分玉米种子在106cfu/ml的菌液中蘸菌，放置在灭菌的培养基中备用。光照培养箱的光照条件：16h、25℃、光照强度60％；黑暗条件：8h、25℃、光照强度0。在测定玉米促生作用时，将玉米粒放置在牛皮纸上，按照提前画好线的位置上依次排开，近胚端靠近牛皮纸，胚根位置在下，胚乳位置在上，用牛皮纸将玉米种子包裹起来，用细绳系好，防止玉米种子从牛皮纸中脱落。使得玉米种子均匀分布，将牛皮纸卷放置于装有营养液的透明培养瓶中，盖好盖子，避免其他菌株的干扰，置于光照培养箱中进行培养。在第5天时，打开瓶盖，第8天对玉米的株高(选取玉米植株的最长叶长)、根长(选取主根长)以及鲜重(去掉玉米粒后，进行称量)进行测量。
83.如图3所示，在第8天时，在玉米株高上，与无菌无nacl组相比，有菌无nacl组增加3.03％，无菌有nacl组及有菌有nacl组分别减少了55.07％和37.64％(均达到极显著差异，p<0.01)。在玉米根长方面，与无菌无nacl组相比，有菌无nacl组增加12.11％，无菌有nacl组及有菌有nacl组分别减少了60.09％(达到极显著差异，p<0.01)和50.62％(达到显著差异，p<0.05)。在玉米总鲜重方面，与无菌无nacl组相比，有菌无nacl组增加16.89％，无菌有nacl组及有菌有nacl组分别减少了38.4％(达到极显著差异，p<0.01)和21.04％(达到显著差异，p<0.05)。在有nacl条件下，添加菌株cny01的玉米株高、根长、鲜重分别提高了38.80％(达到极显著差异，p<0.01)、23.73％和28.19％(达到极显著差异，p<0.01)。根据第8天测得数据分析可得：无论是在无nacl条件下，还是在有nacl的条件下，菌株cny01都显示出对玉米的促生效果。
84.实施例3菌株cny01产蛋白酶、解钾试验
85.检测萎缩芽孢杆菌(bacillus atrophaeus)cny01产蛋白酶、解钾能力，结果如图4以及图5所示。试验结果表明筛选获得的菌株cny01具有产生蛋白酶和解钾等作用。
86.实施例4菌株cny01盆栽试验
87.本实施例中设置四个组即：不添加菌也不添加nacl，加入无菌水的处理组；添加菌
但不添加nacl的处理组；不添加菌但添加100mm nacl的处理组；添加菌也添加100mm nacl的处理组。通过该试验可比较在不同nacl条件下施加菌剂对玉米幼苗生长的影响。选取均匀大小、已消毒的玉米种子进行种植，待到两片叶时进行间苗，在间苗两天后进行nacl处理，设置两个处理组：一组用200ml已配置好的浓度为100mm的nacl溶液浇灌土壤，另一组用等量的自来水进行浇灌。在nacl处理两天后进行200ml 106cfu/ml菌液处理玉米植株，并测定记录起始数据。试验期间每隔7天测量其株高、生理株高(作物拉直后所具有的最大距离)及茎粗，28天收苗并测量其农艺性状数据(包括地上干鲜重、地下干鲜重)。
88.施加菌株cny01后，每隔7天对株高、生理株高及茎粗进行测定，在玉米幼苗生长到28天时再测定地上干鲜重、地下干鲜重等数据。由图6可知，不同nacl处理条件下对不同时期植株株高、生理株高及茎粗的影响。在无盐条件下，菌株cny01对玉米株高、生理株高及茎粗从第21天开始表现出抑制作用；而在有盐条件下，菌株cny01对玉米表现出促生效果，在株高方面，第7、14、21、28天有菌组比无菌组分别增加了13.55％、14.13％、15.51％及10.84％(达到显著差异，p<0.05)；在生理株高方面，第7、14、21、28天有菌组比无菌组分别增加了7.72％、10.56％、11.63％及10.47％(达到显著差异，p<0.05)；在茎粗方面，第7天有促进作用，在第14、21、28天有菌组比无菌组增加了12.95％、4.71％及7.56％(达到显著差异，p<0.05)。
89.最后应该说明的是，以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。上述虽然对本发明的具体实施方式进行了描述，但并非对本发明保护范围的限制，所属领域技术人员应该明白，在本发明的技术方案的基础上，本领域技术人员不需要付出创造性劳动即可做出的各种修改或变形仍在本发明的保护范围以内。